Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ektomische Studien durchzuführen, um Interaktionsprofile von Proteinen verschiedener Erregervarianten mit einem gemeinsamen Satz zellulärer Faktoren zu vergleichen. Dies wird durch paarungsbasierte Hefe erreicht, zwei hybride Screenings von CDNA zur Identifizierung potenzieller Interaktionspartner von Proteinen aus verschiedenen Erregervarianten. In einem zweiten Schritt werden die offenen Leserahmen der Interaktionspartner sequenziert und in Vektoren überführt, die für die weitere Validierung kompatibel sind.

Als nächstes wird eine Reihe von Einzelpartnern, die aus allen beiden Hybrid-Screenings hervorgegangen sind, ausgewählt und erneut auf ihre Interaktion mit der gesamten Palette der untersuchten Stämme getestet. Dies geschieht unter Verwendung eines orthogonalen gia, Luciferase-basierten Proteinfragment-Komplementationsassays, der in Säugetierzellen durchgeführt wird, um robuste vergleichende Interaktionsdatensätze zu liefern. Die Ergebnisse zeigen unterschiedliche Interaktionsintensitäten zwischen den Erregerproteinen und den zellulären Proteinen basierend auf den erhaltenen Luziferase-Messungen und geben somit einen vergleichenden Überblick über die Wechselwirkungen zwischen Erregern und Wirtsproteinen.

Die Aufbereitung der Interaktionsprofile durch hierarchisches Clustering korreliert spezifische Erregerinteraktionen des Wirts mit pathologischen Merkmalen und gibt Aufschluss über die Beteiligung von Erregerproteinen an der Pathogenese. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber anderen Methoden zur Kartierung von Proteininteraktionen zwischen Krankheitserregern und Wirtsproteinen besteht darin, dass er einen stringenten vergleichenden Interaktionsdatensatz zwischen mehreren Stammvarianten liefert. Diese Technik bietet Einblick in das Interaktionsnetzwerk eines Krankheitserregerproteins, kann aber auch auf andere Systeme als infektiöses Molekül angewendet werden, indem vollständige Viren und Flüsse verwendet werden. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Paarung und Ausbreitung der Hefezellen, wie im schriftlichen Protokoll Saatgut beschrieben.

30 Milliliter selektives Dropout-Medium ohne Tryptophan mit wenigen Kolonien des Hefestamms AH 1 0 9, transformiert mit dem Plasmid P-G-B-K-T, sieben, das das Erregerprotein exprimiert. 30 Stunden bei 30 Grad Celsius mit Rotation inkubieren. Nächster Samen, 200 Milliliter selektives Dropout-Medium minus Tryptophan mit den 30 Millilitern des AH 1 0 9.

Die Kulturen inkubieren im Wechsel für 20 Stunden bei 30 Grad Celsius. Außerdem, inkubieren Sie die CDNA-Bibliothek transformierte Y 187 in 20 Milliliter YP-Kleber für 10 Minuten bei 30 Grad Celsius mit Rotation. Dann zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 3.500 U/min und 20 Grad Celsius ein Volumen der PG BK T sieben transformierten AH 109-Kultur, das einer äquivalenten Menge lebensfähiger Y 187-Hefezellen entspricht.

Ziehen Sie vorsichtig den Überstand heraus und Resus hängen Sie den Gaumen in 10 Milliliter YP-Kleber auf. Mischen Sie die resuspendierte Hefe AH 109 mit der Y 187 enthaltenden Bibliothek. In ein 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen, bevor es fünf Minuten lang bei 3.500 U/min und 20 Grad Celsius zentrifugiert.

Nachdem Sie das Super Dat Resus vorsichtig herausgezogen haben, suspendieren Sie das Pellet in YP-Kleber, um insgesamt 1,5 Milliliter zu erhalten. Als nächstes verteilen Sie die Hefe auf drei YCM-Agar-, 150-Millimeter-Platten mit 0,5 Millilitern pro Platte und inkubieren 4,5 Stunden bei 30 Grad Celsius. Sammeln Sie die verpaarte Hefe von YCM-Platten, indem Sie mit einem Rechenglas 10 Milliliter selektives Dropout-Medium abzüglich Leucin, Tryptophan und Histidin abkratzen.

Spülen Sie die Platte zweimal mit fünf Millilitern desselben Mediums und lassen Sie sie nach der Zentrifugation fünf Minuten lang bei 3.500 U/min und 20 Grad Celsius gleiten. Überstand und Reus verwerfen. Suspendieren Sie das Hefepellet in fünf Millilitern selektivem Dropout-Medium abzüglich Leucin, Tryptophan und Histidin.

Verteilen Sie dann die verpaarte Hefe auf 10 Platten mit selektivem Dropout-Agar minus Leucin, Tryptophan und Histamin, ergänzt mit der entsprechenden Konzentration von drei Aminotriazolen oder drei at, wie im Autoaktivierungstest bestimmt. Berechnen Sie die diploide Rate, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, nachdem Sie sechs bis 10 Tage lang bei 30 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert haben. Hefekolonien pflücken und auf frisch zubereitete Platten aus selektivem Dropout-Agar minus Leucin, Tryptophan und Histidin plus drei a t geben.

Ordnen Sie die Hefe in einem Schema von acht Bahnen mit 12 Vertiefungen an, die eine 96-Well-Platte reproduzieren, damit sie später leichter sequenziert werden kann. Lassen Sie die Hefekolonien vier bis fünf Tage bei 30 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre wachsen. Das Ziel dieses Abschnitts ist die PCR, die Amplifikation des CDNA, das in der PA ct enthalten ist, zwei Vektoren von lysierten Hefekolonien, die auf selektivem Dropout-Agar minus Leucin-, Trytophan- und Histidinplatten gezüchtet wurden.

Beginnen Sie damit, eine 96-Well-PCR-Platte auf Eis zu legen, um Hefezellen mit 50 Mikrolitern pro Well xmal 20 T Lösung zu lyzieren. Suspendieren Sie vorsichtig eine Kolonie pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten bei 37 Grad Celsius und 15 Minuten bei 95 Grad Celsius.

Nachdem Sie die Platte wieder auf Eis gestellt haben, fügen Sie 50 Mikroliter destilliertes Wasser pro Well-Mischung hinzu, indem Sie auf und ab pipettieren, und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 3.500 U/min und vier Grad Celsius. Verteilen Sie nach der Zubereitung der X-Tack-Mischung, wie im Textprotokoll beschrieben, 40 Mikroliter der Mischung pro Vertiefung in der 96-Well-PCR-Platte. Fügen Sie 10 Mikroliter der lysierten Hefe pro Vertiefung hinzu und führen Sie die Amplifikation wie im Textprotokoll aufgeführt durch.

Lassen Sie drei Mikroliter der PCR-Produkte auf einem 1,2%igen Agros-Gel laufen, um PCR-positive Klone nachzuweisen. Sequenzieren Sie die PCR-amplifizierten Fragmente, die aus seinen drei positiven Klonen isoliert wurden. Führen Sie dann eine Blast-Analyse durch, um zelluläre offene Leserahmen zu identifizieren, wobei Alignments mit geringer Konfidenz sowie Frameshift- und vorzeitiger Stoppcode auf enthaltenden Sequenzen vor der Zelltransfektion verworfen werden.

Übertragen Sie das Erregerprotein und das zelluläre Protein mit offenen Leserahmen in ihre jeweiligen Vektoren, um Proteine zu erzeugen, die mit Fragmenten der Gaia-Luziferase fusioniert sind, wie im Textprotokoll beschrieben: Seed 2 9 3 T-Zellen bei 350.000 Zellen pro Milliliter DMEM mit 10% fötalem Rinderserum ohne Antibiotikum. Verteilen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung in sterilen weißen Kulturplatten, bevor Sie am nächsten Tag 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid wachsen. Transfektionszellen, die ein beliebiges geeignetes Transfektionsprotokoll verwenden, verwenden 100 Nanogramm pro Vertiefung sowohl des Erregers als auch des Wirts mit offenem Leserahmen, transfizieren 10 Nanogramm pro Vertiefung des CMV-Glühwürmchen-Luziferase-Plasmids, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren.

Jeder Punkt wird in dreifacher Transfertransfektionsmischung auf die Platten von kultivierten 2 9 3 T-Zellen getestet. Achten Sie darauf, die DNA-Mischung vorsichtig auf die Zellen aufzutragen, da 2 9 3 T-Zellen nicht stark haften und sich leicht vom Boden der Vertiefung lösen lassen. Inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 24 bis 30 Stunden mit 5 % Kohlendioxid Waschzellen mit PBS bei 100 Mikrolitern pro Vertiefung. 40 Mikroliter einer x Vanillelyse hinzufügen, puffern und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Unter Rühren werden 10 Mikroliter Zelllysate in einer weiteren weißen Platte für die anschließende Dosierung der Glühwürmchen-Luziferase aufbewahrt, die vier Grad Celsius oder alternativ bei minus 20 Grad Celsius mit Obergrenze zur Messung der Gaia-Aktivität gelagert wird. Legen Sie die Platte in ein Luminometer und injizieren Sie 100 Mikroliter Vanille-Luciferase-Assay-Reagenz auf die Zelllysate. Zählen Sie dann die Lumineszenz 10 Sekunden lang.

Die Dosierung einer 96-Well-Platte dauert etwa eine halbe Stunde. Verwenden Sie immer frische Extrakte, da das Einfrieren oder die Langzeitlagerung die interaktionsvermittelte Gaia-Aktivität auf den verbleibenden 10 Mikrolitern Zellextrakten beeinflussen kann. Injizieren Sie 50 Mikroliter Glühwürmchen-Luciferase-Assay-Reagenz mit einem Luminometer auf Zelllysate und zählen Sie die Lumineszenz 10 Sekunden lang.

Die Dosierung einer 96-Well-Platte dauert für jede Interaktion etwa eine halbe Stunde. Berechnen Sie das Verhältnis zwischen der Gaia-Luziferase-Aktivität und der Glühwürmchen-Luziferase-Aktivität, um einen normierten GAIA-Lumineszenzwert zu erhalten. Unter Berücksichtigung der Transfektionseffizienz und der Zellviabilität.

Berechnen Sie den Mittelwert der Triplikate, um die Wechselwirkung zu überwachen. Schätzen Sie ein normalisiertes Lumineszenzverhältnis (NLR) für jedes Erreger-Wirtspaar. Teilen Sie dazu die normalisierte GAIA-Lumineszenzaktivität, die in Gegenwart von Erreger- und Wirtsproteinen nachgewiesen wurde, durch die Summe der in Kontrollvertiefungen gemessenen Aktivitäten.

Der NLR-Cutoff-Wert für positive Wechselwirkungen wurde in einer früheren Studie auf etwa 3,5 geschätzt. Eine große Stärke der Hochdurchsatz-GIA-Regeln, des Protein COMPLEMENTATION Assay oder H-T-G-P-C-A liegt in seiner hohen Sensitivität, wie die Bewertung der falsch positiven und falsch negativen Raten für das HPVE-Zwei-Protein zur Bestimmung der falsch negativen Rate zeigt. Bekannte Wechselwirkungen von E zwei und HPV 16 wurden mit H-T-G-P-C-A bewertet, vier von 18 Wechselwirkungen wurden nicht gefunden, was einer Falsch-Negativ-Rate von 22% entspricht.

Die falsch positiven Wechselwirkungen wurden mit 5,8% gemessen, wobei 12 HPVE-Zwei-Proteine gegen einen zufälligen Satz zellulärer Proteine verwendet wurden. Die hohe Spezifität der Methode wird in dieser Abbildung hervorgehoben, die zeigt, dass eine Einzelpunktmutation, von der bekannt ist, dass sie die Bindung von E zwei an ihren Zellpartner BRD vier stört, das NLR-Verhältnis, vernichtet. Dieser groß angelegte vergleichende ektomische Ansatz wurde kürzlich erfolgreich auf drei frühe Proteine menschlicher Papillomaviren angewendet, E zwei, E sechs und E sieben, die aus unterschiedlichen Genotypen stammen, die für ihre natürliche Vielfalt in Tropismen und Pathologien für jedes der frühen Proteine repräsentativ sind.

Die hierarchische Clusterung der Interaktionsprofile, rekapituliert meist die HPV-Phylogenie, was die Robustheit des Ansatzes und die Qualität der Interaktionsdatensätze beweist. Es kann verwendet werden, um spezifische Interaktionsprofile des Viruswirts mit pathologischen Merkmalen zu korrelieren und so Hinweise auf die Beteiligung viraler Proteine zu geben. In der Pathogenese können genotypspezifische Wechselwirkungen extrahiert werden, die möglicherweise dem Tropismus oder pathogenen Biomarkern entsprechen.

Wie hier für E sechs interagierende Partner dargestellt, wurden die zellulären Ziele basierend auf der Interaktionsintensität sortiert und nach dem interagierenden HPV-Typ gruppiert. Diese Darstellung ermöglicht die Identifizierung spezifischer Biomarker wie z.B. fad, das nur mit den E 6-Proteinen des onkogenen HPV interagiert. Ein solches Targeting muss für das karzinogene Merkmal aller onkogenen HPV von entscheidender Bedeutung sein und stellt daher einen guten Kandidaten dar, der entweder als Surrogatmarker für eine HPV-Infektion oder als therapeutisches Ziel verwendet werden kann.

Befolgen Sie dieses Verfahren. Das H-T-G-P-C-A kann so angepasst werden, dass es mit einem dritten Protein verwendet werden kann, das als Fusion mit einem Biotin-Tag exprimiert wird. Dies ermöglicht die Erfassung von drei Partnerkomplexen auf Streptokokken-Tauchfarbplatten, was die Frage nach der Bildung großer Proteinkomplexe beantworten kann.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Krankheitserreger, Wirt-Topf-Interaktionen charakterisiert. Drittens, durch die Untersuchung von Interaktionspartnern mehrerer Stammvarianten. Zweitens, indem sie ihre Interaktion mit einer ganzen Reihe von Krankheitserregertypen anhand einer Proteinproteindauer vergleichen, beispielsweise in Säugetierzellen.