Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein bestimmtes Protein im Rattengewebe anzugreifen. Dies wird erreicht, indem das Gewebe zunächst isoliert, fixiert und paraffineingebettet wird, gefolgt von einem Durchtrennen des Gewebes und dessen Montage auf Objektträgern. Der zweite Schritt besteht darin, die in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte zu deparaffinisieren und zu rehydrieren und dann die endogene Peroxidase zu blockieren.

Als nächstes werden die Epitope durch Antigen-Retrieval freigelegt. Anschließend wird eine Blockierung durchgeführt, um die unspezifische Bindung vor der Einführung der Antikörper zu reduzieren. Der letzte Schritt besteht darin, das spezifische Epitop durch Immunmarkierung mit primären und sekundären Antikörpern zu detektieren und das Signal des markierten Sekundärantikörpers zu entwickeln.

Abschließend wird das Signal mit Hilfe der Lichtmikroskopie sichtbar gemacht, um das Lokalisierungsmuster des Proteins in den Gewebeschnitten zu zeigen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Lokalisations- und Expressionsmuster von Proteinen im zentralen Nervensystem der Ratte und in den peripheren Lymphknoten geben kann, kann sie auch auf andere Organe und Spezies angewendet werden. Zur Demonstration des Verfahrens wird ein Techniker eingesetzt.

Ihr Name ist Katalin Benedek aus der Core Facility des Zentrums für Mikrobiologie Tumor- und Zellbiologie am Karolinska Institutet. Um mit der Gewebepräparation zu beginnen, tauchen Sie das präparierte Gehirn-, Rückenmarks- und periphere Lymphknotengewebe in vier Prozent Paraformaldehyd und legen Sie es 24 Stunden lang auf vier Grad Celsius. Nachdem das Gewebe fixiert ist, übertragen Sie das Gewebe in P-B-S und lagern Sie es bis zur weiteren Verarbeitung bei vier Grad Celsius.

Um mit der Verarbeitung des Gewebes zu beginnen, schneiden Sie das Gewebe mit einer Rasierklinge in etwa fünf Millimeter große Portionen. Initiieren Sie dann den Prozess der Gewebehärtung mit einem Vakuuminfiltrationsprozessor. Das Standardverfahren basiert auf dem Eintauchen in aufsteigende Konzentrationen von Ethanol, gefolgt von Xylol und schließlich Paraffin.

Legen Sie dann das Taschentuch in eine Form. Gießen Sie das flüssige Paraffin um die Probe herum, um einen Paraffinblock zu bilden, und lagern Sie es bei Raumtemperatur. Vor dem Schneiden des Gewebes den Paraffinblock über Nacht auf der Kühlplatte oder im Kühlschrank abkühlen lassen.

Nachdem der Paraffinblock abgekühlt ist, legen Sie den Block in die feste Halterung eines Schlittenmikrotoms, das sich über ein Messer hin und her bewegen kann. Stellen Sie dann den Block und das Mikrotommesser auf den optimalen Winkel ein, der von der Messergeometrie und der Schnittgeschwindigkeit und -technik abhängt. Schneiden Sie drei fünf Mikrometer dicke Querschnitte aus dem Paraffinblock ab.

Übertragen Sie dann die geschnittenen Abschnitte in einen Wasserbehälter und montieren Sie die Abschnitte aus dem Wasser auf einen handelsüblichen vorbeschichteten selbstklebenden Glasobjektträger. Drücken Sie anschließend das montierte Teil vorsichtig gegen ein Papiertuch, um Wasserreste und mögliche Luftblasen zu entfernen. Trocknen Sie die montierten Dias einige Stunden lang in einem Ofen, der auf 50 bis 60 Grad Celsius eingestellt ist.

Sobald die Objektträger trocken sind, tauchen Sie die Objektträger zweimal für jeweils 15 bis 20 Minuten in Xylol. Spülen Sie dann jeden Objektträger mit 99 Prozent Ethanol. Um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren, inkubieren Sie die Schnitte 30 Minuten lang in einer Methanollösung, die 0,25 Prozent Wasserstoffperoxid enthält.

Fahren Sie dann mit der Rehydrierung der Gewebeabschnitte fort, indem Sie sie mit Ethanollösungen spülen, die einen zunehmenden Wassergehalt enthalten. Führen Sie den letzten Rehydratisierungsschritt in destilliertem Wasser durch. Achten Sie darauf, die Abschnitte feucht zu halten, bis die Deckgläser montiert sind.

Um das Antigen zu gewinnen, erhitzen Sie die Objektträger mit einem Haushaltsdampfer und EDTA-Puffer bei pH 8,5 für 60 Minuten. Kühlen Sie die Objektträger dann etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur ab. Sobald die Objektträger abgekühlt sind, spülen Sie jeden Objektträger drei- bis fünfmal in Tris-gepufferter Kochsalzlösung oder T-B-S aus.

Anschließend werden die Gewebeschnitte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Blockierungslösung inkubiert, die 10 Prozent fötales Kälberserum und 90 Prozent Waschpuffer enthält, um unspezifische Hintergrundreaktionen zu blockieren. Nachdem die Gewebeschnitte blockiert wurden, verdünnen Sie die erforderliche Menge an Primärantikörpern in der Blockierungslösung und inkubieren Sie die Objektträger in dieser Primärantikörperlösung über Nacht bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die Objektträger am nächsten Tag drei- bis fünfmal mit T-B-S-Puffer aus.

Dann inkubieren Sie die Objektträger mit Sekundärantikörpern, die in der Blockierungslösung verdünnt sind, eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Objektträger anschließend erneut drei- bis fünfmal mit T-B-S-Puffer aus. Inkubieren Sie dann die Objektträger mit dem Avidin Meerrettich-Peroxidase-Komplex, verdünnt um eins auf 100 in der Blockierungslösung, für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Sobald die einstündige Inkubation abgeschlossen ist, spülen Sie die Objektträger drei- bis fünfmal mit T-B-S-Puffer aus. Nach der Zubereitung der schnellen blauen Lösung, wie im Textprotokoll beschrieben, schütteln Sie die Schale leicht und filtrieren Sie die erhaltene Mischung. Gießen Sie die Lösung auf die Objektträger in der Glasküvette.

Beginnen Sie die Inkubation bei 37 Grad Celsius und beobachten Sie den Entwicklungsprozess alle 15 bis 30 Minuten unter dem Lichtmikroskop. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, spülen Sie die Objektträger drei- bis fünfmal mit T-B-S-Puffer und überführen Sie die Objektträger anschließend in P-B-S-Puffer. Um die D-A-B-Wasserstoffperoxid-Entwicklungslösung herzustellen, verdünnen Sie zunächst einen Milliliter einer D-A-B-Stammlösung in 49 Millilitern P-B-S.

Fügen Sie 16,5 Mikroliter Wasserstoffperoxid hinzu und filtrieren Sie dann die Lösung. Gießen Sie die Lösung auf die Objektträger und stellen Sie sicher, dass Sie den Entwicklungsprozess unter dem Lichtmikroskop kontrollieren, um einen hohen Hintergrund zu vermeiden, der das spezifische Signal überdecken kann. Spülen Sie dann die Objektträger drei- bis fünfmal mit P-B-S aus, gefolgt von einer abschließenden Wäsche mit destilliertem Wasser oder Leitungswasser.

Montieren Sie die Dias mit Deckgläsern direkt aus dem Wasser mit wässrigem Eindeckmedium. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen zwischen dem Deckglas und der Folie. Nach der Montage der Sektionen die Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren, damit das Einbettmedium vollständig trocknen kann.

Lagern Sie die getrockneten Objektträger bei Raumtemperatur. Die doppelte Färbung von peripheren Lymphknotengewebeschnitten, die am siebten Tag nach der Immunisierung von Ratten isoliert wurden, zeigte, dass cd8-positive T-Lymphozyten das Chemokin C-C-L 11 nicht sezernierten. Alternativ wurde festgestellt, dass C-C-L 11 mit E-D eins, einem Marker für lysosomales Protein in aktivierten Makrophagen, kolokalisiert.

Die I-H-C-Doppelfärbung des Rückenmarks einer Ratte identifizierte die Produktion von C-C-L elf in neuronalen Perikaryen, Dendriten und Axonen, nicht jedoch in I-B-A eins-positiven Makrophagen und hirnresidenten Mikrogliazellen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Mehrheit der E-D-1-positiven Makrophagen und der im Gehirn ansässigen Mikrogliazellen nicht C-C-L 11-positiv war. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein spezifisches und zuverlässiges immunhistochemisches Targeting des Proteins direkt in Gewebeschnitten durchführen können.