Name: Schnelle High Throughput Amylose Bestimmung in Gefriergetrocknete Potato Tuber Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Lernen Sie eine hochdurchsatzfähige kolorimetrische Methode zur Bestimmung von Amylose- und Amylopektinanteilen in Kartoffelstärke. Dieses Verfahren ermöglicht die effiziente Bewertung großer Kartoffelklonpopulationen für züchterische Programme.

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Die Finanzierung dieser Forschung wurde zum Teil von der USDA-ARS Research Associate-Programm und der USDA Crop Germplasm Ausschuss zur Verfügung gestellt.

1. Amylose Bestimmung von Kartoffelknollenstärke <ol><li> Schälen und schneiden frische Knollen in kleine Würfel schneiden. </li><li> Zeigen Kartoffelwürfel in kleinen braunen Taschen und über Nacht bei -80 ° C. </li><li> Übertragen Kartoffelwürfel auf Nylonbeutel und für die Gefriertrocknung. </li><li> Nach gefriergetrocknet, zermahlen die Kartoffelprobe zu Pulver mit Mörser und Stößel oder einer Wiley-Mühle. </li><li> In ein 50 ml Röhrchen, fügen 20-30 mg des gefriergetrockneten, Boden Knollenprobe. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung von 45% (w / v) Perchlorsäure (Mischungs 24,4 ml 60% Perchlorsäure und 25,6 ml von ultra-reinem Wasser. </li><li> In 500 ul von 45% (w / v) Perchlorsäure und schütteln oder schwenken Sie um Stärkekörner zu verteilen. </li><li> Nach einem Vier-Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur, fügen Sie 16 ml ultrareinem Wasser zu der Lösung und durch Vortexen mischen. </li><li> Nach der nicht-löslichen Material auf dem Boden der Röhre angesiedelt (7-10 min später), Transfer 40 ul der Lösung auf eine Mikrotiterplatte (Vermeidung der Pipettieren von Partikeln). </li><li> In 50 ul von Jod-Lösung (2 g KI + 1 g I 2 in 900 ml Reinstwasser) und mischen Sie die Probe durch Pipettieren. </li><li> Die Absorption bei 550 nm und 620 nm sofort. </li><li> Bestimmen Sie die Amylose-Anteil nach Vergleich des Amylose / Amylopektin-Verhältnis von jeder Probe (620 nm/550 nm-Absorption) mit einer Standardkurve von Amylose und Amylopektin-Lösungen bei verschiedenen Konzentrationen erzeugt. Dieser Vorgang wird als nächstes beschrieben. Lesen des Rohlings (Jodlösung und Perchlorsäure) zusammen mit den Testproben. Verwendung tanzt Daten für die Analysen. </li></ol> 2. Amylose / Amylopektin-Kurve <ol><li> In getrennten Röhren wiegen 12,5 mg Amylose und Amylopektin 12,5 mg. </li><li> Hinzufügen zu jedem Röhrchen 5 ml 45% (w / v) Perchlorsäure und vollständig aufzulösen. </li><li> Für jede der Lösungen (Amylose und Amylopectin), zu bringen, um ein Endvolumen von 50 ml mit ultrareinem Wasser. </li><li> Mix 6.25ml Amylose-Lager aus dem vorherigen Schritt mit 18,75 ml ultra-reinem Wasser. Damit wird ein 6,25 mg / ml Lösung Amylose. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die Amylopektin-Lösung. </li><li> Verwendung der Amylose-und Amylopektin-Standardlösungen aus den Schritten 2.4 und 2.5, bereiten die Prozent Amylose Standards, die 0-100% Amylose (100-0% Amylopektin) auf ein Endvolumen von 5 ml der Standardkurve in 10%-Intervallen zu schaffen. Zum Beispiel die Vorbereitung: Die 0% Amylose / Amylopektin 100% Standard-Pipette 5 ml Lösung Amylopektin. Die 10% Amylose / 90% Amylopektin-Standard, kombiniert 0,5 ml Amylose und Amylopektin 4,5 ml-Lösungen. Die 20% Amylose / 80% Amylopektin-Standard, kombiniert 1,0 ml Amylose und Amylopektin 4,0 ml-Lösungen. Die 30% Amylose / 70% Amylopektin-Standard, kombiniert 1,5 ml Amylose und Amylopektin 3,5 ml-Lösungen. Die 40% Amylose / 60% Amylopektin-Standard, kombiniert 2,0 ml Amylose und Amylopektin 2,0 ml-Lösungen. Die 50% Amylose/ 50% Amylopektin-Standard, kombiniert 2,5 ml Amylose und Amylopektin 2,5 ml-Lösungen. Die 60% Amylose / Amylopektin 40% Standard kombinieren 3,0 ml und 2,0 ml Amylose Amylopektin, und so weiter). </li><li> Transfer 40 ul jedes Standards Mischung auf eine Mikrotiterplatte. Fügen Sie einen gut mit 40 ul 45% (w / v) Perchlorsäure als leer. </li><li> In 50 ul von Jod-Lösung (2 g KI + 1 g I 2 in 900 ml Reinstwasser) und mischen jede Probe (einschließlich Leerzeichen) durch Pipettieren. </li><li> Lesen Absorption bei 550 nm und 620 nm sofort und berechnen Sie die Amylose / Amylopektin-Verhältnis für jede Konzentration. </li></ol>

<ol><li>Composition Hoover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+structure%2C+and+physicochemical+properties+of+tuber+and+root+starches%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr%22%5BJournal%5D)">molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review.</a> Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).</li>
<li>Bertoft, E., Blennow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Potato+Starch%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Potato+Chemistry+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Structure of Potato Starch.</a> Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).</li>
<li>Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+amylose+screening+in+maize+starches+from+exotic+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds.</a> Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).</li>
<li>Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+amylose+determination+methods+and+the+development+of+a+dual+wavelength+iodine+binding+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique.</a> Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).</li>
<li>Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+estimation+of+the+amylose+amylopectin+ratio+in+small+amounts+of+tuber+and+leaf+tissue+of+the+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Potato+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato.</a> Potato Res. 31, 241-246 (1988).</li>
<li>Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShannon%2C+JC+%22Starch%22">Starch</a>. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).</li>
<li>Haase, N. U., Plate, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+potato+starch+in+relation+to+varieties+and+environmental+factors%5BTitle%5D)+AND+%22St%C3%A4rke%22%5BJournal%5D)">Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors.</a> Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).</li>
<li>Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+on+the+size+distribution+and+amylose%2Famylopectin+ratio+in+potato+starch+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Pot.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules.</a> Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).</li>
<li>Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+to+measure+amylose+in+cereal+starches+and+flours+with+concanavalin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereal+Sci%22%5BJournal%5D)">A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A.</a> J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).</li>
<li>Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+amylose+content+of+starches+after+precipitation+of+amylopectin+by+concanavalin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Starch%22%5BJournal%5D)">Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A.</a> Starch. 42, 302-305 (1990).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Amylose Gehalt in Kartoffelknollen typischerweise im Bereich von 20-35% 7,8. Wenn die meisten Werte außerhalb dieses Bereiches, betrachten Sie diese möglichen Fehler: 1) Rohdaten wurden statt blendet Daten für den Bau des Amylose / Amylopektin-Standardkurve verwendet, 2) Rohdaten wurden statt blendet Daten für die Bestimmung der Amylose verwendet / Amylopektin-Verhältnis von den Kartoffelproben, oder 3) die für die Analyse verwendeten Wasser war nicht rein genug. Wir haben festgestellt, dass durch Verwendung ...

Etwa 80% des Frischgewicht einer Kartoffelknolle ist Wasser, fast alle der verbleibenden Trockenmasse ist Stärke ein. Der größte Teil der Stärke (70%) aus Amylopektin besteht, während der Rest Amylose. Das Verhältnis zwischen Amylose und Amylopektin ist die wichtigste Eigenschaft die Beeinflussung der physikalischen Eigenschaften der Stärke. Amylose ist ein lineares alpha 1-4 Zuckerkette, während Amylopektin ein lineares alpha-Kette mit 1-4 alpha 1-6 Verzweigungen 2. Verfahren wie Jodbindung, Differential Scanning Calorimetry (DSC), Hochleistungs-Grßenausschlußchromatographie (HPSEC) und Concanavalin A-Wechselwirkungen zur Stärkebestimmung in verschiedenen Pflanzenspezies 3,4 entwickelt. Jedes Protokoll erfordert besondere Fähigkeiten und Ausrüstung, was es schwierig zu skalieren, zahlreiche Proben zu einem Zeitpunkt zu quantifizieren. Die Methode, die wir hier vorstellen ist ein modifiziertes Protokoll von Hovenkamp-Hermelink et al. 5, die ein Dual-Wellenlängen-Jod-Bindung istVerfahren, das auf gefärbten Stärkekörner. Die Vorteile dieser Methode gegenüber anderen sind die Amylose Bestimmung von roher Stärke ohne Reinigung es und die Verwendung der Dual-Wellenlängen-System, um die Genauigkeit der Methode 4,6 zu erhöhen.

<table><tbody><tr><td colspan="4"> Reagenzien</td></tr><tr><td>Amylose </td><td>Sigma</td><td>859656</td><td></td></tr><tr><td>Amylopectin </td><td>Sigma</td><td>A8515</td><td></td></tr><tr><td>Perchlorsäure 60%</td><td>Sigma</td><td>311413</td><td>Sehr gefährlich für Haut und Augen</td></tr><tr><td>Jod</td><td>Sigma</td><td>23214TD</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumiodid</td><td>Sigma</td><td>08625JE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>Bio Tek</td><td>ELx800</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle high throughput amylose bestimmung in gefriergetrocknete potato tuber proben

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Dieses Protokoll beschreibt einen hochdurchgestellt kolorimetrischen Methode, die auf der Bildung eines Komplexes zwischen Jod und Ketten von Glucosemolekülen in Stärke beruht. Jod bildet Komplexe mit sowohl Amylose und Amylopektin in langen Ketten. Nach der Zugabe von Jod zu einer Stärkeprobe, die maximale Absorption von Amylose und Amylopektin erfolgt bei 620 und 550 nm auf. Das Amylose / Amylopektin-Verhältnis kann aus dem Verhältnis der 620 und 550 nm Absorptionswerte geschätzt werden und deren Vergleich mit einer Standardkurve, in der spezifischen bekannten Konzentrationen an Absorptionswerte aufgetragen. Dieser hohe Durchsatz ist kostengünstiges Verfahren zuverlässig und reproduzierbar, so dass die Auswertung von großen Populationen von Kartoffel-Klonen.

Die Standardkurve von tanzt Daten verschiedener Amylose / Amylopektin-Konzentration Lösungen konstruiert zeigt ungefähre Absorptionsverhältnis von 0,7 bis 1.6 (Tabelle 1). Eine lineare Regressionstrendlinie von diesen Daten werden später zum Ableiten Amylosegehalt in gefriergetrockneter Kartoffelproben (Fig. 1) verwendet. Die Anlage Produktionsumgebung hat eine Wirkung auf die Amylose-Gehalt in der Kartoffelknolle 7. Amylose repliziert Bestimmunge...

Schnelle High Throughput Amylose Bestimmung in Gefriergetrocknete Potato Tuber Proben

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die relativen Anteile von AMLO und Amylopektin auf hochdurchsatzfähige Weise zu bestimmen. Bei Kartoffelknollenstärke ist eine hohe AMLO-Stärke aufgrund ihrer geringeren Verdaulichkeit erwünscht. Kartoffeln mit hohem AMLO-Stärkegehalt weisen einen niedrigeren glykämischen Index und einen höheren Ballaststoffgehalt auf.Diese Technik wird von Philip Smith, einem Studenten der University of Wisconsin Madison, demonstriert. In unserem Labor beschäftigen wir uns dafür, kartoffelzüchtungen mit einem höheren Nährwert zu entwickeln. Eine Möglichkeit dazu besteht darin, den AMLO-Gehalt in der Kartoffelstärke zu erhöhen.Stärke mit hohem AMLO-Gehalt ist nahrhafter, da sie einen niedrigeren glykämischen Index aufweist. Bei diesem Testverfahren haben wir eine Methode entwickelt, die es uns ermöglicht, eine große Anzahl von Proben relativ schnell zu analysieren. Der Test ist wiederholbar, hochdurchsatzfähig und kostengünstig. Dieses Verfahren ist eine Modifikation einer Jod-Färbungstechnik. Es handelt sich um einen kolorimetrischen Test, der in einer 96-Loch-Platte durchgeführt werden kann. Für diese Methode werden frische Kartoffelknollen verwendet. Die Knollen werden in etwa ein Zentimeter große Würfel geschnitten, wobei Stücke mit Schale verworfen werden.Mithilfe eines Pommes-Frites-Schneiders lässt sich dieser Schritt effizient durchführen. Die Würfel werden in eine beschriftete Tüte gegeben. Wir verwenden Nylonsocken, wie sie beispielsweise in Schuhgeschäften verwendet werden.Sie sind kostengünstig und ermöglichen eine schnelle und gleichmäßige Trocknung der Proben im Gefriertrockner. Die Nylonbeutel mit den Proben werden in eine Papiertüte gegeben und über Nacht bei minus 80 Grad C eingefroren. Die gefrorenen Proben werden aus der Papiertüte entnommen und in den Gefriertrockner gegeben. Mit unserem Gefriertrockner.Das vollständige Trocknen der Proben dauert etwa fünf Tage. Nachdem die Würfel getrocknet sind, können sie weiterverarbeitet werden. Die getrockneten Kartoffelwürfel werden fein gemahlen, entweder mit einer Wiley-Mühle oder mit einem Motor und einem Pistill. Die Würfel oder das Pulver können aufbewahrt werden, bis sie verarbeitet werden. Stellen Sie jedoch sicher, dass sie in Plastiktüten oder Behältern verschlossen werden, um zu verhindern, dass sie Wasser aufnehmen. Das Pulver wird zur Lagerung in eine Plastiktüte gegeben, bis die AMLO-Assays durchgeführt werden können.Eine Analysenwaage wird verwendet, um etwa 20 Milligramm Kartoffelpulver abzuwiegen, das anschließend in ein 50 ml-Plastikröhrchen gegeben wird. Proben mit einem Gewicht unter 20 Milligramm oder über 30 Milligramm liefern keine zuverlässigen Ergebnisse, um die Stärke löslich zu machen. 500 Mikroliter 45 %iger Perchlorsäure werden jedem Röhrchen hinzugefügt.Seien Sie vorsichtig beim Arbeiten mit Perchlorsäure; arbeiten Sie im Abzug und verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung. Nach einer vierminütigen Inkubationszeit wird die Probe unter Vortexen mit 16 Milliliter Milli-Q-Wasser verdünnt. Sobald das unlösliche Material am Boden des Reaktionsgefäßes abgesetzt hat, übertragen Sie 40 Mikroliter der Flüssigkeit in die Mikrotiterplatte.Vermeiden Sie sorgfältig die Übertragung unlöslicher Bestandteile. 50 Mikroliter Iodlösung werden zur Probe gegeben und vorsichtig durch Pipettieren gemischt. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Probe oder an den Wänden des Wells verbleiben.Wenn sich Luftblasen bilden, klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um sie zu lösen. Stellen Sie die Mikrotiterplatte in das Plattenlesegerät und messen Sie die Absorption jeder Probe bei 550 Nanometern und 620 Nanometern. Sobald wir die Ausgabewerte des Mikroplattenlesegeräts erhalten haben, können wir die Daten mit der Standardkurve vergleichen und das Verhältnis von Amylose zu Amylopektin in der Stärkeprobe (Tabelle 1) bestimmen.Dies ist eine typische Ausgabe der Standardkurve, wie im Protokoll erläutert. In Abbildung eins werden die Absorptionsverhältnisse aufgetragen und eine Regressionsgerade für die AMLO-Bestimmung in den Kartoffelproben berechnet. Bei der Erstellung der Standardkurve sollte jeder Punkt auf der Kurve dem Absorptionswert der Probe mit der bekannten AMLO-Konzentration entsprechen.Nach Abzug des Absorptionswerts der Blindprobe. Beim Berechnen des Werts einer unbekannten Probe ebenfalls den Absorptionswert der Blindwerttabelle abziehen. Zwei. Dies ist eine typische Ausgabe des AMLO-Gehalts in Kartoffelknollen.Mithilfe dieser KOLORIMETRISCHEN Methode haben wir diesen Assay in unserem Labor verwendet, um die relativen Beiträge des Genotyps und der Umwelt auf das AMLO-Amylopektin-Verhältnis in Kartoffelstärke zu bestimmen. Letztendlich hoffen wir, molekulare Marker zu entwickeln, die mit hohem AMLO-Stärkegehalt in Kartoffeln assoziiert sind, und außerdem Zuchtmaterial zu erzeugen, das Züchter zur Entwicklung von kartoffelsorten mit hohem Amylogehalt nutzen können.

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Chemie

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