Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die mikrobielle extrazelluläre Enzymaktivität in einer Vielzahl natürlicher Umgebungen schnell zu testen. Dies wird erreicht, indem Proben von Wasser oder Bodenschlämmen zu Mikrotiterplatten hinzugefügt werden, um eine angemessene Replikation zu erzielen. In einem zweiten Schritt wird künstliches farbmetrisches oder fluormetrisches Substrat in die Mikrotiterplatten-Vertiefungen gegeben, wodurch enzymatische Reaktionen stattfinden können. Anschließend wird entweder die Absorption oder die Fluoreszenz gemessen, um die Menge des Endprodukts zu bestimmen, die während der Reaktion freigesetzt wird.

Die Ergebnisse zeigen Unterschiede in der extrazellulären Enzymaktivität zwischen Proben, die auf der Absorption oder Fluoreszenz der Endreaktion basieren. Heute zeigen wir, wie man die Aktivität extrazellulärer Enzyme in natürlichen Umgebungen messen kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen der mikrobiellen Ökologie zu beantworten, wie z. B. die Wasserraten der Verarbeitung organischer Substanz und die Nährstoffmineralisierung in Böden, Sedimenten und Gewässern. Im Allgemeinen werden Personen, die diese Methode noch nicht anwenden, Schwierigkeiten haben, Partikel von der Reaktionslösung zu trennen, insbesondere bei der Untersuchung einer großen Anzahl von Proben.

Eine visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist von entscheidender Bedeutung, da ein Plattenlayout schwer zu erlernen sein kann und Messungen in mehreren Zeitschritten dieses Verfahren erschweren können. Die metrische Analyse der extrazellulären Enzymaktivität für Böden und Sedimente beginnt mit der Herstellung von Substratpuffer und Standardlösungen, wie im Textprotokoll für Boden beschrieben, und bereitet eine Aufschlämmung jeder Probe vor, die in einem sterilen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen untersucht werden soll. Fügen Sie eine Konzentration von etwa einem Gramm pro Milliliter mit 50 Millimolaracetatpuffer für Sedimente hinzu.

Fügen Sie genügend Acetatpuffer hinzu, damit die Aufschlämmung leicht spritzt. Das genaue Volumen der benötigten Aufschlämmung hängt von der Anzahl der getesteten Enzyme ab, empfohlen werden jedoch mindestens fünf Milliliter. Wirbeln Sie jede Gülle vor, bis sich alle Erdklumpen oder Sedimente verteilt haben.

Und notieren Sie sich den letzten Band. Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitzen vor dem Pipettieren mit einer Schere ab. Da Bodenschlämme dazu neigen, die Spitzen zu verstopfen, wirbeln Sie jede Aufschlämmung wieder auf und pipettieren Sie sofort 150 Mikroliter in jede der sechs Vertiefungen.

Auf einem 96 Bohrlöcher tiefen Bohrlochblock. Es ist wichtig, gründlich und häufig zu wirbeln. Um die Bodenpartikel in Schwebe zu halten, lassen Sie mindestens zwei Vertiefungen pro Block leer, die als Substratkontrolle dienen.

Bereiten Sie 1 96 vor. Well-Block für jedes zu testende Enzym. Gießen Sie etwa fünf Milliliter Acetatpuffer in ein Pipettenreservoir und geben Sie mit einer Achtkanalpipette 150 Mikroliter des Puffers in die letzten beiden Vertiefungen jeder Probe.

Für die Kontrollen des Probenpuffers und für die beiden Substratkontrollvertiefungen. Gießen Sie etwa 10 Milliliter der entsprechenden p Nitrofenchel- oder PNP-Substratlösung in ein Pipettenreservoir und geben Sie mit einer Achtkanalpipette 150 Mikroliter der Substratlösung in die ersten vier Vertiefungen jeder Probe und in die beiden Substratkontrollvertiefungen. Notieren Sie die Zeit, zu der die Reaktion beginnt, sobald die Substratlösung hinzugefügt wird.

Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 0,5 bis vier Stunden. Die genaue Inkubationszeit hängt vom Aktivitätsniveau der Proben und dem zu testenden Enzym ab. Bereiten Sie während der Inkubation der Assays eine durchsichtige 96-Well-Mikroplatte vor.

Für jeden Vertiefungsblock zum Ablesen der Absorptionspipette werden 190 Mikroliter destilliertes Wasser und 10 Mikroliter ein molares Natriumhydroxid in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben. Natriumhydroxid verlangsamt die enzymatische Reaktion und erhöht den pH-Wert, wodurch die Farbe des PNP, das während der Reaktion nach der Inkubation freigesetzt wird, verstärkt wird. Zentrifugieren Sie die 96 Well-Blöcke fünf Minuten lang bei 2000 bis 5.000 Mal G, um Bodenpartikel zu pelletieren.

Das Entfernen der Flüssigkeit ohne Störung des Pellets kann eine Herausforderung sein. Es muss vermieden werden, zunächst zu viel Bodenprobe zu verwenden. Achten Sie darauf, lange genug zu zentrifugieren und die Flüssigkeit mit einer vorsichtigen, aber sicheren Bewegung zu entnehmen.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jeweils 100 Mikroliter zu entnehmen. Achten Sie darauf, die Pellets zu vermeiden. Übertragen Sie die Flüssigkeit in die entsprechende Vertiefung auf einer vorbereiteten, klaren 96-Well-Mikroplatte, schalten Sie den Mikroplatten-Reader ein und richten Sie nach der Bestimmung der Trockenmasse der Proben, wie im Textprotokoll beschrieben, alle erforderlichen Softwareaufzeichnungen bei 410 Nanometern ein. Berechnen Sie die endgültige Absorption jeder Probe, indem Sie die Absorption der Probenkontrolle von der Absorption des Probenassays abziehen.

Wenn Substratkontrollen eine hohe Absorption von mehr als 0,060 haben, subtrahieren Sie diese. Fahren Sie auch mit der Berechnung der Enzymaktivität in Mikromol pro Stunde pro Gramm Trockenmasse unter Verwendung dieser Gleichung fort. Nachdem Sie für jedes Enzym eine schwarze Mikroplatte nach dem im Textprotokoll gezeigten Beispiel organisiert haben, gießen Sie etwa fünf Milliliter der ersten Wasserprobe in ein Pipettenreservoir und pipettieren Sie mit einer Achtkanalpipette 200 Mikroliter in alle Vertiefungen.

Entsorgen Sie in Spalte eins der Mikroplatte die verwendeten Pipettenspitzen und wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf für jede Wasserprobe, um die Spalten eins bis neun zu füllen. Richten Sie Kontrollen ein, um Proben, Standards, Substrat und Quenching auf derselben schwarzen Mikroplatte wie die Proben zu berücksichtigen. Probenkontrollen enthalten Probenwasser und Bikarbonatpuffer und werden nicht in den Aktivitätsberechnungen verwendet, zeigen aber im Verlauf des Experiments eine konsistente Lesbarkeit.

Die Quench-Kontrollen bestehen aus Probenwasser und einer Standardmenge des Fluoreszenz-Tags und werden zur Messung der Beugung der Fluoreszenz verwendet. Im Probenwasser bestehen Substrat- und Standardkontrollen entweder aus substratgebundenem oder dem Standard-Fluoreszenz-Tag bzw. Bicarbonatpuffer. Gießen Sie etwa fünf Milliliter Fünf-Millimolar-Bicarbonat-Puffer in ein sauberes Pipettenreservoir.

Pipettieren Sie 50 Mikroliter Puffer in die Mikrotiterplatten-Vertiefungen eins bis neun in den Reihen d und e, um zwei zu bilden, replizieren Sie die Vertiefungen der Probenkontrollen pro Probe und wechseln Sie die Pipettenspitzen und übertragen Sie dann 200 Mikroliter Bikarbonatpuffer in die Vertiefungen 10 bis 12 in den Reihen A und H. Obwohl das Licht in dieser Demonstration zu Filmzwecken hell gehalten wird, Die Umgebungsbeleuchtung sollte durch Dimmen oder Ausschalten des Lichts reduziert werden, da der Leuchtstoffstandard lichtempfindlich ist. Gießen Sie etwa fünf Milliliter von 10 Mikromolaren, vier Methylmonen oder MUB in ein sauberes Pipettenreservoir, pipettieren Sie 50 Mikroliter in die Mikrotiterplatten-Vertiefungen eins bis 12 in Reihe H. Pipettieren Sie dann 50 Mikroliter in die Vertiefungen eins bis neun in den Reihen G und F, um drei Wiederholungen von Quench-Kontrollen pro Probe und insgesamt Standardkontrollen zu bilden. Stellen Sie die Mikroplatte entweder in die Dunkelheit oder decken Sie sie mit einem undurchsichtigen Deckel ab, um die Lichtverschlechterung von MUB zu reduzieren, schalten Sie das Fluorimeter ein und richten Sie die erforderliche Software so ein, dass sie vor dem Hinzufügen des Substrats abgelesen werden kann.

Für etwa fünf Milliliter des entsprechenden mit MUB ausgekleideten Substrats in ein sauberes Pipettenreservoir pipettieren Sie mit einer 12-Kanal-Pipette 50 Mikroliter in die Mikrotiterplatten-Vertiefungen eins bis 12 in Reihe A und in die Vertiefungen eins bis neun in den Reihen B und C, um drei zu bilden, replizieren Sie Assays für jede Probe und drei Substratkontrollen und fahren Sie sofort mit der Aufzeichnung der Fluoreszenz fort. Lesen Sie die anfängliche Fluoreszenz unmittelbar nach der Zugabe des Substrats zur Mikroplatte nach dem Lesen ab. Durch Fluoreszenz wird die Mikroplatte bei Raumtemperatur entweder im Dunkeln oder mit einem undurchsichtigen Deckel bedeckt inkubiert.

Um die Lichtdegradation von MUB zu reduzieren. Die Inkubationszeit, die zur Messung der maximalen potenziellen Enzymaktivität erforderlich ist, hängt von der Enzymkonzentration in einer Probe ab. Da dies nicht bekannt ist, muss eine Mikroplatte vor der Analyse der Probe in mehreren Schritten abgelesen werden.

Für die meisten Enzyme sind Intervalle von 10 bis 15 Minuten im Laufe einer Stunde angemessen, obwohl einige Proben mit hohen Konzentrationen vor 10 Minuten ihren Höhepunkt erreichen. Weiterlesen Fluoreszenz in der Mikroplatte in den vorgesehenen Abständen für mindestens eine Stunde. Achten Sie darauf, die Mikroplatte zwischen den Messungen abgedeckt oder im Dunkeln zu halten.

Berechnen Sie für jede Probe in jedem Zeitintervall die mittlere Fluoreszenz der Anfangsprobe, die mittlere Fluoreszenz der Endprobe, die mittlere Standardfluoreszenz und die mittlere Quench-Kontrollfluoreszenz für jedes Zeitintervall. Berechnen Sie die Enzymaktivität in m pro Stunde pro Milliliter. Unter Verwendung der Gleichung im Textprotokoll.

Untersuchen Sie die für jeden Zeitschritt berechneten Aktivitätswerte, und bestimmen Sie die endgültige potenzielle Aktivität aus dem Zeitschritt mit der höchsten Aktivität. Wenn die Aktivitätswerte weiter ansteigen, sind möglicherweise spätere Zeitschritte erforderlich. Wenn die Aktivitätswerte im Laufe des Laufs fallen, führen Sie den Vorgang in kürzeren Zeitschritten erneut aus.

Böden und aquatische Sedimente weisen in der Regel ein beträchtliches Maß an extrazellulärer Enzymaktivität auf, was auf das Wachstum von anhaftenden mikrobiellen Gemeinschaften auf der Oberfläche der Partikel zurückzuführen ist. Diese Abbildung zeigt, wie sich diese Aktivität in Abhängigkeit von der Größe der Partikel ändert, die aus dem Oberflächensediment eines Flusses dritter Ordnung im nördlichen Mississippi gewonnen werden. Eine frühere Studie der USAA hat gezeigt, dass die Bakteriengemeinschaften auf Sedimentpartikeln aus diesem Strom auf der Grundlage einer molekularen Analyse ihrer Gemeinschaftsstruktur in drei verschiedene Gruppen unterteilt werden können.

Die auf 0,063 Millimeter großen Partikeln, die auf 0,1, 2, 5, 0 0,25 und 0,5 Millimeter großen Partikeln und die auf einem Millimeter großen Partikeln. Die Analyse von Mustern in der extrazellulären Enzymaktivität unterstützt diese Schlussfolgerung, wobei die Phosphatase bei 0,1 2 5, 0 0,25 und 0,5 Millimeter Partikeln ähnlich ist, aber bei den Ein- und 0,063 Millimeter Fraktionen viel höher ist, wenn sie mit der PNP-Linked-Substrat-Technik gemessen wird. Andere Enzyme wie Beta-Glucco und n AGAs zeigen ähnliche Peaks auf den feinsten Partikeln, sind aber bei Ein-Millimeter-Partikeln nicht erhöht.

Dies unterstreicht die Tatsache, dass verschiedene Enzyme unterschiedliche Verteilungen in der Umwelt aufweisen können und diese mit diesem Assay aufgeklärt werden können. Die relativ niedrigen Fehlerbalken zeigen, dass cholemetrische Assays der Enzymaktivität auf Sedimenten reproduzierbar und daher für statistische Analysen zugänglich sind. Beim Vergleich verschiedener Proben und Umweltproben weisen natürliche Gewässer tendenziell eine geringere extrazelluläre Enzymaktivität pro Milliliter auf als Böden oder Sedimente pro Gramm.

Daher sollten sie die Flora metrisch unter Verwendung von MUB-verknüpften Substraten untersuchen. Diese Abbildung zeigt, wie die Aktivität der Enzyme Phosphatase, Beta, Glucco und NGAs mit der Tiefe variiert. In einem flachen See im Norden von Mississippi, USA, ist bekannt, dass der See nährstoffarm ist, was auch durch die relativ hohe Aktivität von Phosphatase und Enzymen nahegelegt wird, die Mikroorganismen produzieren, um Phosphat aus organischen Verbindungen zu gewinnen.

Bei allen drei Enzymen zeigten Proben, die an der Wasseroberfläche und in 50 Zentimeter Tiefe entnommen wurden, eine ähnliche Aktivität. Während die Aktivität in der 100-Zentimeter-Probe erhöht war, wurde die Probe im Wesentlichen von der Wassersediment-Grenzfläche entnommen, und das Vorhandensein von Sedimentpartikeln in der Probe ist wahrscheinlich für die höhere Aktivität in der Probe verantwortlich, insbesondere für Beta-Glucco und n AGAs. Wie bei den PNP-Substraten zeigen die niedrigen Fehlerbalken, dass selbst bei nur drei Replikationsmesswerten die Reproduzierbarkeit von fluormetrischen Assays mit MUB-Substraten hoch ist.

Es ist zu beachten, dass die Einheiten für die Enzymaktivität der Wasserprobe im Inland des verbrauchten Substrats angegeben sind, während die Einheiten für die Enzymaktivität an Sedimentpartikeln in Mikromol des verbrauchten Substrats angegeben werden, obwohl die Größe pro Einheit vergleichbar ist. Dies unterstreicht die Tatsache, dass Böden und Sedimente tendenziell eine viel höhere extrazelluläre Aktivität aufweisen als natürliche Gewässer. Es zeigt auch die erhöhte Empfindlichkeit der MUB-Linked-Substrate-Technik und die Notwendigkeit, diese Technik für den Assay der extrazellulären Enzymaktivität in Wasserproben zu verwenden, sobald sie beherrscht ist.

Mit dieser Technik können neun Wasserproben in etwas mehr als einer Stunde auf bis zu Enzyme untersucht werden, während dieses Verfahren auf Böden und Sedimente untersucht wird. Es ist wichtig, ein bekanntes massives Material zu verwenden, damit die Aktivität auf der Basis des Trockengewichts ausgedrückt werden kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die extrazelluläre Enzymaktivität und eine Vielzahl natürlicher Umgebungen entweder mit farbmetrischen oder niedrigeren metrischen Techniken messen können.