Name: Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Gen-Knockdown im adulten Zebrafisch-Gehirn durch zerebroventrikuläre Mikroinjektion von Morpholino-Oligonukleotiden. Diese Technik ermöglicht funktionelle Studien radialer Gliazellen.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 655) und der Europäischen Union (ZF-Health) unterstützt.

1. Vorbereitung des Einspritzmischung <ol><li> Verwenden vivo Morpholinos als Zellen verinnerlichen effizienter als normale Morpholino Moleküle. Siehe Angaben des Herstellers für Details (Tabelle 1: Reagenzien und Materialien). </li><li> Verwendung eines fluoreszierenden Markierungsfarbstoff (zB CellTracker Red CMTPX, Invitrogen), um die Genauigkeit der Einspritzung zu visualisieren. Dieser Farbstoff wird in der Zelle abgebaut und wird nur in der Zelle nach der Aufnahme fluoreszierend. Deshalb ist dieser Schritt von entscheidender Bedeutung für die Zellen, die effizient durch die cerebroventricular Mikroinjektion werden gezielt zu bestimmen. </li><li> Bereiten Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH-Wert: 7,4) zum Verdünnen Morpholino Lösung. Wenn eine Verdünnung der Morpholino-Lösung erforderlich ist, verwenden Sie immer PBS. </li><li> Bereiten Sie 10 ul der Injektion Mischung durch Zugabe von 9 ul der Morpholino-Lösung und 1 ul the Zelle tracker Farbstoff (verdünnt oder unverdünnt Die Aktie Konzentration der Morpholino Lösung ist 500 pM Unsere bisherigen Ergebnisse zeigen, dass 22 verschiedene Dosen des Morpholino -.. im Bereich von 50 um bis 500 um - Ergebnis in verschiedenen Ebenen der Knockdown von einem effizienten Knockdown zu hypomorphen Phänotypen). 1 ul Lösung ist genug für die Injektion in einem Zebrafisch Gehirn. </li><li> Gut durchmischen und bei Raumtemperatur bis zur Injektion. </li></ol> 2. Herstellung des Injektionsgeräts <ol><li> Bereiten Sie das Glas Injektionskapillaren mit einer Nadel abziehen. Verwenden Sie die folgenden Parameter: Heizung Zyklus Wert: 463, zieht Zyklus Wert: 230, Geschwindigkeit: 1,5 Sek., Zeit: 75 ms. </li><li> Schalten Sie den Druck Quelle und passen Sie die Einstellung, um den 50 psi oder 3,5 bar. </li><li> Passen Sie die Mikroinjektor Einstellungen wie folgt: Druck halten 20 psi, 10 psi Druck Auswurf, Zeit-Wert von 2,5 und 100 ms Bereich von Gating. </li><li> Drehenauf dem Ring Illuminator und suchen Sie den Ring über das Mikroskop Bühne. </li><li> Legen Sie die Kapillarenhalter in eine geeignete Position neben dem Mikroskop. </li><li> Legen Sie die Glaskapillare in die Halterung. Stellen Sie die Einspritzwinkel bis 45 Grad. </li><li> Brechen Sie die Spitze der Glaskapillare mit einer feinen Pinzette-End-und kalibrieren den Druck Ausgang aus der Öffnung. Dies muss durch Eintauchen der Spitze der Nadel in den Fisch Wasser und damit eine zusammenhängende Druckimpuls getestet werden. Die Luftblasen entstehen sollte nur eine Zeile, die ein Indiz für optimale Druck / Öffnung Größe sein. Bitte sehen Sie das Video zur Demonstration dieser Kalibrierung. </li><li> Laden Sie die Glaskapillare mit der Injektionslösung ohne Luftblasen. </li><li> Druck ausüben, um die Luft zwischen der Spitze der Glaskapillare und der geladenen Injektionslösung zu entfernen. </li></ol> 3. Anästhesie <ol><li> Bereiten Sie die Stammlösung der Anästhetika (0,1% MESAB - Ethyl-m-aminobenzoate Methansulphonat). </li><li> Entfernen gewünschte Anzahl der Fische aus ihren Tanks in Kunststoff Mäusekäfige oder andere Transportbehälter mit genügend Menge Wasser. </li><li> Bereiten Sie die Lösung Betäubung in einem kleinen Kunststoff-Box durch Mischen von 200 ml Wasser von Fischen mit 5 ml Stammlösung Anästhetika. Endkonzentration der Anästhetika: 0,0025% (v / v). </li><li> Half-füllen eine Kunststoff-Petrischale mit Anästhetika. Verwenden Sie dieses Gericht für Injektionen. </li><li> Inkubieren Sie die Fische in den Anästhetika bis der Fisch dämpft. </li></ol> 4. Inzision und cerebroventricular Mikroinjektion <ol><li> Entfernen Sie den Fisch aus der Dose mit einem Fischernetz und legen Sie sie in der Petrischale. </li><li> Halten Sie das Fischen mit der Pinzette und orientieren sich der Kopf in einer Weise, dass es leicht nach unten kippt. Dies erleichtert den Schnitt. </li><li> Generieren Sie einen kleinen Schlitz auf den Schädel mit einer 30-Gauge-Nadel mit Widerhaken-Ende. Verwenden Sie nur die Spitze der Nadel und dringen nicht mehr alsgenug in das Gehirn, da dies zu Schäden am Hirngewebe und manifestieren wird als Blutung. </li><li> Halten Sie den Fisch und legen Sie die Spitze des Glases durch den Einschnitt Website Kapillare. </li><li> Richten Sie die Spitze des Glases in Richtung telencephalon Kapillare. Berühren Sie das Hirngewebe als dies schafft Gewebeschäden und verhindert auch, dass die Dispersion des injizierten Lösung. </li><li> Injizieren Sie die Lösung. Die Flüssigkeit verteilt sich sofort nach der Injektion. </li></ol> 5. Erholung und Analyse der Genauigkeit Injection <ol><li> Entfernen Sie den Fisch aus dem Setup-Injektion und in einen Kunststoff-Box mit frischem Fisch Wasser. </li><li> Erlauben Erholung. </li><li> Erneut betäuben die Fische mit 0,0025% MESAB kurz und überprüfen Sie den Fisch unter dem Fluoreszenzmikroskop. Eine gründliche Verteilung der roten Fluoreszenz ist ein Indiz für weite Verbreitung der eingespritzten Flüssigkeit. </li><li> Setzen Sie den Fisch zurück in die Kunststoff-Box. </li><li> Verbinden Sie den Kunststoff-Box zu ter Kreislaufsystem mit Sauerstoff der Fische und für längere Zeit aufrecht zu erhalten. </li><li> Verwenden Sie den Fisch für die gewünschten Zwecke wie Verhaltens-Analysen oder die Tiere opfern zu gewünschten Zeitpunkten nach der Injektion, um Gewebeproben für weitere Analysen (histologische Färbungen, Immunhistochemie, etc.) vorzubereiten. Die folgenden Hinweise geben Beispiele dafür, wie die erwachsenen Zebrafisch Gehirn analysieren: 9,11,17-20,24-27. Die schnellste Zeit, um einen effizienten Knockdown beobachten (mehr als 50% Aufgeld) war 12 Stunden in unseren Studien 22. </li></ol> 6. Empfohlene Scientific Bedienelemente <ol><li> Verwenden Sie einen Mismatch Morpholino Molekül, das nicht soll, jede Phänotyp als negative Kontrolle führen. Verwenden Sie entweder eine Standard-Morpholino Molekül oder speziell Design Morpholino Kontrollen für jedes Gen von Interesse. Darüber hinaus verwenden die Lösungsmittel (in diesem Fall PBS) als weitere Negativ-Kontrolle, um die unspezifische Effekte oder Toxizität des mus beurteilenatch / steuern Morpholino-Injektionen. </li><li> Verwenden PCNA Morpholinos zuvor beschriebenen 22 als positive Kontrollen. Dies bewirkt eine effiziente Morpholino Knockdown in der erwachsenen Zebrafisch Gehirn (75-95% Knockdown Effizienz innerhalb von 1 Tag nach der Injektion) 22. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methode, die wir hier beschreiben, ermöglicht eine einfache und schnelle Verwaltung von Morpholinos in der erwachsenen Zebrafisch Gehirn. Wir haben gezeigt, dass unsere Injektionsverfahren schirmt Genexpression in den ventrikulären Zellen und führt zu funktionellen Konsequenzen in der Neurogenese Antwort. Es gibt wichtige Punkte, vorsichtig zu sein bei der Ausführung des cerebroventricular Mikroinjektion. Zum Beispiel hängt die Wirkung der Morpholino-Moleküle von der verwendeten Konzentration. Diese Konzentration ist durch den Endbenutzer bestimmt werden. Wir empfehlen, beginnend mit der Stammlösung (500 &amp;mgr; M) und die Durchführung serielle Verdünnungen und ideal für Pre-Test durch Injektion in Embryonen mit Standard-Embryo Injektionsprotokolle 28-30. Zuvor erhalten wir verschiedene Ebenen der Knockdown Effizienz mit Konzentrationen von Morpholinos von 50 um bis 500 um 22. Zweitens sollte die Öffnung der Glaskapillare nicht large, da dies zu umfangreiche liquide Zustrom in das Gehirn nach der Injektion führen. Ebenso muss die Öffnung nicht zu eng sein, da dies ausreichend Injektion verhindert. Man kann die optimale Öffnung Druck Kombination von Pumpen von Luft in eine Petrischale mit Wasser bestimmen. Die Blasen, die sich in einer einzigen Reihe, jedoch nicht in mehreren Reihen sein. Wir zeigen dies in dem Video. Drittens Inkubation der Fische in den Anästhetika ist kritisch. Der Fisch sollte nicht länger als 2 min in der Anästhesie gehalten werden. Dies behindert die Recovery Rate nach der Injektion. Viertens ist die Lage des Schnittes kritisch gründlich Dispergieren der injizierten Flüssigkeit. Die ventrikuläre Region im Tectum opticum größer ist oberhalb der Mittellinie und wird schmaler seitlich. Daher sollte der Experimentator erzeugen den Schlitz in den Schädel in der Nähe der Mittellinie und nur kaudal des Schädels Platte für den telencephalic Region. Einer der Vorteile des cerebroventricular injection (CVMI) Verfahrens ist seine Schnelligkeit. CVMI ist eine schnelle Methode zur Bestimmung von Genfunktionen. Diese Funktion ist wichtig und nützlich, wenn die Erzeugung von transgenen Linien für funktionelle Studien, die in der Regel mehrere Monate dauern, verglichen. Zusätzlich führt CVMI um eine gleichmäßige Verteilung der injizierten Flüssigkeit und somit ein relativ gründliche Manipulation der Genaktivität bei fokaler Injektionen oder Elektroporation verglichen. Mit CVMI können mehrere Gene gleichzeitig gedrückt werden durch Injektion vorbereiten mischt mit mehreren Morpholinos Oligonukleotid klopfte. CVMI können unterschiedliche Konzentrationen einer gegebenen Morpholino Oligonukleotiden injizieren, und kann daher zum Analysieren hypomorphen Phänotypen verwendet werden können. Schließlich ist diese Injektion Paradigma nicht zu Toxizität und beeinträchtigt das Überleben der Tiere. Die Technik könnte für CVMI andere Art von Studien wie Injektion von modulatorische Peptide, Drogen, Plasmid-DNA oder RNA modulatorische mo erweitert werdenlecules oder andere Substanzen, die die Physiologie der Zellen beeinflussen könnte. Untersuchen Kombination von Molekülen und Durchführen Dosis-Wirkungs-Analysen möglich sind wir mit unserer Methode, so dass das Studium hypomorphen Phänotypen. Mit diesen Eigenschaften erweist CVMI um eine schnelle und einfache Test zum Ausdruck Studien in der erwachsenen Zebrafisch Gehirn und eröffnet schnelles Screening und funktionelle Analysen. Die erwachsenen Zebrafisch Gehirn konstitutiv produzieren neue Nervenzellen entlang der gesamten rostrokaudalen Achse und es kann auch nach traumatischen Verletzungen regenerieren. Dies steht in krassem Gegensatz zu Säugetieren Gehirn mit begrenzten Neurogenese und wenn überhaupt, eher schlechte Regenerationsfähigkeit. Diese weit verbreitete Stammzellen Aktivität und Erholung Fähigkeit macht Zebrafische ein nützliches Modell für das Verständnis der molekularen Programme für zentrale Nervensystem die Regeneration erforderlich, die derzeit weitgehend unbekannt. Daher untersuchen die molekularen Grundlagen der regenerativen Eignung zebrafish Gehirn ist ein interessanter Bereich der Forschung, die den grundlegenden Unterschied, wie Fische und Säuger-Gehirn nach einer Verletzung zu reagieren, und auch verleihen Wege für regenerative medizinische Therapien beim Menschen erklären könnte. Um die molekularen Infrastruktur von Wirbeltieren Plastizität des Gehirns und die Regeneration zu verstehen, dienen Gliazellen als wichtiges Forschungsgebiet, da sie die neurogenen Vorläuferzellen 3,8,20 sind. Somit ist die Verwendung CVMI Technik, um Genfunktionen in der radialen Gliazellen des Gehirns verändern Zebrafisch ist in der Aufklärung instrumental wie Fisch Gehirn koppeln können Vorläuferzellen Aktivität, um eine effiziente und regenerative adulte Neurogenese Antwort. Vor kurzem haben wir das Engagement und die Anforderung von mehreren Faktoren und Signalwege in der regenerativen Neurogenese Reaktion der erwachsenen Zebrafisch Gehirn 24,26,27 gezeigt, und diese Studien wurden durch den Einsatz von CVMI Verfahren. Insgesamt könnten die Erkenntnisse, die wir aus Zebrafischgehirn gewinnen genutzt werden, um Regeneration zu verhängenrative Fähigkeit zu den Säugetieren Gliazellen, die zu Verletzungen reagieren und somit helfen, Gestaltung klinischer Therapien für menschliche neurologische Störungen und akuten Verletzungen.

Adulte Neurogenese ist ein gemeinsames Merkmal von Wirbeltieren, jedoch der Grad der Verbreitung und Effizienz variiert mit der Stammesgeschichte 1,2,3,4,5,6. Zum Beispiel enthalten adulten Gehirn Stammzellen Regionen weitgehend dem Vorderhirn 7,8 beschränkt, während die Knochenfische Zebrafisch enthält sechzehn verschiedenen Stammzell-Domänen und die damit verbundenen neurogenen Zonen in seiner gesamten Gehirn 4,5,9,10. Diese Variation zwischen Säugetieren und Zebrafisch könnte darüber nachdenken, eine Disparität in den Mechanismen der Stammzell-Wartung und der neurogenen Kapazität der Vorläuferzellen. Die lebenslange Kompetenz der Zebrafisch zu Neuronen im Gehirn könnte auch darstellen klinischen Auswirkungen wie die molekularen Mechanismen, durch Zebrafischgehirn beschäftigt für therapeutische Anwendungen genutzt werden könnte, um die neurodegenerativen Erkrankungen beim Menschen zu bekämpfen. Mehrere Stammzellen Zonen des Erwachsenen Zebrafischgehirn wurden analysiert, und es wurde gezeigt, dass dieZellen der ventrikulären Oberfläche dieser Regionen dienen als Vorläuferzellen 9,11-20. Ausführliche Analysen im Zebrafisch telencephalon zum Beispiel identifiziert die radialen Gliazellen, die die ventrikuläre Oberfläche dieser Gehirnregion abzugrenzen neurogene Vorläuferzellen 19, 20 sein. Dies gilt auch für andere Regionen wie dem Kleinhirn und dem Tectum opticum, wo ventrikulär gelegene Neuroepithelzellen die neurogene Eingang 16,21 bereitzustellen. Zu diesem Zweck, das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die weit verbreitete neurogenen Kompetenz in der Erwachsenenbildung Zebrafischgehirn erfordert Manipulation der Genexpression in den Vorläuferzellen. Verschiedene Methoden wurden bisher für die Modulation der Genfunktion in Zebrafisch beschrieben. Hervorzuheben sind die folgenden Generation bedingten transgenen Linien, die gewünschten Varianten eines einzigen Proteins, Plasmid basierender Schwerpunkt Injektionen gekoppelt Elektroporation oder chemische Behandlungen. Wir haben vorher entwickelt einVerfahren zur Verabreichung verschiedener Substanzen einschließlich Morpholino Oligonukleotide oder Proteine ​​in der erwachsenen Zebrafisch Gehirn mit cerebroventricular Mikroinjektion als eine schnelle und effiziente Art der Modulation der Genfunktion in den ventrikulären Zellen des erwachsenen Zebrafisch Vorderhirn 22. In unseren Studien wurden vivo Morpholinos aufgrund ihrer Chemie, die die Morpholino Molekül kovalent an reich Lieferung Peptide, die effiziente Bereitstellung zu ermöglichen, die Zellen von Interesse, ohne Notwendigkeit für zusätzliche Permeabilisierung wie Elektroporation 23 Arginin. Dies würde es ermöglichen eine gründliche Targeting des gewünschten Gewebes nach der Injektion, wie, was wir in erwachsenen Zebrafisch telencephalon 22 beobachtet. Verwendung vivo Morpholinos sind daher überlegen bereits bestehenden Methoden des Tissue Targeting wie Elektroporation oder fokale Injektion von DNA-Molekülen. Hier zeigen wir, visuell, wie wir diese Operation durchzuführen und bieten einSchritt-für-Schritt-Protokoll. Wir beginnen mit Erläuterung Herstellung der Einspritzung des Gemischs und die Fische, die injiziert werden, und gehen durch den Nachweis, wie das Injektionsgerät eingerichtet ist. Wir bieten Ihnen eine Beschreibung des cerebroventricular Injektionsverfahren, das Erzeugen eines Schnittes in den Schädel und Injektion der Morpholinos mit Mikroinjektor beinhaltet. Wir haben auch über die kritischen Punkte muss man vorsichtig sein, während des gesamten Verfahrens mit der Feststellung, sie als Optimierung oder Anleitungen zur Fehlerbehebung zu erarbeiten.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz/Material</td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>C34552</td><td>Verwendung bei 1:100 Verdünnung zur Messung der Injektionsgenauigkeit</td></tr><tr><td>MESAB (Ethyl-m-aminobenzoat-Methansulfonat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Zur Betäubung des Fisches</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Sarstedt</td><td>821,472</td><td>Für den Umgang mit dem Fisch während der Injektion und Bildgebung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td>Als steriles Verdünnungsmedium</td></tr><tr><td>Vivo morpholinos</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>Weitere</td><td>Informationen zu vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a><</td></tr><tr>td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Nadel mit Stachelende</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305178</td><td>Um den Schnitt im Schädel zu generieren</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Variiert mit dem Hersteller</td><td>Teil von die gesamte Injektionseinrichtung</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td>Zum Abbrechen der Spitze der Glaskapillare</td></tr><tr><td>Fluoreszenzkamera</td><td>Zeiss, Nikon, Leica</td><td>Variiert je nach Hersteller</td><td>Zur Visualisierung der Fluoreszenz nach der</td></tr><tr><td>Injektion Gillies Präparierzange</td><td>World Precision Instruments</td><td>501265</td><td>Um den Fisch in Position zu halten</td></tr><tr><td>Glasinjektion Kapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>TWF10</td><td>Für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>PicoNozzle Kit (Mikroinjektorhalter)</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>Für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Pneumatische PicoPump (Mikroinjektor)</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>Für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Ringbeleuchtung; Ringlichtleiter</td><td>Parkland Scientific</td><td>ILL-RLG</td><td>Zur Beleuchtung der Probe</td></tr></tbody></table>

mikromanipulation der genexpression in der erotik-zebrafischgehirn mit cerebroventricular mikroinjektion von morpholino oligonukleotiden

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation der Genexpression in Geweben erforderlich ist, um funktionelle Untersuchungen durchzuführen. In diesem Beitrag zeigen wir die cerebroventricular Mikroinjektion (CVMI)-Technik als Mittel zur Modulation der Genexpression in der erwachsenen Zebrafisch Gehirn. Durch die Verwendung von CVMI können Stoffe in die cerebroventricular Flüssigkeit verabreicht werden und gründlich entlang der rostrokaudalen Achse des Gehirns verteilt werden. Besonders für die Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide, die eine starke Werkzeuge für umzuwerfen Genexpression in vivo zu konzentrieren. Bei unserer Methode, wenn angewandt, sind Morpholino Moleküle von den Zellen der ventrikulären Oberfläche gemacht. Diese Zellen sind die radialen Gliazellen, die als neurogenen Vorläuferzellen handeln. Daher umzuwerfen Genexpression in den radialen Gliazellen ist von größter Bedeutung, um die weit verbreitete Reaktion Neurogenese im Zebrafisch zu analysieren und würde auch Einblick in Wirbeltieren könnte erwachsenen Neurogen Sustain liefernesis Antwort. Ein solches Verständnis würde auch helfen, die Bemühungen für die klinische Anwendung in der Human-und neurodegenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems Regeneration. So stellen wir die cerebroventricular Mikroinjektionsverfahren als eine schnelle und effiziente Möglichkeit, die Genexpression und Neurogenese Antwort in der erwachsenen Zebrafisch Vorderhirn verändern. Wir bieten auch Tipps zur Fehlerbehebung und andere nützliche Informationen darüber, wie die Durchführung der CVMI Verfahren.

Cerebroventricular Mikroinjektion führt zu weit verbreiteten Verteilung der injizierten Lösung Mit dem Workflow-und technische Regelung des cerebroventricular Mikroinjektion in Abbildung 1 dargestellt, wir Morpholino Oligonukleotiden in die erwachsenen Zebrafisch Gehirn verabreicht. Eine genaue Injektionsprotokolls führt zu einer Streuung der eingespritzten Flüssigkeit im Gehirn und effizienten Ausrichtung der Zellen in der Nähe der ventrikulären Oberfläche (2A). Injektionen in die Glaskapillare durchbohrt das Hirngewebe haben eine dichte Fluoreszenzsignal an der Stelle der Injektion (Abb. 2B). Wenn die injizierte Menge ist nicht genug, wird schwach fluoreszierende Signal beobachtet (Abbildung 2C) werden. Cerebroventricular Mikroinjektion kann umzuwerfen Genexpression auf der ventrikulären Bereich der erwachsenen Zebrafisch Gehirn verwendet werden Wir haben gezeigt, thin vivo Morpholinos eindringen kann ein paar Zelldurchmessern innerhalb der ventrikulären Oberfläche und kann somit effizient zielen auf die ventrikuläre Zellen (3A, 3B). Morpholino Injektion kann Knockdown Genexpression, da es die Produktion des entsprechenden Proteins (ein Beispiel ist PCNA, wie in den 3C, 3D gezeigt) zu lindern. Wir haben bereits gezeigt, dass umzuwerfen Gene mit dieser Technik führt zu funktionellen Konsequenzen während der adulten Neurogenese (3E, 3F) oder Regeneration Reaktion (Abb. 3G, 3H). Wir haben gezeigt, dass die effiziente Knockdown Bereich (mehr als 50% Zuschlag) etwa 12 Stunden nach Injektion des Morpholinos 22 erreicht. Wir haben auch beobachtet, dass eine effiziente Knockdown Zeitraum bis etwa 5 Tage nach der Injektion für die PCNA Protein 22 ist. Mehr als 70% Aufgeld, wurde bis 3 Tage nach der Injektion 22 gesehen. Die Knockdown Kurven sind abhängig on das Niveau der Expression der endogenen Proteine ​​und die Effizienz der Morpholino-Moleküle, und muss für jedes Gen vom Experimentator bestimmt werden. In unseren Studien haben wir nicht sehen, dass das Verfahren CVMI das Überleben des Tieres beeinträchtigt, wahrscheinlich, weil die Verwaltung der Morpholino Moleküle ist lokal und nicht zu einer systemischen Toxizität. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des cerebroventricular Injektionstechnik. (A) Die Injektion von dorsal des erwachsenen Zebrafisch (1) auf der Ebene der optischen tectum (ot, 2) durchgeführt wird. Ein Schnitt wird über die Optik tectal Schädel Platte mit einer 30-Gauge-Nadel (3) gemacht. Mit Glaskapillaren sind die Morpholino-Moleküle in die ventrikuläre Fluid (4) eingespritzt wird. Eine gründliche Dispersion ist einsofort (5) chieved. (B) Die Kanüle und die Widerhaken-Ende in starker Vergrößerung dargestellt. (C) Die Ausrichtung der Nadel vor dem Einschnitt. (D) Der Schnitt eingekreist und mit gestrichelten Linien dargestellt. (E) Die Injektionskapillare befindet, wie gezeigt und Einspritzung durchgeführt. Alle Platten wurden aus ref angepasst. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vergleich der Injektion Effizienz und Genauigkeit. (A) gute Injektion führt zu Ausrichtung der Zellen in der Nähe der ventrikulären Oberfläche. (B) Wenn die Glaskapillare in das Hirngewebe eingeführt wird, wird diese erzeugen ein zentral gelegenes Fluoreszenzsignal. (C </strong&gt;) Wenn die Einspritzmenge ist gering, dafür wird die schwächere Fluoreszenz-Signal führen. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Abbildung 3. . Morpholino Penetration, die Effizienz der Gen Niederschlägen und funktionelle Konsequenzen (A) GFP Immunfärbung auf den telencephalic Querschnitte Kontrolle Tg (H2A: GFP)-Morpholino injiziert transgene Linie zeigt GFP-positive Kerne. (B) GFP Immunfärbung auf den telencephalic Querschnitte gfp Antisense Tg (H2A: GFP)-Morpholino injiziert transgene Linie zeigt GFP-positive Kerne. Man beachte den Unterschied in der GFP-Signal an der ventrikulären Region. v: Ventrikels. (C) PCNA Immunfärbung auf Kontrolle Morpholino-injizierten Gehirn zeigt weite Verbreitung von PCNA-positiven Zellen. ( <strong&gt; D) PCNA Immunfärbung auf PCNA Antisense-Morpholino-injizierten Gehirn zeigt deutlich reduzierte Mengen von PCNA-positiven Zellen, die zeigen, dass CVMI Can Knockdown endogenen Genen. (E) und BrdU HuC / D Immunfärbung auf Kontrolle Morpholino injiziert Gehirne neugeborener Neuronen nach einem BrdU Pulse-Chase-Experiment vor 22 beschrieben zu bestimmen. (F) und BrdU HuC / D Immunfärbung auf PCNA Antisense Morpholino injiziert Gehirne neugeborener Neuronen nach einem BrdU Pulse-Chase-Experiment vor 22 beschrieben zu bestimmen. (G) nach unten PCNA Klopfen führt zu einer signifikanten Verringerung der Erzeugung von neugeborenen Neuronen, die anzeigt, dass CVMI den Zuschlag endogener Gene, die Anlass zu funktionellen Folgen verwendet werden. Alle Platten wurden aus ref angepasst. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Morpholino-Oligonukleotide in das Hirnventrikel des adulten Zebrafischgehirns mikroinjizieren und die Aktivität von Genen in den radialen Gliazellen herunterregulieren zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst der Zebrafisch anästhesiert wird. Anschließend wird mit einer gezackten Zahnarztnadel ein Einschnitt im Schädel erzeugt, der über dem Optiktum liegt.Dann wird die Morpholino-Lösung über die Inzisionsstelle in die zerebrale Ventrikelflüssigkeit injiziert. Schließlich wird die Injektions-Effizienz und -Genauigkeit unter dem Fluoreszenzmikroskop überprüft. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die auf eine effiziente und weiträumige Blockade der Proteinproduktion aus den Genen von Interesse in den radialen Gliazellen des adulten Zebrafischgehirns durch morpholinovermittelte Genabschaltung hinweisen, die mittels histologischer Schnitte und immunhistochemischer Färbungen nachgewiesen werden kann.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie transgenen Ansätzen oder elektroporationsbasierten Abgabemethoden, besteht darin, dass die CVMI zeitsparender ist und effizienter die gesamte Population der radialen Gliazellen anspricht. Dabei können viele einstellbare Gene gleichzeitig herunterreguliert werden. Um die Injektionsmischung vorzubereiten, stellen Sie zunächst eine 500 Mikromolare Morpho-Stammlösung her.Unter Verwendung von PBS für 10 Injektionen bereiten Sie 10 Mikroliter Injektionslösung vor, indem Sie neun Mikroliter verdünnte oder unverdünnte Morpholösung mit einem Mikroliter eines fluoreszierenden Markierungsfarbstoffs mischen. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen Nadelzieher, um Glasinjektionskapillaren gemäß der folgenden Parameter herzustellen.Schalten Sie die Druckquelle ein und stellen Sie den Druck auf 50 PSI oder 3,5 bar ein. Stellen Sie die Einstellungen des Mikroinjektors wie folgt ein: Halte-Druck 20 PSI, Ausstoß-Druck 10 PSI, Periodenwert 2,5 und 100 Millisekunden.Bereich der Gating. Schalten Sie den Ringbeleuchter ein und positionieren Sie den Ring über dem Mikroskoptisch. Stellen Sie den Kapillarhalter an einer geeigneten Position neben dem Mikroskop ab.Setzen Sie die Glas-Kapillare in den Halter ein und stellen Sie den Injektionswinkel auf 45 Grad ein. Brechen Sie mit einer Findend-Pinzette die Spitze der Glas-Kapillare ab und kalibrieren Sie den Druckausgang an der Öffnung. Durch Eintauchen der Nadelspitze in das Fischwasser und Aufbringen eines kontinuierlichen Druckimpulses sollten sich Luftblasen in einer einzelnen Reihe bilden, was auf einen optimalen Druck oder eine optimale Öffnungsgröße hinweist.Füllen Sie die Glas-Kapillare mit der Injektionslösung. Um Luftblasen zu vermeiden, üben Sie Druck aus, um die Luft zwischen der Spitze der Glas-Kapillare und der gefüllten Injektionslösung zu entfernen. Nachdem Sie eine 0,1 %ige Stammösung des Anästhetikums Meab hergestellt haben, überführen Sie die gewünschte Anzahl von Fischen in einen Transportbehälter mit Fischwasser.Bereiten Sie eine Arbeitslösung des Anästhetikums zu, indem Sie 200 Milliliter Fischwasser mit fünf Millilitern MISP-Stammlösung mischen. Füllen Sie eine Petrischale zur Hälfte mit dem Anästhetikum, das für Injektionen verwendet wird. Inkubieren Sie einen Fisch in dem Anästhetikum, bis er sich nicht mehr bewegt.Verwenden Sie dann ein Netz, um den Fisch in die Petrischale mit Anästhetikum zu überführen. Um den Einschnitt zu erleichtern, halten Sie den Fisch vorsichtig mit der Pinzette fest und positionieren Sie ihn so, dass der Kopf leicht nach unten geneigt ist. Erzeugen Sie mit der Spitze einer mit Widerhaken versehenen Nadel mit 30 Gauge eine kleine Öffnung am Schädel, ohne dabei zu tief einzudringen, da dies das Gehirngewebe beschädigen könnte.Während der Fisch weiterhin festgehalten wird, die Spitze der Glaskapillare etwa einen halben Millimeter tief durch die Einschnittstelle einführen und unter Vermeidung von Kontakt mit dem Gehirngewebe in Richtung Cephalon ausrichten. Die Lösung injizieren, wobei sie sich sofort verteilen sollte. Den Fisch in frisches Fischwasser überführen und seine Erholung zulassen.Etwa 30 Minuten später das Fisch erneut anästhesieren und unter einem Fluoreszenzmikroskop auf eine weitverbreitete Verteilung der Flüssigkeit prüfen. Basierend auf roter Fluoreszenz. Den Fisch anschließend in seinen Behälter zurückbringen und erneut in den Kreislauf geben.Bis zur Verwendung für Verhaltensanalysen oder zur Herstellung von Gewebeproben wie hier gezeigt, führt eine präzise Injektion zur Verteilung der injizierten Lösung im gesamten Gehirn und ermöglicht eine effiziente Ansteuerung der Zellen nahe der Ventrikeloberfläche. Bei Injektionen jedoch, bei denen die Glas-Kapillare das Gehirngewebe verletzt, zeigt sich ein dichtes fluoreszierendes Signal an der Injektionsstelle. Und wenn die injizierte Menge nicht ausreicht, wird ein schwaches fluoreszierendes Signal beobachtet.Diese Abbildung zeigt, dass vivo-Morphos einige Zelldurchmesser tief in die ventrikuläre Oberfläche eindringen können und somit im Vergleich zum Kontroll-Morpho die ventrikulären Zellen effizient ansprechen. Die Injektion eines gegen PCNA gerichteten Morphos reduziert den Genexpressionsgrad in den ventrikulären Zellen wirksam. In diesen Immunfluoreszenzbildern zeigen BRDU- und QCD-Immunfärbungen nach dem A-B-R-D-U-Puls-Chase-Versuch, dass die Herunterregulation von PCNA mittels Antisense-Morphosen zu einer signifikanten Verringerung neugebildeter Neuronen führt, was darauf hindeutet, dass CVMI verwendet werden kann, um endogene Gene zu hemmen, was anschließend funktionelle Konsequenzen nach sich zieht.So ebnete diese Technik nach ihrer Entwicklung den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die molekularen Mechanismen zu erforschen, die an der regenerativen Neurogenese im adulten S-Gehirn von Fischen beteiligt sind.

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Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.

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Dieses Video zeigt, wie Morpholino-oder mRNA in Zebrafisch-Embryonen können bei der Ein-Zell-Stadium zu verringern oder zu erhöhen das Niveau der spezifischen Genprodukte bei der späteren Entwicklung injiziert werden.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

Eine Methode, um Morpholinos direkt liefern in der Zebrafisch otocyst bei 24hpf entwickelt worden. Mit Mikroinjektion von Morpholinos in das Lumen des otic Vesikel und Elektroporation, um das Eindringen Effekt, konnten wir die Wirkung von Morpholinos auf das Gehirn zu umgehen und erhalten Wirkungen, die spezifisch an das Innenohr.

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In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

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Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

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