Name: Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Lernen Sie die doppelte Immunfärbung in formalinfixierten, paraffineingebetteten Ratten-Gewebeschnitten des ZNS und peripherer Lymphknoten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Proteinlokalisationen.

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Wir danken Hans Lassmann und Jan Bauer für ihre Anleitung und Unterstützung. Wir danken auch Katalin Benedek für die hervorragende technische Unterstützung und Caroline Westerlund für die kritische und sprachliche Würdigung.
Diese Studie wurde durch Zuschüsse von Biogen Idec, der Wenner-Gren-Stiftung, dem Schwedischen Forschungsrat, der Schwedischen Vereinigung von Menschen mit neurologischen Behinderungen, der Schwedischen Gehirnstiftung, dem 6. EU-Rahmenwerk EURATools (LSHG-CT-2005-019015) und Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637) unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

Ethische Erklärung Vorliegenden Studie ist es in Übereinstimmung mit den Richtlinien des schwedischen National Board für Versuchstiere und der Europäischen Gemeinschaft Richtlinie (86/609 / EWG) unter den ethischen Genehmigungen durchgeführt N338 / 09, N15 / 10 und N65 / 10, die durch die genehmigt Nord Stockholm Tierethikkommission. 1. Gewebepräparation <ol><li> Perfusions &amp; Fixierung <ol><li> Anesthetize das Tier mit Isofluran transkardialer Perfusion über linken Ventrikels durchzuführen. Initiieren Spülen von Gefäßen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um die Blutbestandteile zu entfernen, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (PFA). </li><li> Fixieren Sie seziert Gehirn, Rückenmark und periphere LN Gewebe durch in PFA eingetaucht wird. Nach 24 Stunden bei 4 ° C, übertragen das Gewebe aus PFA in PBS und lagern bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung. Alternativ zu kommerziellen PBS, lösen sich 9 g NaCl in 250 ml der S &amp;# 246; rensen Puffer und 750 ml VE - Wasser (dH 2 O) hinzuzufügen; 0,2 M Sörensen - Puffer (pH 7,4) lösen sich 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O und 71,2 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O in 2,5 l dH 2 O. vorzubereiten </li></ol></li><li> Dehydration &amp; Einbetten <ol><li> Schneiden Sie das Gewebe in etwa 5 mm dicke Abschnitte mit einer Rasierklinge. </li><li> Initiieren des Gewebes Härtungsprozess (Dehydratisierung) , indem das Tissue-Tek VIP Vakuuminfiltrationsprozessor verwendet (Standardverfahren basierend auf Eintauchen in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol, gefolgt von Xylol und schließlich Paraffin (Tabelle 1). </li><li> Legen Sie das Gewebe in eine Form und gießen in dem flüssigen Paraffin um die Probe eine &quot;Paraffinblock&quot; zu bilden. Langzeitlagerung erfordert Raumtemperatur (RT). Jedoch vor dem Schneiden ist es empfehlenswert , die Blöcke zu kühlen, beispielsweise über Nacht (o / n) bei 4 ° C.</li></ol></li></ol> 2. Sectioning <ol><li> Platzieren Sie den Paraffinblock in eine feste Halterung des Schlittens Mikrotom, die hin und her über das Messer bewegen kann. Stellen Sie den optimalen Winkel zwischen dem Block und dem Mikrotom-Messer (das hängt von Messergeometrie, sondern auch auf der Schnittgeschwindigkeit und Technik). </li><li> Schneiden Sie 3 bis 5 um dicke Querschnitte aus dem Paraffinblock. </li><li> Übertragen Sie einfach schneiden Abschnitt in einen Wasserbehälter und montieren Sie ihn anschließend aus dem Wasser auf den Glasträger. </li><li> Drücken Sie die montierten Abschnitt sorgfältig gegen ein Papiertuch Restwasser und mögliche Luftblasen zu entfernen. Im Handel vorbeschichteten sind Klebstoff Glasobjektträger zu empfehlen. </li><li> Trocken gerahmte Dias für ein paar Stunden in einem Ofen 50 - 60 ° C. </li></ol> 3. Entparaffinierung (Rehydrierung &amp; Blockierung der Endogene Peroxidase) <ol><li> Tauchen Sie die Dias 2x in Xylol (alternativ XylolersatzXEM-200), jedes Mal 15 bis 20 &#39;. </li><li> Spülen in 99% Ethanol. </li><li> Um die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren, inkubiere die Abschnitte 30 &#39;in Methanollösung, die 0,25% Wasserstoffperoxid. </li><li> Weiter Rückfettung durch Ethanol mit steigendem Wassergehalt unter Verwendung von (99%, 70%, endet in destilliertem Wasser. </li><li> Von diesem Punkt der Abdeckung bis Montage schlüpft Abschnitte feucht gehalten werden müssen. </li></ol> 4. Antigen Retrieval <ol><li> Verwenden Sie einen Dampfgarer zum Kochen Sie die Folien in einer Antigen - Retrieval - Lösung (in diesem Fall EDTA pH 8,5 - Puffer) für 60 &#39;(EDTA Puffer - Stammlösung enthält 1,21 g Tris und 0,37 g gelöst EDTA in 50 ml dH 2 O; zur Herstellung des Arbeits Lösung verdünnte 2,5 ml EDTA - Stammlösung in 47,5 ml dH 2 O). </li><li> Das Abkühlen der die Folien auf RT ca. 1 Stunde und dann spülen 3 - 5-fach mit Tris-gepufferte Salzlösung (TBS, verwenden Sie alternativ PBS), bestehend aus 0,05 M Tris und 0,15 M NaCl; pH-Wert 7,5 eingestellt with HCl. Alternativ kommerzielle TBS verwenden. </li></ol> 5. Das Blockieren der unspezifischer Bindungsstellen <ol><li> Zur Vermeidung von unspezifischen Hintergrundreaktionen, inkubiere die Abschnitte auf RT für 30 &#39;in der blockierenden Lösung, die 10% fötales Kälberserum (FCS) und 90% DAKO Puffer enthält. </li></ol> 6. Doppelimmunmarkierung: Die gleichzeitige Inkubation mit dem primären Abs <ol><li> Verdünnte erforderliche Menge an primären Antikörper in der Blockierungslösung und Inkubieren o / n bei 4 ° C. Für die Doppelimmunfärbungs kombinieren α-Eotaxin (CCL11; 1: 300) mit α-CD68 (Ed1; 1: 1000) oder α-Iba1 (AIF1, 1: 1000) oder α-CD8a (Ox-8; 1: 200) . </li><li> Spülen Sie die Folien 3-5x mit TBS-Puffer (verwenden Sie alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer). </li><li> Verdünnte erforderliche Menge an sekundärem Antikörper (biotinylierter anti-Ziege und AP-konjugiertem Anti-Maus, die beide 1: 200) in der Blockierungslösung und inkubiere 1 h bei RT. </li><li> Spülen Sie die Folien 3 - 5-fach mit TBS-Puffer (use alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer). </li><li> Inkubieren der Objektträger mit Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex (HRP) in der Blockierungslösung für 1 Stunde bei RT verdünnt. </li><li> Spülen Sie die Folien 3 - 5x mit TBS-Puffer (verwenden Sie alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer). </li></ol> 7. Visualisierung <ol><li> Visualisierung des gebundenen AP-markierten sekundären Antikörper <ol><li> Bereiten 0,1 M Tris-HCl - Puffer durch Lösen von 12,1 g Tris in 1 l dH 2 O und pH - Wert auf HCl unter Verwendung von . Verwenden Sie die gleiche Tris-HCl-Puffer 1 M levamisole Lösung herzustellen. Bereiten Sie frisch 4% NaNO 2 -Lösung in dH 2 O. </li><li> Zur Erzielung 50 ml des Fast Blue (FB) Substrat (Volumen erforderlich für eine Standard-Glasküvette) auflösen 6,25 mg Naphtol-AS-MX-Phosphat in 312,5 ul DMF in der Glasröhre und rühren in 50 ml vorgewärmten (37 ° C) Tris-HCl-Puffer. in 312,5 ul 2 N HCl hinzufügen 312,5 ul zuvor 12,5 mg FB RR Salz zu lösen preparot 4% NaNO 2 Lösung und rühren Sie die Mischung in den gleichen 50 ml vorgewärmtes Tris-HCl - Puffer. Schütteln Sie leicht, bis die gelbe Flüssigkeit klar wird, und fügen Sie schließlich 77 ul zuvor hergestellten 1 M Levamisol Lösung. Das Filtrat erhaltene Mischung und gieße auf platziert Folien in der Glasküvetten. </li><li> Initiieren Sie die Inkubation bei 37 ° C und Kontrollprozess unter dem Lichtmikroskop zu entwickeln ca.. alle 15 - 30 min. Wenn Fuzzy-Drehen, ersetzen Sie die FB-Lösung mit der frischen Mischung. </li><li> Spülen Sie die Folien 3 - 5-fach mit TBS-Puffer und Transfer anschließend in PBS-Puffer. </li></ol></li><li> Visualisierung des gebundenen biotinylierten sekundären Antikörper <ol><li> Bereiten DAB / H 2 O 2 Entwicklungslösung , die durch Verdünnen von 1 ml DAB - Stammlösung (25 mg DAB pro 1 ml PBS) in 49 ml PBS. Fügen 16,5 &amp; mgr; l H 2 O 2 und das Filtrat vor Gießen auf Abschnitte. </li><li> Die Umwandlung des Chromogens DAB in Ausfällen Stirnn Pigment kann sofort erfolgen. Steuern Sie den Entwicklungsprozess unter dem Lichtmikroskop (sogar einige Sekunden längere Inkubationszeit kann einen hohen Hintergrund erhöhen und die Maske das spezifische Signal). </li><li> Die Intensität des braunen Pigmentes Niederschlag kann alternativ durch Inkubation in 2% Kupfersulfat und 0,9% NaCl für 5 &#39;, die aus Lösung verbessert werden. </li><li> Spülen Sie die Folien 3 - 5x mit PBS und schließlich mit dH 2 O, verwenden Sie alternativ Leitungswasser. </li><li> Montieren Sie die Folien mit Deckel direkt aus dem Wasser gleitet durch die Verwendung wässriger GelTol Eindeckmediums. Vermeiden Sie Luftblasen zu schaffen. </li><li> Ermöglichen eine vollständige Trocknung des Befestigungsmedium, beispielsweise o / n bei 4 ° C. Shop getrockneten Folien auf RT. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1. </td><td> % Ethanol </td><td> 20 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 2. </td><td> % Ethanol </td><td> 60 &amp;# 39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 3. </td><td> % Ethanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 4. </td><td> % Ethanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 5. </td><td> % Ethanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 6. </td><td> % Ethanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 7. </td><td> % Ethanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 8. </td><td> % Ethanol </td><td> 120 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 9. </td><td> Xylol </td><td> 30 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 10. </td><td> Xylol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 11. </td><td> Paraffin </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 12. </td><td> Paraffin </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 13. </td><td> Paraffin </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 14. </td><td> Paraffin </td><td> 120 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Gewebeverarbeitung von Tissue-Tek VIP Vakuuminfiltrationsprozessor.

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<li>Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+endogenous+biotin-containing+proteins+in+mouse+Bergmann+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells.</a> The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).</li>
<li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Immunohistochemical+Staining+Today%3A+Choices+to+Make%2C+Challenges+to+Take%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Standard-immunhistochemischen Verfahren erfordern häufig spezifische Anpassungen ein optimales Ergebnis zu erzielen, die häufig umfangreiche Erfahrung beinhaltet, sondern auch &quot;trial and error&quot; -Ansatz. Von Gewebeaufbereitung bis Target-Visualisierung, fast jeder Schritt in dem Protokoll können einzeln unterzogen werden, um entworfen Modifikationen, um das Endergebnis zu verbessern. Doppelfärbung Protokoll hier vorgestellten Beispiel für IHC-basierte Protein besonders angepasst Targeting durch neuroinflammatio...

Trotz Nutzung moderner Hochdurchsatzanalysen auf der Methylom, Transkriptom oder sogar Proteom-Ebene durchgeführt, Immunfärbung bleibt der Goldstandard für die Proteindetektion direkt in der Gewebeprobe, Zellkultur oder einer Zellabstrich. Durch die Offenlegung der Lokalisierung / Verteilungsmuster, Immunhistochemie (IHC) beurteilen kann relativen Verhältnisse und topographischen Zusammenhänge der Zielproteine ​​und sogar zeigen ihre biologischen Aktivitäten. Daher wird IHC breit für klinische und Forschungszwecke verwendet, beispielsweise zur Diagnose, Behandlung Evaluationen Untersuchung von Krankheitsmechanismen, funktionale und phänotypische Veränderungen in Tiermodellen, usw. Im wesentlichen Histologie, Pathologie, Biochemie und Immunologie umfasst, hat IHC signifikant seit 1941 fortgeschritten, wenn fluoreszierend markierte Antikörper zum ersten Mal verwendet wurden 1 Pneumokokken - Antigene in infizierten Gewebe zu identifizieren. Visualisierung von zellulären Produkten und Komponenten durch IHC basiert von Antikörpern (Abs) zu ihrem spezifischen Antigen (Ag) auf die Bindung. Neben der Verwendung von Fluorophor markierten Antikörper können Immunreaktionen auch unter Verwendung von Enzymen wie Peroxidase 2,3 oder alkalische Phosphatase 4 sichtbar gemacht werden. Ferner werden zum Nachweis spezifischer Antigen-Antikörper - Wechselwirkung von Licht und Elektronenmikroskopie, während radioaktive Markierungen sichtbar gemacht werden durch Autoradiographie kolloidales Gold-markiertem Antikörper 5 verwendet. Die Ag-Ab-Immunreaktion kann über direkte und indirekte Methoden erfasst werden. Die direkte Methode ist wesentlich schneller und einfacher, da es direkt primäre Abs 6 beschriftet verwendet. Jedoch aufgrund erheblicher Mangel an Empfindlichkeit, sind indirekte Methoden der direkten diejenigen bevorzugt. Zweischritt indirekten Nachweisverfahren unmarkiert erfordern primäre Abs, wie die erste, und markierten sekundären Abs gegen den primären Abs, als die zweite Schicht 7.Signalverstärkung kann durch die Einbeziehung weiterer, enzymgekoppelter tertiären Ab (dreistufigen indirekten Methode), das bindet an den sekundären Ab erreicht werden. Üblicherweise verwendete indirekte Nachweismethoden sind und Avidin-Biotin-Peroxidase-Antiperoxidase (PAP). Alternativ können alkalische Phosphatase-antialkaline Phosphatase (APAAP) -Komplex anstelle des PAP-Methode verwendet werden. Bemerkenswerterweise scheinen alkalischer Phosphatase (AP) Verfahren sogar als 4 Immunperoxidase Methoden empfindlicher zu sein. Avidin-Biotin-Komplex (ABC) -Methode verwendet biotinylierten sekundären Ab in Kombination mit entweder markiertem Avidin-Biotin-Komplex (LAB) oder Streptavidin-Biotin-Komplex (SLAB) markiert. Nachweisempfindlichkeit kann durch Avidin beteiligt mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase markiertem 8 erhöht werden. Andere Nachweisverfahren im Einsatz sind polymere Kennzeichnung, Tyramin - Amplifikation und Immuno-Rolling - Circle - 9. Bemerkenswerterweise können verschiedene Detektionsverfahren für mehrere Ag Detektions in demselben Gewebe kombiniert werden,Probe, die zum ersten Mal im Jahr 1978 4. Simultaneous Doppelimmunfärbungs präsentiert die hier berichtet wurde , wurde in Formalin fixierten, in Paraffin eingebettete Ratten CNS und LN Gewebeschnitten unter Verwendung von Peroxidase-gebundenen und AP-konjugiertem Sekundärantikörper jeweils durchgeführt. Die Signale wurden 3,3&#39;-diaminobencidine (DAB) Chromogen und die Fast Blue (FB) APAAP-Komplex sichtbar gemacht sind.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz</td></tr><tr><td>Isofluran (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethylether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O)</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td>Augenbestrahlung. Beeinflusst wahrscheinlich die Fruchtbarkeit und schädigt das Baby in der Gebärmutter. Nur in einer angemessen ausgestatteten Anästhesieumgebung verabreichen.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Merck</td><td>1.0604</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS), Tablette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS</td><td>Apl pharma</td><td>34 24 28</td><td>Gesundheitsgefahr. Ätzend. Flambierbar. Akute Toxizität.</td></tr><tr><td>Ethanol &#8805; 99.5%, absolut (CH3CH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td>Flambable.</td></tr><tr><td>Xylol (Xylole, histologischer Grad; C6H4(CH3)2 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Flamable. Akute Toxizität.</td></tr><tr><td>Histo-Comp Paraffinwachs</td><td>Tissue-Tek</td><td>V0-5-1001</td><td></td></tr><tr><td>Selbstklebende Objektträger</td><td>Starfrost</td><td>MIC-1040-W</td><td></td></tr><tr><td>Xylol-Ersatz XEM-200 </td><td>Vogel GmbH</td><td>ND-HS-200</td><td>Sensibilisierung der Atemwege. Kanzerogenität.</td></tr><tr><td>&alpha;-CD8 (Ox-8) Maus Anti-Ratte, Primärantikörper</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA48G</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Iba1 (AIF1) Maus Anti-Ratte, Primärantikörper</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD68 (ED1) Maus Anti-Ratte, Primärantikörper</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA341R</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Eotaxin C-19 (CCL11) Ziege Anti-Ratte, Primärantikörper</td><td>Santa Cruz BT</td><td>SC-6181</td><td></td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase (AP)-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Dakopatts, Dänemark</td><td>D0314</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierter Sekundärantikörper</td><td>Amersham Biotech</td><td>RPN1025</td><td></td></tr><tr><td>Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex (HRP) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3151</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol AS-MX-Phosphat (C19H18NO5P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875-1G</td><td>Akute Toxizität.</td></tr><tr><td>Fast Blue RR Salz, Azoic Diazo Nr. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FBS25</td><td></td></tr><tr><td>Levamisolhydrochlorid (C11H13ClN2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>Akute Toxizität.</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB Chromogen)</td><td>DAKO</td><td>S3000</td><td>Leicht entzündlich. Giftig.</td></tr><tr><td>Kupfersulfat (CuSO4)</td><td>Merck</td><td>1.02791</td><td>Akute Toxizität. Umweltgefahr.</td></tr><tr><td>GelTol Wässriges Eindeckmedium</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>230100</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid, 30% (H2O2)</td><td>Merck</td><td>107210</td><td>Akute Toxizität.</td></tr><tr><td>Methanol (CH3OH)</td><td>Fluka</td><td>65543</td><td>Akute Toxizität. Sensibilisierung der Atemwege. Kanzerogenität. Brennbar.</td></tr><tr><td>Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan, TRIS Base (C4H11NO3 )</td><td>AppliChem</td><td>A1379</td><td>Haut- und Augenreizungen.</td></tr><tr><td>Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS), Tablette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td></td></tr><tr><td>Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.0658</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 x 1H2O) </td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS) </td><td>Cambrex BioScience</td><td>DE-14-802F</td><td></td></tr><tr><td>DAKO Zytomationswaschpuffer 10x </td><td>DAKO</td><td>S3006</td><td>Sollte bei 2-8 & Grad gelagert werden; C zur Hemmung des Bakterienwachstums. Vermeiden Sie Schaumbildung.</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid; ZMS (C3H7NO)</td><td>Fluka</td><td>40250</td><td>Entzündlich. Akute Toxizität.</td></tr><tr><td>Glas-Deckgläser 24 x 36 mm </td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td><td>BB024036A1</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure, konz. (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>Korrosiv, reizend, permeatorisch. Lungensensibilisator (als saurer Nebel). Giftig.</td></tr><tr><td>Salzsäurelösung volumetrisch, 2 M HCl (2 N)</td><td>Fluka</td><td>71826</td><td>Ätzend, reizend, permeatorisch. Lungensensibilisator (als saurer Nebel). Giftig.</td></tr><tr><td>Natriumnitrit, ReagentPlus, &#8805; 99,0% (NaNO2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2252</td><td>Oxidationsmittel. Giftig. Gefährlich für die Umwelt.</td></tr><tr><td>Ethylendinitriltetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.08454</td><td>Orale Exposition kann Auswirkungen auf die Fortpflanzung und die Entwicklung haben.</td></tr><tr><td colspan="4"> Ausrüstung</td></tr><tr><td>Tissue-TekV.I.P Vakuum-Infiltrationsprozessor</td><td>Sakura</td><td>5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz</td><td></td></tr><tr><td>Hacker-Bright 8000 Serie Base Sledge Mikrotom </td><td>Hacker-Instrumente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haushalts-Dampfgarer </td><td>Braun</td><td>MultiGourmet FS 20</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop </td><td>Leica Polyvar 2</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunhistochemische analyse im rat des zentralnervensystems und peripheren lymphknoten gewebeschnitte

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunhistochemie (IHC) bietet hochspezifische, zuverlässige und attraktive Protein-Visualisierung. Korrekte Durchführung und Interpretation einer IHC-basierten Mehrfarbenkennzeichnung ist anspruchsvoll, insbesondere dann, wenn für die Beurteilung der Zusammenhänge zwischen Zielproteine ​​in das Gewebe mit einem hohen Fettgehalt, wie beispielsweise das zentrale Nervensystem (ZNS) verwendet. Unser Protokoll stellt eine Weiterbildung der Standard Immunomarkierung Technik besonders angepasst für den Nachweis von sowohl strukturelle als auch lösliche Proteine ​​in der Ratte ZNS und peripheren Lymphknoten (LN) durch Neuroinflammation betroffen. Dennoch mit oder ohne weitere Modifikationen, könnte unser Protokoll wahrscheinlich für die Erkennung von anderen verwandten Protein-Targets verwendet werden, auch in anderen Organen und Arten als hier dargestellt.

Doppelimmunfärbungen (co-Anfärbungen) wurden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Ratten CNS und LN Abschnitten durchgeführt. 3-5 um dicke Gewebeschnitte wurden mit einem Schlitten Mikrotom geschnitten, vorbeschichtete Klebeglasobjektträger aufgebracht anschließend auf und behandelt wie zuvor 10,11,12 beschrieben. Kurz gesagt, nach deparaffinizing, Gewebe Rehydratation und endogene Peroxidase Inaktivierung wurden die Schnitte auf den Antigen-Retrieval-Verfahren unter...

Wir präsentieren hier ein optimiertes, detailliertes Protokoll für die Doppelimmunfärbung in Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten des Zentralnervensystems (ZNS) und des peripheren Lymphknotens (LN) von Ratten.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein spezifisches Protein im Rattengewebe gezielt anzusteuern. Dies wird erreicht, indem das Gewebe zunächst isoliert, fixiert und in Paraffin eingebettet wird, woraufhin das Gewebe geschnitten und auf Objektträger aufgebracht wird. Der zweite Schritt umfasst die Deparaffinisierung und Rehydratation der paraffin-eingebetteten Gewebeschnitte und anschließend die Blockade der endogenen Peroxidase.Anschließend werden die Epitope durch eine Antigen-Retrieval-Behandlung freigelegt. Danach erfolgt eine Blockierung, um unspezifische Bindungen zu verringern, bevor die Antikörper hinzugefügt werden. Der letzte Schritt besteht darin, das spezifische Epitop durch Immunmarkierung mit primären und sekundären Antikörpern nachzuweisen und das Signal des markierten sekundären Antikörpers sichtbar zu machen.Schließlich wird das Signal mittels Lichtmikroskopie sichtbar gemacht, um den Proteinsublokalisierungsmuster in den Gewebeschnitten darzustellen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Proteinsublokalisierung und Expressionsmuster im zentralen Nervensystem der Ratte sowie in den peripheren Lymphknoten ermöglicht, kann sie ebenfalls auf andere Organe und Arten angewendet werden. Zur Demonstration des Verfahrens wird ein Techniker dienen.Ihr Name ist Katalin Benedek vom Kernfacility des Zentrums für Mikrobiologie, Tumorforschung und Zellbiologie am Karolinska Institutet. Um die Gewebevorbereitung zu beginnen, tauchen Sie das präparierte Gehirn, Rückenmark und periphere Lymphknotengewebe in vierprozentige Paraformaldehyd-Lösung ein und lagern Sie es 24 Stunden bei vier Grad Celsius. Nach der Fixierung des Gewebes überführen Sie es in P-B-S und lagern es bis zur weiteren Verarbeitung bei vier Grad Celsius.Um die Gewebeverarbeitung zu beginnen, schneiden Sie das Gewebe mit einer Rasierklinge in etwa fünf Millimeter große Stücke. Leiten Sie anschließend den Gewebeverhärtungsprozess mit einem Vakuuminfiltrationsgerät ein. Das Standardverfahren basiert auf der Einbettung in aufsteigende Konzentrationen von Ethanol, gefolgt von Xylol und schließlich Paraffin. Als Nächstes das Gewebe in eine Form geben. Die flüssige Paraffin um die Probe herum gießen, um einen Paraffinblock zu bilden, und bei Raumtemperatur lagern. Vor dem Schneiden des Gewebes den Paraffinblock über Nacht auf der Kühlplatte oder im Kühlschrank abkühlen lassen.Nachdem der Paraffinblock abgekühlt ist, wird der Block in den feststehenden Halter eines Schlittenmikrotoms eingesetzt, das vorwärts und rückwärts über ein Messer bewegt werden kann. Anschließend werden der Block und das Mikrotommesser auf den optimalen Winkel eingestellt, der von der Messergeometrie sowie der Schneidgeschwindigkeit und -technik abhängt. Schneiden Sie drei Querschnitte mit einer Dicke von jeweils fünf Mikrometern aus dem Paraffinblock.Überführen Sie die geschnittenen Abschnitte anschließend in einen Wasserbehälter und bringen Sie die Schnitte aus dem Wasser auf eine kommerzielle, vorgestrichene Haftglasobjektträger auf. Drücken Sie den aufgebrachten Schnitt danach vorsichtig auf ein Papiertuch, um restliches Wasser und mögliche Luftblasen zu entfernen. Trocknen Sie die präparierten Objektträger einige Stunden lang in einem Ofen bei 50 bis 60 Grad Celsius.Nachdem die Objektträger trocken sind, tauchen Sie diese zweimal für jeweils 15 bis 20 Minuten in Xylol ein. Anschließend spülen Sie jeden Objektträger mit 99-prozentigem Ethanol ab. Um die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren, inkubieren Sie die Schnitte 30 Minuten lang in einer Methanol-Lösung, die 0,25 Prozent Wasserstoffperoxid enthält.Danach fahren Sie mit der Rehydratisierung der Gewebeschnitte fort, indem Sie diese mit Ethanol-Lösungen abspülen, die einen zunehmenden Wasseranteil enthalten. Führen Sie den letzten Rehydratisierungsschritt in destilliertem Wasser durch. Stellen Sie sicher, dass die Schnitte bis zum Aufbringen der Deckgläser feucht gehalten werden.Um das Antigen freizusetzen, erhitzen Sie die Objektträger mit einem Haushaltsdampfgarer und EDTA-Puffer bei pH 8,5 für 60 Minuten. Anschließend kühlen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur für etwa eine Stunde ab. Sobald die Objektträger abgekühlt sind, spülen Sie jeden Objektträger drei bis fünfmal in Tris-gepufferter Salzlösung oder T-B-S.Als Nächstes inkubieren Sie die Gewebeschnitte 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer Blockierungslösung, die 10 Prozent fötales Kälberserum und 90 Prozent Waschpuffer enthält, um unspezifische Hintergrundreaktionen zu blockieren. Nach der Blockierung der Gewebeschnitte verdünnen Sie die erforderliche Menge an primären Antikörpern in der Blockierungslösung und inkubieren die Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius in dieser primären Antikörperlösung. Am nächsten Tag spülen Sie die Objektträger drei bis fünfmal mit TBS-Puffer aus.Anschließend die Objektträger mit sekundären Antikörpern, die in der Blockierungslösung verdünnt sind, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Danach die Objektträger erneut drei bis fünfmal mit TBS-Puffer spülen. Danach die Objektträger mit Avidin-Horseradish-Peroxidase-Komplex, der 1 zu 100 in der Blockierungslösung verdünnt ist, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.Nach Abschluss der einstündigen Inkubation spülen Sie die Objektträger drei bis fünfmal mit TBS-Puffer aus. Nachdem die schnelle Blau-Lösung wie im Textprotokoll beschrieben hergestellt wurde, schwenken Sie die Schale leicht und filtrieren Sie das erhaltene Gemisch. Gießen Sie die Lösung auf die Objektträger in der Glas Küvette. Beginnen Sie die Inkubation bei 37 Grad Celsius und beobachten Sie den Entwicklungsprozess alle 15 bis 30 Minuten unter dem Lichtmikroskop. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, spülen Sie die Objektträger drei bis fünfmal mit T-B-S-Puffer und überführen Sie die Objektträger anschließend in P-B-S-Puffer. Um die D-A-B-Wasserstoffperoxid-Entwicklungslösung herzustellen, verdünnen Sie zunächst ein Milliliter einer D-A-B-Stammlösung in 49 Milliliter P-B-S.Geben Sie 16,5 Mikroliter Wasserstoffperoxid hinzu und filtrieren Sie anschließend die Lösung. Gießen Sie die Lösung auf die Objektträger und kontrollieren Sie den Entwicklungsprozess unter dem Lichtmikroskop, um einen hohen Hintergrund zu vermeiden, der das spezifische Signal überdecken könnte. Spülen Sie die Objektträger danach drei bis fünfmal mit P-B-S und abschließend mit destilliertem Wasser oder Leitungswasser. Decken Sie die Objektträger direkt aus dem Wasser mit Deckgläsern ab, indem Sie ein wässriges Einbettmedium verwenden. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen zwischen Deckglas und Objektträger. Inkubieren Sie die Objektträger nach dem Abdecken über Nacht bei vier Grad Celsius, um eine vollständige Trocknung des Einbettmediums zu ermöglichen.Bewahren Sie die getrockneten Objektträger bei Raumtemperatur auf. Eine Doppelfärbung von peripheren Lymphknotenschnitten, die am siebten Tag nach der Immunisierung von Ratten isoliert wurden, zeigte, dass CD8-positive T-Lymphozyten das Chemokin C-C-L 11 nicht sekretierten. Alternativ wurde C-C-L 11 gemeinsam mit E-D eins lokalisiert, einem Marker für lysosomales Protein in aktivierten Makrophagen.Doppelte Färbung von I-H-C im Rückenmark einer Ratte zeigte die Produktion von C-C-L 11 in neuronalen Perikaryen, Dendriten und Axonen, jedoch nicht in I-B-A 1-positiven Makrophagen und im Gehirn residenten Mikrogliazellen. Zusätzlich wurde festgestellt, dass der Großteil der E-D 1-positiven Makrophagen und im Gehirn residenten Mikrogliazellen ebenfalls nicht C-C-L 11-positiv war. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine spezifische und zuverlässige immunhistochemische Markierung des Proteins direkt in Gewebeschnitten durchgeführt wird.

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