Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, morphe Oligonukleotide in den Hirnventrikel des adulten Zebrafischgehirns zu injizieren und die Aktivität von Genen in den Radiogliazellen zu unterbinden. Dies wird erreicht, indem der Zebrafisch zunächst betäubt wird. Als nächstes wird ein Schlitz im Schädel erzeugt, der mit einer Stielnadel über den optischen Stumpf gelegt wird.

Dann wird die Morpholösung durch die Inzisionsstelle in die zerebrale Ventrikelflüssigkeit injiziert. Abschließend werden die Injektionseffizienz und -genauigkeit unter dem Fluoreszenzmikroskop überprüft. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine zu effiziente und weit verbreitete Blockade der Proteinproduktion von den interessierenden Genen in den radialen Gliazellen des adulten Zebrafischgehirns durch Morpho-vermittelten Gen-Knockdown ermöglichen, was durch histologische Schnitte und immunhistochemische Färbungen untersucht werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den bestehenden Methoden, wie z.B. transgenen Ansätzen oder elektrooperationsbasierten Verabreichungsmethoden, besteht darin, dass CVMI weniger zeitaufwändig und effizienter ist, um die gesamte Population von Radiogliazellen zu erreichen. Diese einstellbaren und viele Gene können gleichzeitig ausgeschaltet werden. Zur Herstellung der Injektionsmischung stellen Sie zunächst eine 500 Mikromolare Morpho-Stammlösung her.

Bereiten Sie unter Verwendung von PBS für 10 Injektionen 10 Mikroliter Injektionsmischung vor, indem Sie neun Mikroliter verdünnte oder unverdünnte Morpholösung mit einem Mikroliter eines fluoreszierenden Tracking-Farbstoffs kombinieren. Lagern Sie es bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen Nadelabzieher, um Glasinjektionskapillaren gemäß den folgenden Parametern vorzubereiten.

Schalten Sie die Druckquelle ein und stellen Sie den Druck auf 50 PSI oder 3,5 bar ein. Passen Sie die Einstellungen des Mikroinjektors wie folgt an. Nachdruck 20 PSI, Auswurfdruck 10 PSI, Periodenwert 2,5 und 100 Millisekunden.

Bereich der Anschnitte. Schalten Sie die Ringbeleuchtung ein und positionieren Sie den Ring über dem Mikroskoptisch. Platzieren Sie den Kapillarhalter an einer geeigneten Stelle neben dem Mikroskop.

Setzen Sie die Glaskapillare in die Halterung ein und stellen Sie den Injektionswinkel auf 45 Grad ein. Brechen Sie mit einer Pinzette die Spitze der Glaskapillare ab und kalibrieren Sie die Druckabgabe aus der Blende. Durch Eintauchen der Nadelspitze in das Fischwasser und Anlegen eines kontinuierlichen Druckimpulses sollten die Luftblasen eine einzige Reihe bilden, die den optimalen Druck oder die optimale Öffnungsgröße anzeigt.

Laden Sie die Glaskapillare mit der Injektionslösung. Um Luftblasen zu vermeiden, üben Sie Druck aus, um die Luft zwischen der Spitze der Glaskapillare und der geladenen Injektionslösung zu entfernen. Nach der Herstellung einer 0,1%igen Stängellösung des Betäubungsmittels Meab die gewünschte Anzahl Fische in einen Transportbehälter mit Fischwasser umfüllen.

Bereiten Sie eine Arbeitslösung des Anästhetikums vor, indem Sie 200 Milliliter Fischwasser mit fünf Millilitern MISP-Stammlösung mischen. Füllen Sie eine Petrischale zur Hälfte mit dem Anästhetikum, um es für Injektionen zu verwenden. Inkubieren Sie einen Fisch in der Betäubung, bis er sich nicht mehr bewegt.

Verwenden Sie dann ein Netz, um es in die Petrischale des Anästhetikums zu übertragen. Um den Schnitt zu erleichtern, halten Sie den Fisch mit der Pinzette vorsichtig fest und richten Sie ihn mit leicht nach unten geneigtem Kopf aus. Machen Sie mit der Spitze einer 30-Gauge-Nadel mit Widerhaken einen kleinen Schlitz in den Schädel, ohne zu tief einzudringen, da dies das Hirngewebe schädigt.

Während Sie den Fisch weiterhin festhalten, führen Sie die Spitze der Glaskapillare etwa einen halben Millimeter durch die Inzisionsstelle ein und richten Sie sie unter Vermeidung des Kontakts mit dem Hirngewebe in Richtung des Kopfgewebes aus. Injizieren Sie die Lösung, sie sollte sich sofort auflösen. Setze den Fisch in frisches Fischwasser um und lasse ihn sich erholen.

Etwa 30 Minuten später betäuben Sie den Fisch erneut und überprüfen Sie ihn unter einem Fluoreszenzmikroskop, um nach einer großflächigen Verteilung der Flüssigkeit zu suchen. Basierend auf roter Fluoreszenz. Setzen Sie den Fisch wieder in sein Aquarium zurück und setzen Sie ihn wieder in den Kreislauf.

Bis zur Verwendung für Verhaltensanalysen oder zur Präparation von Gewebeproben, wie hier zu sehen, führt eine genaue Injektion zu einer Dispersion der injizierten Lösung im gesamten Gehirn und zu einer effizienten Ausrichtung der Zellen nahe der Ventrikeloberfläche. Bei Injektionen, bei denen die Glaskapillare aufbläht, hat das Hirngewebe jedoch an der Injektionsstelle ein dichtes Fluoreszenzsignal. Und wenn die injizierte Menge nicht ausreicht, wird ein schwaches Fluoreszenzsignal beobachtet.

Diese Abbildung zeigt, dass vivo-Morphos einige Zelldurchmesser innerhalb der ventrikulären Oberfläche durchdringen können und daher im Vergleich zur Kontrolle effizient auf die ventrikulären Zellen abzielen können. Morpho. Die Injektion von Morpho gegen PCNA unterdrückt effizient die Genexpression in ventrikulären Zellen. In diesen Immunfluoreszenzbildern zeigen BRDU- und QCD-Immunfärbungen nach A-B-R-D-U-Pulsverfolgungsexperimenten, dass der Knockdown von PCNA mit Antisense-Morphosen zu einer signifikanten Reduktion der neugeborenen Neuronen führt, was darauf hindeutet, dass CVMI verwendet werden kann, um endogene Gene abzuschalten, was anschließend zu funktionellen Konsequenzen führt.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die molekularen Mechanismen zu erforschen, die an der regeneratorischen Neurogenese-Reaktion des adulten S des Fischgehirns beteiligt sind.