Name: Anwendung eines In-vitro- DNA-Schutz-Assay, um Stress Mediation Eigenschaften des DPS-Protein Visualisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Lernen Sie den In-vitro-DNA-Schutz-Assay mit Dps-Protein aus E. coli kennen. Diese Methode visualisiert den Schutz vor oxidativer DNA-Schädigung durch Hydroxylradikale mittels Elektrophorese.

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Wir sind dankbar, dass Michela de Martino, Wilfred R. Hagen und Kourosh Honarmand Ebrahimi für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung von der Delft University of Technology unterstützt.

1. Dps Expression und Reinigung Beziehen Protein von hoher Reinheit ist ein wichtiger erster Schritt für die DNA-Schutz-Assay. Reinigung von Dps Protein kann in 4 bis 5 Tagen durchgeführt werden. <ol><li> Verwandeln Sie ein Protease-defizienten Stamm von E. coli (wie BL21 (DE3) pLysS) mit einem pET-Vektor (wie pET17), in die der dps-Protein-kodierende Sequenz kloniert wurde. </li><li> Streak die umgewandelten Zellen auf Luria Broth (LB)-Agarplatten, die entsprechenden Antibiotika (zB Ampicillin und Chloramphenicol für die Beispiele in 1,1 gestellt). Die Inkubation über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Impfen einer einzelnen Kolonie von der Platte in 30 ml LB-Medium mit geeigneten Antibiotika. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 200-250 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Impfen 2 x 1 L LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika mit je 10 ml der Übernacht-Kultur. Wachsen bei 37 ° C, unter Schütteln, bis OD 600 </sub&gt; von ca. 0,6. (Wachsende Zellen zu höheren OD erhöht Ausbeute an Protein, ohne merklich zu beeinträchtigen die Reinheit des Endprodukts.) Induzieren die Expression von Dps durch Zugabe von IPTG bis zu einer Konzentration von 0,3 mM und Inkubation bei 37 ° C für 3-4 Stunden unter Schütteln. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 xg für 15 min. Resuspendieren der Zellpellets in 7,5 ml DEAE-Puffer A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) pro Liter der induzierten Zellkulturen. Die Proben können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C, wenn gewünscht. Das Verfahren kann dann durch Auftauen der Proben in einem Wasserbad bei 4 ° C fortgesetzt </li><li> In ein Gemisch von Protease-Inhibitoren (z. B. Calbiochem Satz III Proteaseinhibitoren bei 0.167 ul pro ml Zellsuspension) zu der Zellsuspension, um den Abbau von überexprimierten DPS verhindern. </li><li> Bereiten zellfreien Extrakt mit einem Französisch Presse. Prime die Französisch Presse mit 20 ml DEAE-Puffer A (bei Verwendung eines Durchfluss-Modell), dann DISRUPt die Probe zweimal bei 20 kpsi. Zentrifuge das Lysat bei 30.000 g für 35 min bei 4 ° C bis unlösliche Partikel zu klären, und speichern Sie den Überstand. Der Überstand kann dann mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C, wenn gewünscht. </li><li> Äquilibrieren eine 30 ml DEAE-Sepharose CL-6B-Säule mit DEAE-Puffer A, unter Verwendung eines FPLC. Laufpuffer durch die Säule mit 1-2 ml / min bei einem maximalen Druck von 0,2 MPa über Hintergrund. Laden Sie die zellfreien Extrakt auf die Säule, und beginnen, die Flow-Through, sobald die OD 280-Signal beginnt oberhalb der Grundlinie erhöhen zu sammeln. Waschen Sie die Säule mit DEAE Buffer A, bis die OD 280-Wert auf den Ausgangswert zurück, während kontinuierlich Sammeln der Durchströmung. Der Durchfluss sollte die Mehrheit der DPS-Protein, frei von gebundenen DNA. Die Säule wird mit 100% Puffer B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA). Dieses Eluat enthält DPS-DNA-Komplexe sowie andere Proteine ​​codieren und kann verworfen werden. </li><li> Ad entfernenzusätzliche verunreinigenden Proteine ​​durch Ammoniumsulfat-Fällung. Bestimmen Sie das Volumen von gepoolten Durchströmung. Langsam (über einen Zeitraum von 10-20 min) hinzufügen trockenen kleinen Korn Ammoniumsulfat auf 62% Sättigung (390 mg pro ml Lösung) bei 4 ° C unter Rühren gut. Die Mischung wird für weitere 20-30 min nach der Zugabe der letzten Portion von Ammoniumsulfat, um eine vollständige Gleichgewichtseinstellung zu gewährleisten. Dps bleibt löslich, während verunreinigenden Proteine ​​ausfallen wird der Lösung. </li><li> Entfernen gefällten Proteine ​​durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C und speichern Sie den Überstand. </li><li> Langsam fügen Sie eine zusätzliche 227 mg Ammoniumsulfat pro ml Überstand auf 94% Sättigung zu erreichen und rühren für 20-30 min, um eine vollständige Gleichgewichtseinstellung zu gewährleisten. DPS fällt bei dieser hohen Salzkonzentration und durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C gesammelt Die EP werden im Pellet sein, der Überstand verworfen werden können. Das Pellet kann bei -80 ° C gelagert werden, wenn desired. </li><li> Resuspendieren der DPS-Pellet in Resuspensionspuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Stellen Sie die Probenmenge zu 2,5 ml. </li><li> Pufferaustausch die Ammoniumsulfat unter Verwendung einer PD-10 Gelfiltrationssäule zu entfernen. Equilibrieren das Gel Bett mit 25 ml Resuspensionspuffer. Übernehmen Sie die 2,5 ml Dps Probe auf die Spitze des PD-10-Säule und lassen Sie ihn einweichen in. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Sammle Dps durch Elution mit 3,5 ml Resuspensionspuffer. </li><li> Zentrifugieren Pufferaustausch Probe bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C, um alle unlöslichen Bestandteile zu entfernen, und verdünnen mit 6-10 ml Verdünnungspuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), um sicherzustellen, dass die Salzkonzentration niedrig genug für die EP, der SP-Sepharose-Säule gebunden. Besonders konzentrierte Proben der EP kann es weniger löslich bei Verdünnung in einer niedrigeren Salzpuffer, wie Trübung der Flüssigkeit nachgewiesen, sondern kann vollständig durch die Zugabe einer kleinen amou Lösung gebracht werdennt von 5 M NaCl-Lösung (eine zusätzliche 10-20 mm). </li><li> Äquilibrieren einer 30 ml SP-Sepharose Fast Flow-Säule mit SP Puffer A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Führen Puffer durch die Säule mit 1,5-2 ml / min mit einem Druck von 0,3 MPa über Hintergrund. Legen Sie die Probe auf die Säule. Waschen mit Puffer A SP, bis die OD 280 Spuren auf den Ausgangswert zurück, und entsorgen Sie die Durchströmung. Führen Sie einen 150 ml linearen Gradienten von 0 bis 100% Puffer B, beim Sammeln von 2 ml Fraktionen. Die EP werden in einem scharfen Peak bei etwa 50% B eluieren, obwohl Variation von 10% ist möglich. </li><li> Führen Sie die Elutionsfraktionen auf einem 15% SDS-PAGE-Gel, und überprüfen Sie die DNA-Kontaminationen durch Messung der OD 260 / OD 280 Verhältnis mit einem Spektralphotometer. Das Gel sollte nur zeigen, ein Band um 19 kDa und die OD 260 / OD 280 ist in der Regel etwa 0,7. Schwimmbad Das reinste Dps Fraktionen. Verwenden Sie einen Zentrifugalfiltereinheit (wie der Amicon Ultra-Filtration Unit) mit einem10K Molekulargewicht cut-off zu konzentrieren der DPS und tauschen sie in einen Pufferspeicher (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl). Aliquot die gereinigten Dps und Einfrieren in flüssigem Stickstoff für die Lagerung bei -80 ° C. </li></ol> 2. DNA-Schutz-Assay Der Test umfasst mehrere zeitkritische Schritte und sollte mit dem zweiten zeitgesteuert werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Viele Zutaten und Pipettierschritten beteiligt sind, so dass ein Pipettieren (siehe Tabelle 1) ist es ratsam, den Überblick über die Schritte und Volumen zu halten. Die Gesamtzeit für den Assay benötigt wird, nicht mehr als 3 Stunden. <ol><li> Messen 30 ml Wasser in einem luftdichten Gefäß, die Wasserleitung mit N 2 für 10 min (mit zwei Injektionsnadeln, ein in der Flüssigkeit, eine darüber), um Sauerstoff aus der Lösung zu entfernen. In 0,0168 g FeSO 4 • 7H 2 O, um das Wasser, um eine 2 mM Stammlösung zu erhalten. Verschließen Sie die Flasche und spülen mit Stickstoff für 5 min mehr, dann mischen. Die Lösung mussklar, wenn jeder Hauch von gelb nachweisbar ist, bereiten eine neue Eisen Lösung. </li><li> Machen Sie eine 100 mM H 2 O 2-Lösung (10.87 ul 9.2MH 2 O 2 in 1 ml Wasser), auf Eis zu halten und vor Licht geschützt durch das Einwickeln in Aluminiumfolie. Verwenden Sie nur für etwa 1-2 Stunden nach der Herstellung durch spontanen Zerfall. Das Wasserstoffperoxid Lager ist ähnlich störanfällig, die teilweise durch die richtige Lagerung (im Dunkeln bei 4 ° C) kann verbessert werden. Regelmäßige Kontrollen des Bestands Konzentration durch Messung der OD 240 werden empfohlen. </li><li> Tauwetter ein Aliquot des gereinigten Dps schnell in einer Raumtemperatur Wasserbad, und halten auf dem Eis. Zentrifuge für 10 sec bei 4.000 xg in einer Tischplatte picocentrifuge auszufallen Aggregate. Messen Konzentration nach Zentrifugation mit einem Spektralphotometer (OD 280 = 1.547 zeigt eine Konzentration von 100 pM Monomer DBS). </li><li> Verdünnen lineare DNA von hoher Konzentration Lager mit 12x Reaktionspuffer (1M MOPS-KOH, pH 7,0, 1 M NaCl) zu einer Konzentration von 100 ng / ul. Lineare DNA wird verwendet, um die Quantifizierung zu erleichtern, aber Plasmid-DNA kann ebenso verwendet werden. </li><li> Je 1 ul der DNA-Puffer-Gemisches in ein PCR-Röhrchen. Fügen Sie genug Wasser in der Reaktion, so dass die Endreaktionsvolumen (minus SDS) werden 12 ul sein. Dieser Betrag sollte im Voraus mit dem Pipettieren Tabelle berechnet werden. In Dps zu einer endgültigen Dodecamer Konzentration von 3 um. Inkubation: 15 min bei Raumtemperatur zu ermöglichen DPS DNA binden. </li><li> Fügen Sie genug 2 mM FeSO 4-Lösung, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Ein typisches Experiment verwendet einen Konzentrationsbereich von 0 bis 1 mM FeSO 4. Höhere Konzentrationen führen umfangreichere DNA-Abbau, sondern kann auch zur Bildung von Eisen-III-Ausscheidungen in der Reaktionsmischung führen. Schnelles Hinzufügen von 1 ul der 100 mM H 2 O 2-Lösung (10 mM Endkonzentration) und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min, damit der Fenton-Vermittelten Abbau Reaktion stattfindet. </li><li> In 0,8 ul 20% SDS (Natriumdodecylsulfat). Mischen und Inkubation bei 85 ° C für 5 min auf der DPS-DNA-Komplexe zu stören. Die SDS destabilisiert die Dps-DNA-Komplex und verhindert unerwünschte Verschiebungen Gel für die DNA, die die Leichtigkeit der Quantifizierung verbessert. Ein optionaler Schritt ist die Reaktion durch katalytische Abbau des Wasserstoffperoxids in nicht-toxische Produkte auf. Für die Bedingungen in diesem Protokoll beschrieben, ist dieser Schritt nicht notwendig, um ein breites Spektrum von DNA-Abbau erhalten. </li><li> Inkubation auf Eis für 1 min, fügen Laden Farbstoff und laden auf einem Agarosegel. Führen Sie das Gel und Fleck für die DNA mit Ethidiumbromid. Das Gel sollte gebeizt post-Elektrophorese, anstatt vor der Elektrophorese, die SDS von störenden mit dem Ethidiumbromid Verteilung im Gel zu verhindern. </li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Das Reinigungsverfahren Dps wie in diesem Artikel beschrieben wird, ist sehr robust. Reinheit ist durchweg hoch (&gt; 99%); keine anderen Proteine ​​scheinen auf SDS-PAGE-Gelen als sichtbare Banden. Trotzdem scheinen einige Chargen von gereinigtem DPS Nukleaseaktivität haben, wie durch partielle DNA-Abbau nachgewiesen, wenn mit sehr hohen Konzentrationen von Dps inkubiert. Dies könnte darauf hindeuten, das Vorhandensein von hochaktiven DNasen bei niedriger Konzentration, dass wir nicht durch Reinigung zu entfernen waren...

Aeroben Organismen müssen ständig mit reaktiven Sauerstoffspezies, die ihre DNA sowie andere wichtige biologische Makromoleküle beschädigen kämpfen. Ein starkes Werkzeug, um die toxischen Effekte von oxidativen Schäden entgegenzuwirken ist die DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS). Seit seiner Entdeckung im Jahre 1992 von ausgehungerten E. coli-Kultur 1 hat Dps in mehr als 300 Arten von Bakterien und Archaebakterien 2 identifiziert worden. Massiver Hochregulation von Dps während der stationären Phase macht es am meisten hochexprimierten nucleoid-assoziiertes Protein von E. coli unter Hunger Bedingungen 3, 4. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Dps sowohl bakterielle Lebensfähigkeit und DNA Integrität während vielen verschiedenen Belastungen, einschließlich Hunger, hohe Eisenkonzentration, UV-Licht Exposition, Hitzeschock, oxidativer Stress und 5, 6 zu bewahren. Strukturell Dps Selbst-Mitarbeiter in eine stabile homooligomeren Komplex von 12 Monomere, werden in einem kugelförmigen hohlen Schale montieren. Das ~ 4,5 nm breiten inneren Hohlraum zugänglich an der Außenseite Lösungsmittel über Poren, die den Durchtritt von kleinen Molekülen 7 zu ermöglichen, und es kann mineralisierten Metallen wie Eisen 8 binden. Die schützende Wirkung von Dps leitet sich von seinen verschiedenen biochemischen Aktivitäten, die nicht-spezifische DNA-Bindung 1, Ferroxidaseaktivität und Speicherung von Eisen 8 gehören. Detaillierte Studie der positiven biochemischen Aktivitäten von Dps erfordert zunächst seine Reinigung. Dps Reinigung ist eine aufwendige Prozedur, wie Dps nicht nur von anderen Proteinen getrennt werden müssen, sondern auch von jedem gebundenen DNA 7. Unsere optimierten Reinigungsprozess verwendet viele gängige Techniken, bestehend aus zwei Ionenaustausch-Säulen und einem Ammoniumsulfatfällung Schritt. Mehrere Puffer Börsen sind erforderlich, da hochkonzentriert Dps ausfallen können von Lösung in salzarme Bedingungen. Sobald Dps Protein wurde gereinigtKann es zu Assays, die direkt zu messen sein Ferroxidaseaktivität 8, DNA-Bindungsstöchiometrie 9 und Mechanismen Eisenbindungskapazität 10 aufgebracht werden. Gereinigt Dps hat auch andere Einsatzmöglichkeiten. Die stabile Hohlkugelstruktur von Dps als Gerüst wurde für die Speicherung von hydrophoben Teilchen im Inneren des Proteins Hohlraum 11 verwendet und sogar als eine Reaktionskammer zu synthetisieren neuartige magnetische Nanopartikel 12. Die Schutzfähigkeit von Dps um Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies vermitteln kann klar und direkt nachgewiesen mit Hilfe der DNA-Schutz-Assay 13, 14. In diesem in vitro-Verfahren werden Radikale erzeugt, wenn Eisen katalysiert H 2 O 2 Zersetzung durch Fenton Chemie. Diese Reste direkt schädigen DNA in der Reaktion und vollständig abzubauen es bei hohen Konzentrationen. Zwei wichtige Dps Aktivitäten können sowohl direkt den Effekten entgegenzuwirken, von Fenton-vermittelten radikalischen Produktion. DPS senkt die Konzentration an katalytischem Eisen durch Mineralisierung und verbraucht den verfügbaren Wasserstoffperoxid in den Prozess. Darüber hinaus kann die Bindung an DNA DPS potentiell abschirmen physisch von Radikalen und kondensiert sie in ein kleineres Volumen mit weniger reaktiven Oberfläche. Die Kombination dieser beiden Eigenschaften macht den DNA-Schutz-Assay auch für den Zweck der Messung schützende Dps Aktivität geeignet. Die DNA-Schutz-Assay ist sehr vielseitig und kann für eine Vielzahl von Anwendungen über DPS Charakterisierung verwendet werden. Radikale ist eine häufige Form von Stress in Zellen, und viele verschiedene Proteine ​​und Chemikalien werden verwendet, um dem entgegenzuwirken. Das allgemeine Prinzip des Assays unter Verwendung von DNA-Integrität als Marker für Radikale, können in Kombination mit fast jedem Rest-produzierenden Reaktion oder entgegenwirkende Mittel eingesetzt werden. Unter anderem hat der Test erfolgreich verwendet, um anti-oxidativen Eigenschaften zu bestimmenvon K. paniculata Extrakt für den Einsatz in der Lebensmittelindustrie 15, um die Auswirkungen der Harnsäure auf Hydroxyl Schäden Mediation 16 charakterisieren und neue Einblicke in die Funktion des Fur Transkriptionsregulators Proteine ​​17 zu gewinnen. Trotz der zahlreichen Verwendungen des Assay in veröffentlichten Arbeiten fanden wir, dass viele Optimierung und Fehlerbehebung erforderlichen Schritte wurden, wodurch die Einrichtung der Test zum ersten Mal eine unnötig aufwendige Arbeit für viele Forscher. Das Protokoll präsentieren wir in diesem Artikel soll diese Barriere für den Eintritt zu entfernen.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3)pLysS kompetente Zellen</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>pET-17b DNA</td><td>EMD-Millipore</td><td>69663-3</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Merck</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>VWR</td><td>443824T</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail Set III</td><td>EMD-Millipore</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DFF100</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Entsalzungssäulen</td><td>GE Healthcare LS</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>SP-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1799</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Eisensulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8048</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Calbiochem</td><td>475898 SDS-Lösung</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Statischer Inkubator</td><td>Hettich</td><td>INE500</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelinkubator </td><td>New Brunswick Sc.</td><td>Inova 44</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter Avanti</td><td>J-E</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Zelldisruptor</td><td>Constant Systems Ltd.</td><td>TS2/40/AA/AA</td><td></td></tr><tr><td>FPLC Luftreiniger</td><td>General Electric</td><td>AKTA</td><td></td></tr><tr><td>Luftdichte Fläschchen</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-08918-85</td><td></td></tr><tr><td>Spritzennadeln</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Eppendorf</td><td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

anwendung eines<em&gt; in-vitro-</em&gt; dna-schutz-assay, um stress mediation eigenschaften des dps-protein visualisieren

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidativer Stress ist eine unvermeidbare Nebenerscheinung des aeroben Lebens. Molekularer Sauerstoff ist wichtig für terrestrische Stoffwechsel, aber es nimmt auch an vielen schädlichen Reaktionen im lebenden Organismen. Die Kombination von aeroben Stoffwechsels und Eisen, die eine weitere wichtige Verbindung für das Leben ist, ist genug, um Radikale durch Fenton Chemie produzieren und zelluläre Komponenten abbauen. DNA-Abbau ist wohl die schädlichen Prozess, der intrazellulären Radikale, wie DNA-Reparatur ist alles andere als trivial. Der Test in diesem Artikel vorgestellten bietet eine quantitative Methode zu messen und visualisieren die Wirkung von Molekülen und Enzymen auf radikalvermittelte DNA-Schäden. Die DNA-Schutz-Assay ist eine einfache, schnelle und stabile Werkzeug zur in-vitro-Charakterisierung der schützenden Eigenschaften von Proteinen oder Chemikalien. Es schließt ein, dass eine DNA schädigende oxidative Reaktion und Zugabe von verschiedenen Konzentrationen der Verbindung von Interesse. Die Verringerung oder Erhöhung der DNA-Schädigung in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung wird dann unter Verwendung von Gelelektrophorese sichtbar gemacht. In diesem Artikel zeigen wir die Technik der DNA-Schutz-Assay durch Messung der schützenden Eigenschaften der DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS). DPS ist eine Mini-Ferritin, das von mehr als 300 Bakterienarten verwendet wird, um kräftig zu bekämpfen Umwelt-Stressoren. Hier präsentieren wir die Dps Aufreinigungsprotokolls und die optimierten Testbedingungen für Auswertung DNA Schutz durch Dps.

Das Reinigungsverfahren für Dps beschrieben ist hier sehr reproduzierbar. DPS Reinigung nach dem beschriebenen Protokoll, mit 2 l E. coli-Kultur als Ausgangspunkt, wird in der Regel ergeben 2,5 ml Protein enthaltenden Dps 12 in Konzentrationen zwischen 5 und 12 um. Längere Zeiten Induktion (4 h) scheinen diese Variabilität zu reduzieren. Protein Reinheit durchweg über 99%, wie durch SDS-PAGE-Gelen (Abb. 1) zeigt. Der Grad der DNA-Kontaminationen werden durchweg gering, da sowohl durc...

Die DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung bakterieller Belastung. Dieser Artikel beschreibt die Reinigung von<em&gt; E. coli</em&gt; Dps und das Protokoll für eine<em&gt; In vitro</em&gt; Test demonstriert DPS-vermittelte Schutz der DNA vor Abbau durch reaktive Sauerstoffspezies.

Anwendung eines<em&gt; In-vitro-</em&gt; DNA-Schutz-Assay, um Stress Mediation Eigenschaften des DPS-Protein Visualisieren

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Schutzeffekt des DPS-Proteins in vitro zu untersuchen, indem die Verringerung der durch Radikale vermittelten DNS-Schädigung infolge der DPS-Aktivität sichtbar gemacht wird. Dies wird erreicht, indem DPS zunächst aus E. coli-Zellen gereinigt wird, wobei mehrere Ionenaustauschersäulen und Fällung mit Ammoniumsulfat zum Einsatz kommen. Als zweiter Schritt wird das gereinigte DPS zu DNS hinzugefügt, wodurch aufgrund der unspezifischen DNS-Bindungseigenschaften des Proteins ein A-D-P-S-D-N-S-Komplex gebildet werden kann. Anschließend werden Lösungen von Eisen(II) und Wasserstoffperoxid zur Reaktion gegeben, um durch Fenton-Chemie Hydroxylradikale zu erzeugen und dadurch die DNS zu schädigen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine Verringerung der DNA-Schäden aufgrund der Anwesenheit von DPS, basierend auf der Quantifizierung unbeschädigter DNA-Banden in Agarosegelen nach Elektrophorese. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten bei der Reagenzienzubereitung. Dies führt zu unerwünschten chemischen Reaktionen, wie der Bildung von Eisen(III)-Eisenpräzipitaten oder dem spontanen Zerfall von Wasserstoffperoxid.Obwohl diese Methode Einblicke in die schützende Wirkung von DPS gegenüber oxidativem Stress ermöglicht, kann sie auch zur Quantifizierung der Effekte anderer Proteine und Chemikalien auf den DNA-Abbau eingesetzt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Oxidationschemie zu beantworten, beispielsweise durch die Bestimmung der antioxidativen Eigenschaften zellulärer Extrakte für die Verwendung in der Lebensmittelindustrie. Ein wesentlicher erster Schritt für den DNA-Schutztest ist die Gewinnung von DPS-Protein hoher Reinheit.Um mit dem Verfahren zur Expression und Reinigung von DPS zu beginnen, transformieren Sie einen protease-defizienten Stamm von e coli mit einem pet-Vektor, in den die die DPS-Proteinkodierungssequenz kloniert wurde. Inokulieren Sie zwei Kolben mit je einem Liter LB-Medium, das die geeigneten Antibiotika enthält, mit jeweils 10 Milliliter einer Übernachtkultur, die aus einer einzelnen Kolonie transformierter Zellen gewachsen ist. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bis zu einem OD 600 von etwa 0,6.Wenn die Zellen die gewünschte OD erreicht haben, induzieren Sie die Expression von DPS durch Zugabe von IPTG auf eine Konzentration von 0,3 Millimolar und inkubieren bei 37 Grad Celsius für drei bis vier Stunden unter Schütteln. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 ×g für 15 Minuten. Wir suspendieren die Zellpellets in 7,5 Milliliter DEAE-Puffer pro Liter induzierter Zellkultur und geben eine Mischung aus Proteaseinhibitoren zur gepoolten Zellsuspension hinzu. Um den Abbau des überexprimierten TPS zu verhindern, bereiten Sie einen zellfreien Extrakt mit einer French-Press vor.Die French-Press mit 20 Milliliter DEAE-Puffer A und anschließend die Probe zweimal bei 20 KPSI aufbrechen; das Lysat dann 35 Minuten bei 30.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Um unlösliche Partikel zu entfernen, das Überstand aufheben und den zellfreien Extrakt auf eine 30-Milliliter-DEAE-SRO-SEAL-6B-Säule auftragen, die zuvor mit DEAE-Puffer A equilibriert wurde; beginnen Sie, den Durchlauf zu sammeln. Sobald das OD280-Signal über den Grundwert ansteigt, spülen Sie die Säule mit DEAE-Puffer A, bis der OD280-Wert wieder auf den Grundwert zurückkehrt, während Sie kontinuierlich den Durchlauf sammeln.Der Durchlauf sollte den Großteil des DPS-Proteins, frei von gebundener DNA, enthalten. Waschen Sie die Säule mit 100 % Puffer B. Dieses Eluat enthält D-P-S-D-N-A-Komplexe sowie andere Proteine und kann verworfen werden. Der nächste Schritt besteht darin, zusätzliche verunreinigende Proteine durch Fällung mit Ammoniumsulfat zu entfernen, was üblicherweise im Kühlschrank durchgeführt wird.Nach Bestimmung des Volumens des gepoolten Durchflusses langsam trockenen feinkörnigen Ammoniumsulfat unter Rühren über einen Zeitraum von 10 bis 20 Minuten bei vier Grad Celsius bis zur 62 %igen Sättigung zugeben. Ausgefallene Proteine durch Zentrifugation bei 20.000 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius gut entfernen. Das Überstand langsam aufbewahren.Fügen Sie zusätzlich 227 Milligramm Ammoniumsulfat pro Milliliter Überstand hinzu, um 94 % Sättigung zu erreichen, und rühren Sie 20 bis 30 Minuten lang um. Um eine vollständige Gleichgewichtseinstellung der TPS-Fällung bei dieser hohen Salzkonzentration sicherzustellen, sammeln Sie das DPS durch Zentrifugation bei 20.000 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das DPS-haltige Pellet in Resus-Suspensionspuffer und stellen Sie das Probenvolumen auf 2,5 Milliliter ein.Entfernen Sie das Ammoniumsulfat durch Pufferaustausch mithilfe einer PD-10-Gelfiltrationssäule, deren Gelbett mit 25 Millilitern Resus-Suspensionspuffer equilibriert wurde. Geben Sie 2,5 Milliliter der DPS-Probe auf die Oberseite der PD-10-Säule und lassen Sie sie eindringen; verwerfen Sie den Durchlauf. Sammeln Sie das DPS durch Elution mit 3,5 Millilitern Resus-Suspensionspuffer unter Zentrifugation.Die gepufferte Probe wurde bei 16.000 ×g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Um unlösliche Bestandteile zu entfernen, verdünnen Sie die Probe mit sechs bis zehn Milliliter Verdünnungspuffer, um sicherzustellen, dass die Salzkonzentration für DPS niedrig genug ist. Zum Binden an die SP SPHEROS-Säule wird die Probe auf eine 30-Milliliter-SP-Spheros-Fast-Flow-Säule aufgetragen, die zuvor mit SP-Puffer equilibriert wurde.Eine Waschung mit SP-Puffer A, bis die OD280-Spur wieder den Ausgangswert erreicht, und das Durchflussvolumen verwerfen. Einen 150-Milliliter- linearen Gradienten von 0 bis 100 % Puffer B durchführen, wobei 2-Milliliter-Fraktionen gesammelt werden. DPS eluiert in einem scharfen Peak bei etwa 50 % B, wobei eine Abweichung um 10 % möglich ist.Überprüfen Sie die Elutionsfraktionen auf DNA-Kontamination, indem Sie das Verhältnis der Extinktion bei 60 nm zur Extinktion bei 80 nm messen. Mithilfe eines Spektrophotometers sollte das Verhältnis typischerweise bei etwa 0,7 liegen, wenn die Elutionsfraktionen auf einem 15 %igen SDS-Page-Gel laufen. Im Gel sollte nur ein Band bei etwa 19 Kilodalton sichtbar sein.Vereinigen Sie die gesammelten DPS-Fraktionen nach der Konzentrierung und dem Austausch des DPS in ein Lagerpuffer. Aliquotieren Sie das gereinigte DPS mithilfe einer Zentrifugalfiltereinheit und gefrieren Sie es in flüssigem Stickstoff zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Der genetische Schutztest besteht aus mehreren Reagenzien und komplexen Pathogen-Schemata.Sorgfältige Reagenzvorbereitung und präzise Timing sind eine absolute Voraussetzung für Reproduzierbarkeit. Die Verwendung eines Pipettentisches wird empfohlen, um die Schritte und Volumina während dieses Verfahrens zu verfolgen. Geben Sie 30 Milliliter Wasser in ein dicht verschließbares Gefäß, um Sauerstoff aus der Lösung zu entfernen.Spülen Sie das Wasser 10 Minuten lang mit Stickstoff, indem Sie zwei Spritzennadeln verwenden, eine im Fluid und eine darüber. Geben Sie 0,0168 Gramm Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat zum Wasser hinzu, um eine zwei Millimolar-stammlösung zu erhalten. Verschließen Sie das Gefäß und spülen Sie weitere fünf Minuten mit Stickstoff.Dann mischen. Die Lösung muss klar sein; falls ein Anflug von Gelb erkennbar ist, bereiten Sie eine neue Eisensolution zu. Stellen Sie eine 100 Millimolar-Wasserstoffperoxidlösung her, bewahren Sie sie auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht, da eine spontane Zersetzung erfolgen kann.Verwenden Sie diese Wasserstoffperoxidlösung nur etwa eine bis zwei Stunden nach der Herstellung. Führen Sie ein Eloqua von gereinigtem DPS schnell in einem Wasserbad bei Raumtemperatur durch und zentrifugieren Sie 10 Sekunden lang bei 4.000 ×g in einer Tischzentrifuge mit Pico-Rotor auf Eis, um Aggregate nach der Zentrifugation auszufällen. Messen Sie die Konzentration mithilfe eines Spektrophotometers, verdünnen Sie anschließend lineare DNA aus einer hochkonzentrierten Stammlösung mit 12× Reaktionspuffer, um eine Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter zu erhalten, und pipettieren Sie so viel Wasser in die PCR-Röhrchen, dass das endgültige Reaktionsvolumen 12 Mikroliter beträgt.Als Nächstes stellen Sie eine Stammlösung aus DNA her, die mit DPS gemischt wird, sodass die endgültige Konzentration von DPS drei Mikromolar beträgt. Pipettieren Sie die DNA-DPS-Mischung in die PCR-Röhrchen. Kontrollr&ouml;hrchen erhalten nur DNA und werden 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bindung von DPS an die DNA zu erm&ouml;glichen. Geben Sie so viel zweimolare Eisensulfatl&ouml;sung hinzu, dass die gew&uuml;nschte Endkonzentration erreicht wird, und f&uuml;gen Sie anschlie&szlig;end schnell ein Mikroliter der 100-millimolaren Wasserstoffperoxidl&ouml;sung hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Millimolar zu erreichen. Inkubieren Sie f&uuml;nf Minuten bei Raumtemperatur.Um die Fenton-vermittelte Abbaureaktion zu ermöglichen, fügen Sie ein Mikroliter einer 20 %igen SDS-Lösung hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei 85 Grad Celsius, um die D-P-S-D-N-A-Komplexe aufzubrechen. Das SDS destabilisiert den DPS-DNA-Komplex und verhindert unerwünschte Gelverschiebungen der DNA, wodurch die Quantifizierung vereinfacht wird. Anschließend eine Minute auf Eis inkubieren, dann Ladefarbstoff hinzufügen und auf ein Agarosegel für die Elektrophorese laden. Die DNA-Färbung mit Atheriumbromid erfolgt nach der Elektrophorese statt davor. Dadurch wird verhindert, dass das SDS die Verteilung des Atheriumbromids im Gel stört.Die Zwischenschritte der DPS-Reinigung, analysiert mittels SDS-Gelelektrophorese, sind hier dargestellt. Lane eins ist der zellfreie Extrakt. Lane zwei ist der Durchlauf der DEAE SPHEROS-Säule.Lane drei ist das EIT der DEAE-Säule. Lane vier ist das Überstand der 60 %igen Ammoniumsulfat-Fällung. Lane fünf ist die DPS-Probe nach 90 %iger Ammoniumsulfat-Fällung und Pufferaustausch mittels PD-10-Säule.Die Spur sechs enthält die gepoolten reinen DPS-Fraktionen nach der SP-Sphärosäule für Protein. Die Molekulargewichtsmarker befinden sich in Spur sieben.Die Prozentangaben unterhalb jeder Spur bezeichnen die DPS-Reinheit, wie sie durch Bildquantifizierungssoftware bestimmt wurde. Der hier dargestellte Reinigungsprozess für DPS ist sehr reproduzierbar, und die Proteintreinheit liegt durchgängig über 99 %. Auf SDS-Page-Gelen erscheinen keine weiteren Proteine als sichtbare Banden. Das gereinigte DPS kann in einem DNA-Schutzassay verwendet werden, bei dem Eisen die Zersetzung von Wasserstoffperoxid über die Fenton-Chemie katalysiert und radikale Spezies erzeugt, die die in der Reaktion vorhandene DNA direkt schädigen; repräsentative Ergebnisse sind in dieser Abbildung dargestellt.Alle Gelen enthalten 100 Nanogramm lineare fünf Kilobasen lange DNA; Gelenbahn eins enthält nur DNA, und Gelenbahn zwei enthält DNA mit einem Millimolar Wasserstoffperoxid; Gelenbahn drei enthält DNA mit einem Millimolar Wasserstoffperoxid und 166 Mikromolar Eisensulfat. Doch die DNA wurde abgebaut. Die Gelenbahnen vier bis acht enthalten DNA mit drei Mikromolar DPSD-Demer, einem Millimolar Wasserstoffperoxid und von links nach rechts zunehmenden Eisenkonzentrationen.Dass DPS den Schutz der DNA vor oxidativem Abbau vermittelt, ergibt sich aus einem Vergleich zwischen den Bahnen drei und fünf. Ebenfalls erkennbar ist eine allgemeine Zunahme des DNA-Abbaus mit steigender Eisenkonzentration. Die Ergebnisse des DNA-Schutz-Assays können mithilfe von Bildverarbeitungssoftware wie image quant quantifiziert werden.Dieses Diagramm zeigt das Ergebnis dieser Quantifizierung, gemittelt über drei Assays. Die Fehlerbalken zeigen das insgesamt hohe Maß an Reproduzierbarkeit an. Sobald beherrscht.Diese Technik kann für bis zu 40 Proben innerhalb von etwa vier Stunden durchgeführt werden, wodurch die gleichzeitige Charakterisierung zahlreicher verschiedener Bedingungen ermöglicht wird. Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Reagenzien genau vorzubereiten und jeden Schritt so präzise wie möglich zu timen. Da der Assay sehr empfindlich gegenüber Inkubationszeiten ist, sollten nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür bestehen, wie man DPS-Protein in hoher Reinheit herstellt und in einem In-vitro-Assay charakterisiert, um dessen Aktivität beim Schutz der DNA vor Degradation durch reaktive Sauerstoffspezies zu bestimmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Stressresistenz ist eines der Markenzeichen für Langlebigkeit und ist bekannt, genetisch geregelt. Hier entwickelten wir eine unvoreingenommene Hochdurchsatzverfahren für Mutationen, die Stress-Resistenz verleihen in ES-Zellen, mit dem Maus-Modelle für Langlebigkeit Studien entwickeln zu screenen.

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Wir präsentieren einen strategischen Plan und ein Protokoll zur Identifizierung nicht-kodierender genetischer Varianten, die die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors (TF) beeinflussen. Es wird ein detailliertes experimentelles Protokoll für die elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay (EMSA) und den DNA-Affinitäts-Präzipitations-Assay (DAPA) der Genotyp-abhängigen TF-DNA-Bindung bereitgestellt.

Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

Das Ziel dieses Protokolls ist, die Reparatur von definierten DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmid DNA zu quantifizieren. Lesioned Plasmide sind in Säugetieren Empfängerzelle Linien und niedermolekularen Gewicht geerntet mehrere Zeit Punkte nach Transfektion transfiziert. DNA Reparatur Kinetik werden quantifiziert, gefolgt von qPCR Strang-spezifische Primer-Erweiterung verwenden.

Ein einfacher, rasches und quantitativen Assay zur Maßnahme Reparatur von DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmide transfiziert in Säugerzellen

Hier charakterisieren wir zelluläre proteotoxische Stressreaktionen in der Nematode C. elegans, indem wir die Aktivierung fluoreszierender Transkriptionsreporter messen und die Empfindlichkeit gegenüber physiologischem Stress beobachten.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Das vorliegende Protokoll zeigt eine modifizierte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) und deren posttranslationalen Modifikationen (PTMs), einschließlich Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung, die durch Topoisomerase-Inhibitoren und Formaldehyd induziert werden, wodurch die Bildung und Reparatur von DPCs und ihren PTMs untersucht werden kann.

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

MSH2-MSH6 ist verantwortlich für die Initiierung Reparatur der Replikation Fehler bei der DNA. Hier präsentieren wir eine transiente Kinetik Ansatz zum Verständnis, wie diese kritische Protein funktioniert. Der Bericht zeigt, stopped-flow Experimente zur Messung der gekoppelten DNA-Bindung und ATPase-Kinetik zugrunde liegenden MSH2-MSH6 Wirkmechanismus in der DNA-Reparatur.

Die Anwendung der Stopped-Flow-Kinetics Methoden der Wirkmechanismus eines DNA-Repair Protein Untersuchen

Lernen Sie den In-vitro-DNA-Schutz-Assay mit Dps-Protein aus E. coli kennen. Diese Methode visualisiert den Schutz vor oxidativer DNA-Schädigung durch Hydroxylradikale mittels Elektrophorese.

Anwendung eines

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