Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ektomische Studien durchzuführen, um Interaktionsprofile von Proteinen verschiedener Pathogenvarianten mit einem gemeinsamen Satz zellulärer Faktoren zu vergleichen. Dies wird erreicht durch Hefe-basierte Zwei-Hybrid-Screenings von cDNA, um potenzielle Interaktionspartner von Proteinen verschiedener Pathogenvarianten zu identifizieren. In einem zweiten Schritt werden die Offenen Leserahmen (ORFs) der Interaktionspartner sequenziert und in Vektoren übertragen, die für weitere Validierungen geeignet sind.

Anschließend wird ein Satz einzelner Interaktionspartner, die aus allen Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings hervorgegangen sind, ausgewählt und erneut auf ihre Wechselwirkung mit dem gesamten untersuchten Stammenspektrum getestet. Dies erfolgt mithilfe eines orthogonalen, auf Luciferase basierenden Protein-Fragment-Komplementationsassays, der in Säugerzellen durchgeführt wird, um robuste, vergleichbare Interaktionsdatensätze zu erhalten. Die Ergebnisse zeigen unterschiedliche Interaktionsintensitäten zwischen den Pathogenproteinen und den zellulären Proteinen basierend auf den gemessenen Luciferase-Signalen und liefern somit einen vergleichenden Überblick über Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen Pathogenen und Wirtszellen.

Die Verarbeitung der Interaktionsprofile durch hierarchisches Clustering korreliert spezifische Wirt-Pathogen-Interaktionen mit pathologischen Merkmalen und liefert Einblicke in die Beteiligung von Pathogenproteinen an der Pathogenese. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber anderen Methoden zur Kartierung von Protein-Protein-Interaktionen zwischen Pathogen und Wirt besteht darin, dass er strenge vergleichende Interaktionsdatensätze zwischen mehreren Stammvarianten bereitstellt. Diese Techniken liefern Einblicke in das Interaktionsnetzwerk eines Pathogenproteins, können aber auch auf andere Systeme angewandt werden, beispielsweise mithilfe vollständiger Viren und Fluss-Genetik als infektiöses Molekül. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Paarung und Ausbringung der Hefezellen, wie im schriftlichen Protokoll zum Aussäen beschrieben.

30 Milliliter selektives Dropout-Medium ohne Tryptophan mit wenigen Kolonien des AH109-Hefestamms, der mit dem P-G-B-K-T7-Plasmid transformiert wurde, das das Pathogenprotein exprimiert. 30 Stunden bei 30 Grad Celsius unter Rotation inkubieren. Anschließend 200 Milliliter selektives Dropout-Medium ohne Tryptophan mit den 30 Millilitern des AH109 ansäen.

Die Kulturen werden 20 Stunden bei 30 Grad Celsius unter Rotation inkubiert. Inkubieren Sie außerdem die cDNA-Bibliothek-transformierte Y 187 in 20 Milliliter YP-Kleber für 10 Minuten bei 30 Grad Celsius unter Rotation. Zentrifugieren Sie anschließend ein Volumen der PG BK T sieben-transformierten AH 109-Kultur, das einer äquivalenten Menge an vitalen Y 187-Hefezellen entspricht, für fünf Minuten bei 3.500 U/min und 20 Grad Celsius.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter YP-Kleber. Mischen Sie die resuspendierten AH 109 Hefezellen mit der Y 187 enthaltenden Bibliothek. Überführen Sie die Probe in ein 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 3.500 U/min und 20 Grad Celsius.

Nach sorgfältigem Abziehen der überstehenden Phase resuspendieren Sie das Pellet in YP-Kleber, um insgesamt 1,5 Milliliter zu erhalten. Verteilen Sie anschließend die Hefe auf drei YCM-Agar-Platten mit je 150 Millimetern Durchmesser, jeweils 0,5 Milliliter pro Platte, und inkubieren Sie 4,5 Stunden bei 30 Grad Celsius. Sammeln Sie die gepaarten Hefezellen von den YCM-Platten durch Abkratzen mit einem Glasrakel in 10 Milliliter selektivem Dropout-Medium ohne Leucin, Tryptophan und Histidin.

Spülen Sie die Platte zwei Mal mit je fünf Milliliter des gleichen Mediums und vereinigen Sie die Probe nach einer Zentrifugation von fünf Minuten bei 3.500 U/min und 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie das Pellet erneut. Suspendieren Sie das Hefepellet in fünf Milliliter selektivem Dropout-Medium ohne Leucin, Tryptophan und Histidin.

Verteilen Sie anschließend die gepaarten Hefezellen auf 10 Platten selektiven Dropout-Agars ohne Leucin, Tryptophan und Histamin, ergänzt mit der im Autoaktivierungstest bestimmten geeigneten Konzentration von 3-Aminotriazol oder 3-AT. Berechnen Sie die Diploid-Rate wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, nach einer Inkubation bei 30 Grad Celsius in feuchter Atmosphäre über sechs bis zehn Tage. Isolieren Sie Hefekolonien und übertragen Sie sie auf frisch hergestellte Platten mit selektivem Dropout-Agar ohne Leucin, Tryptophan und Histidin, ergänzt mit 3-AT.

Bestellen Sie die Hefe in einem Schema aus acht Reihen mit je 12 Vertiefungen, das eine 96-Loch-Platte reproduziert, damit die spätere Sequenzierung vereinfacht wird. Lassen Sie die Hefe-Kolonien vier bis fünf Tage bei 30 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre wachsen. Das Ziel dieses Abschnitts ist es, mittels PCR die in den PA ct zwei Vektoren enthaltene cDNA aus lysierten Hefe-Kolonien zu amplifizieren, die auf selektiven Dropout-Agarplatten ohne Leucin, Tryptophan und Histidin gezüchtet wurden.

Beginnen Sie damit, eine 96-Well-PCR-Platte auf Eis zu stellen, um Hefe-Zellen mit jeweils 50 µL xmal 20 T-Lösung pro Well zu lysieren. Resuspendieren Sie vorsichtig jeweils eine Kolonie pro Well. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten bei 37 °C und anschließend 15 Minuten bei 95 °C.

Nachdem die Platte wieder auf Eis gestellt wurde, 50 µL destilliertes Wasser pro Vertiefung hinzufügen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen. Anschließend zentrifugieren für fünf Minuten bei 3.500 ×g und 4 °C. Nach der Herstellung der X-Tack-Mischung gemäß der schriftlichen Anleitung 40 µL der Mischung pro Vertiefung in die 96-Loch-PCR-Platte geben. Jeweils 10 µL des lysierten Hefegewebes pro Vertiefung hinzufügen und die Amplifikation gemäß der schriftlichen Anleitung durchführen.

Führen Sie drei Mikroliter der PCR-Produkte auf einem 1,2 %igen Agarosegel laufen, um PCR-positive Klone nachzuweisen. Sequenzieren Sie die aus diesen drei positiven Klonen isolierten, PCR-amplifizierten Fragmente. Führen Sie anschließend eine Blast-Analyse durch, um zelluläre offene Leseraster zu identifizieren, und verwerfen Sie Alignments mit geringer Zuverlässigkeit sowie Sequenzen mit Frameshifts oder vorzeitigen Stoppcodons, bevor Sie die Zellen transfectieren.

Übertragen Sie die offenen Leserahmen für das Pathogen-Protein und das zelluläre Protein in ihre jeweiligen Vektoren, um Proteine zu erzeugen, die mit Fragmenten der Gaia-Luciferase fusioniert sind, wie im Textprotokoll beschrieben. Säen Sie 293T-Zellen mit 350.000 Zellen pro Milliliter DMEM mit 10 % fetalem Kälberserum ohne Antibiotikum aus. Verteilen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung in sterile weiße Kulturplatten und kultivieren Sie sie 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Transfizieren Sie die Zellen mithilfe eines geeigneten Transfektionsprotokolls; verwenden Sie 100 Nanogramm pro Vertiefung sowohl der Plasmidkonstrukte für den offenen Leserahmen des Pathogens als auch des Wirts. Transfizieren Sie 10 Nanogramm pro Vertiefung des CMV-Feuerfadenluciferase-Plasmids, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren.

Jeder Punkt wird im dreifachen Ansatz getestet, indem das Transfektionsgemisch auf die Kulturschalen mit 293T-Zellen übertragen wird. Achten Sie darauf, das DNA-Gemisch vorsichtig auf die Zellen aufzutragen, da 293T-Zellen nicht stark adhärent sind und sich leicht vom Boden der Vertiefung ablösen können. Inkubieren Sie die Zellen 24 bis 30 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Waschen Sie die Zellen mit PBS, jeweils 100 Mikroliter pro Vertiefung. Geben Sie 40 Mikroliter eines 1×-Vanilla-Lysepuffers hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Unter Rühren 10 Mikroliter Zelllysate in einer anderen weißen Platte aufbewahren, um anschließend die Menge des Feuerflächenluciferase bei vier Grad Celsius oder alternativ bei minus 20 Grad Celsius mit Deckel zu bestimmen, um die Gaia-Aktivität zu messen. Die Platte in ein Luminometer geben und 100 Mikroliter Vanille-Luciferase-Assay-Reagenz auf die Zelllysate injizieren. Anschließend die Lumineszenz 10 Sekunden lang zählen.

Die Dosierung einer 96-Well-Platte dauert etwa eine halbe Stunde. Verwenden Sie stets frische Extrakte, da das Einfrieren oder eine Langzeitlagerung die gaia-vermittelte Interaktionsaktivität in den verbleibenden 10 Mikroliter Zellextrakten beeinträchtigen könnte. Geben Sie 50 Mikroliter Firefly-Luciferase-Assay-Reagenz mithilfe eines Luminometers auf die Zelllysate und messen Sie die Lumineszenz für 10 Sekunden.

Die Dosierung einer 96-Well-Platte dauert für jede Interaktion etwa eine halbe Stunde. Berechnen Sie das Verhältnis zwischen Gaia-Luciferase-Aktivität und Feuerlysen-Luciferase-Aktivität, um einen normalisierten GAIA-Lumineszenzwert zu erhalten, unter Berücksichtigung der Transfektionseffizienz und der Zellviabilität.

Berechnen Sie den Mittelwert der Triplicate, um die Interaktion zu überwachen. Schätzen Sie ein normalisiertes Lumineszenzverhältnis (NLR) für jedes Pathogen-Wirt-Paar. Teilen Sie dazu die normalisierte GAIA-Lumineszenzaktivität, die in Gegenwart sowohl der Pathogen- als auch der Wirt-Proteine nachgewiesen wurde, durch die Summe der Aktivitäten, die in den Kontrollansätzen gemessen wurden.

Der NLR-Grenzwert für positive Wechselwirkungen wurde in einer früheren Studie auf etwa 3,5 geschätzt. Eine wesentliche Stärke des Hochdurchsatz-GIA-Prinzips, Protein-KOMPLEMENTATIONS-Assay, oder H-T-G-P-C-A liegt in seiner hohen Empfindlichkeit, wie durch die Bewertung der Rate falsch positiver und falsch negativer Ergebnisse für das HPVE-Zwei-Protein zur Bestimmung der falsch negativen Rate veranschaulicht wird. Bekannte Wechselwirkungen von E zwei aus HPV 16 wurden mittels H-T-G-P-C-A überprüft; vier von 18 Wechselwirkungen wurden nicht nachgewiesen, was einer falsch negativen Rate von 22 % entspricht.

Die falsch-positiven Wechselwirkungen wurden mit 5,8 % gemessen, unter Verwendung von 12 HPVE-Zwei-Proteinen gegenüber einer zufälligen Menge zellulärer Proteine. Die hohe Spezifität der Methode wird in dieser Abbildung verdeutlicht, die zeigt, dass eine einzige Punktmutation, die bekanntermaßen die Bindung von E zwei an seinen zellulären Partner BRD vier stört, das NLR-Verhältnis aufhebt. Dieser groß angelegte, vergleichende ektomische Ansatz wurde kürzlich erfolgreich auf drei frühe Proteine von humanen Papillomviren angewandt, nämlich E zwei, E sechs und E sieben, die aus verschiedenen Genotypen stammen und für ihre natürliche Vielfalt in Tropismen und Pathologien jeweils repräsentativ sind.

Die hierarchische Clusterung der Interaktionsprofile spiegelt weitgehend die HPV-Phylogenie wider und belegt so die Robustheit des Ansatzes sowie die Vollständigkeit der Interaktionsdatensätze. Sie kann verwendet werden, um spezifische Virus-Wirt-Interaktionsprofile mit pathologischen Merkmalen zu korrelieren und dadurch Hinweise auf die Beteiligung viraler Proteine zu erhalten. In der Pathogenese können genotypspezifische Interaktionen extrahiert werden, die möglicherweise mit Tropismus oder pathogenen Biomarkern korrespondieren.

Wie hier für E6-Interaktionspartner veranschaulicht, wurden zelluläre Zielstrukturen basierend auf der Interaktionsintensität sortiert und entsprechend des interagierenden HPV-Typs gruppiert. Diese Darstellung ermöglicht die Identifizierung spezifischer Biomarker wie fad, das ausschließlich mit den E6-Proteinen onkogener HPV-Typen interagiert. Eine solche gezielte Interaktion muss für das karzinogene Merkmal aller onkogenen HPV-Typen entscheidend sein und stellt somit einen vielversprechenden Kandidaten dar, entweder als Surrogatmarker für eine HPV-Infektion oder als therapeutisches Ziel verwendet zu werden.

Nach dieser Vorgehensweise kann die H-T-G-P-C-A angepasst werden, um sie mit einem dritten Protein zu verwenden, das als Fusionsprotein mit einem Biotin-Tag exprimiert wird. Dies ermöglicht die Anreicherung von drei Partnerkomplexen auf Streptavidin-Beschichteten Farbplatten und kann die Frage nach der Bildung großer Protein-Komplexe beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Pathogen-Wirt-Interaktionen charakterisiert. Drittens, indem man Interaktionspartner mehrerer Stammvarianten untersucht. Zweitens, indem man ihre Interaktion mit einem ganzen Satz von Pathogentypen unter Verwendung einer Protein-Protein-Wechselwirkung beispielsweise in Säugetierzellen vergleicht.