Name: Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung funktioneller menschlicher Kardiomyozyten aus iPS-Zellen mittels Embryoidkörper-Protokoll. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare kardiale Zellgenerierung für Forschung und Therapieansätze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

BS wurde von der Universität Mailand-Bicocca Summer Student Research Training Programm unterstützt, die Forschung wurde aus Mitteln des italienischen Gesundheitsministeriums und der italienischen Ministerium für Bildung, Universität und Forschung und Fondazione Humanitas GC unterstützt; wir dank Michael VG Latronico für die kritische Durchsicht der Manuskript.

1. Feeder-freie Wartung und Passagieren der menschlichen iPS-Zelllinien <ol><li> Bereiten Sie die Matrigel-beschichteten Schalen. Tauwetter ein Fläschchen des menschlichen ESC qualifizierte Matrix auf Eis für eine Stunde und verdünnen Sie es in 25 ml DMEM-F12 Medium. 1 ml bis 35 mm je Platte (oder äquivalente Mengen pro Fläche, wenn andere Gerichte verwendet werden), halten alles auf Eis und sicherzustellen, dass alle Platten und Rohre vorgekühlt sind. Die Platten mit Aluminiumfolie. </li></ol> Hinweis: Matrigel stock Konzentrationen je nach der Partie. Dilution Anweisungen auf dem Datenblatt angegeben. <ol start="2"><li> Halten Platten auf Eis über Nacht und entfernen von Eis am nächsten Tag. Die Platten können im Kühlschrank aufbewahrt werden, bis zu einer Woche vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie die mTESR1 Vollmedium (oder auftauen ein Fläschchen Nutristem mittel) und die H-ESM (human ESC mittel) gemäß der folgenden Tabelle. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> Endkonz. </td><td> Für 500 ml </td></tr><tr><td> Knockout Serum Replacement (KSR) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> MEM nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> 100 U / ml - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> 0,1 mM </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> B27 Supplement - ohne VitaminA </td><td> 1% </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> N2 Supplement </td><td> 1% </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> - </td><td> 370 ml </td></tr></tbody></table> Auf Medium kann bei 4 ° C für nicht mehr als 2 Wochen gelagert werden. Um eine vollständige Nährmedium herzustellen, wird nur vor dem basischen FGF hinzugefügte Fütterung in einer Endkonzentration von 20 ng / ml. </li></ol> Hinweis: Komplette H-ESM auf embryonale Maus-Fibroblasten bedingt kann anstelle mTESR1 oder Nutristem für iPS-Zellen verwendet werden. <ol start="4"><li> Platzieren beschichteten Platten im Brutschrank bei 37 ° C für 30 min bis 2 h vor Passage. </li><li> Die Zellen sollten passagiert etwa alle 5 Tage, auch wenn sie nicht Zusammenfluss erreicht. Kolonien sollten sich nicht berühren. </li><li> Ersetzen Nährmedium mit 1 ml Dispase (1 mg / ml, gelöst von einer 10 mg / ml Brühe in PBS). </li><li> Entfernen differenzierenden Bereiche mit gezogenem Glas Pasteur Pipetten. Bereiche, die entfernt werden sollten kraterförmige oder zystische Strukturen in der Mitte der Kolonien, und alle Bereiche, in denen Zellen werden aus Kolonien getrennt und abgeflacht zu sein scheinen Migration nach außen. </li><li> Bei 37 ° C unter einer Kultur Haube bis Kolonie Grenzen heller geworden und beginnen zu lösen (in der Regel ca. 5-7 min). Discard Dispase. Waschen mit 1 ml H-ESM und zu verwerfen. </li><li> In 1 ml H-ESM, verwenden Sie eine Zelle Heber (Spachtel-wie Schaber) zur Ernte Kolonien und sammeln sich in einem 15 ml Eppendorf-Röhrchen. Spülen mit 1 ml H-ESM und zu dem Rohr. Spin bei 1.000 rcf für 4 min und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Pellet in 1 ml vorgewärmten Wachstumsmedium (entweder mTESR1 oder Nutristem). Vermeiden Aufbrechen Klumpen zu viel - und Abpipettieren weniger als 6-8x. Ermitteln Sie, wie viele Zellen sollten überzogene und unnötige Zellen (in der Regel 1.04 oder 1:5 Verdünnung), für 2 Platten bei 1.05 zB, entfernen Sie 600 ul, dann fügen Sie 1,6 ml frisches Medium. </li><li> Entfernen Matrigel von Platten. Platz Zellen durch tropfenweise verteilen gleichmäßig auf der Platte. Vermeiden Sie Schütteln der Röhre übermäßig, da dies dazu führen, Zellen in Richtung Zentrum bewegen. </li><li> Waschen Rohr mit 1 ml Medium und Kluft zwischen den Platten. Das endgültige Volumen in jeder Platte sollte 1,5 -2 ml betragen. </li><li> Ändern Medium jeden Tag, außer für den Tag nach Passagieren. Obwohl esideal, um das Medium täglich ändern, kann dies gelegentlich bei einer Frequenz von einmal alle zwei Tage gewechselt werden, wenn nicht mehr als 2-3 Tage seit dem letzten Durchgang, ohne die Pluripotenz oder Differenzierungspotentials bestanden haben. </li><li> Wenn die Zelllinie müssen eingefroren werden, statt erneut zu suspendieren in 1-2 ml mFreSR Einfrieren Medium unter Verwendung einer 2 ml Pipette und Platz 1 ml / cryovial. Platz in einem Fläschchen Gefriertruhen bei -80 ° C und Transfer zum flüssigen Stickstoff in 3-4 Tagen. </li></ol> Hinweis: Die manuelle Mikrodissektion von iPS-Zellen müssen unter einem Stereomikroskop durchgeführt werden. Ein in-vitro-Fertilisation (IVF) Arbeitsstation (zB eine IVF Workstation aus KSystem) mit einem Stereomikroskop integriert ermöglicht Manipulation der Zellen unter sterilen Bedingungen während sie auf einer erhitzten Oberfläche gehalten werden. Wenn diese nicht vorhanden, kann ein Stereomikroskop nach einem regelmäßigen Laminarströmungshaube bewegt werden. 2. Embryoidkörpern Aggregation und Cardiac induction <ol><li> Bereiten EBM-20 Medium gemäß der folgenden Tabelle. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> Endkonz. </td><td> Für 500 ml </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (Herkunft Südamerika) </td><td> 20% </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> MEM nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Penicillin - Streptomycin </td><td> 100U/ml - 0,1 mg / ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0,1 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> 50 &amp;mgr; M </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ml </td></tr></tbody></table> Verwendung von FBS Südamerikas Herkunft ist entscheidend für die Bestimmung der Differenzierung Effizienz: Beschäftigung von anderen Arten von sera beeinflussen könnendie Differenzierung. Um eine vollständige EBM-20, Add Ascorbinsäure (AA) auf eine Endkonzentration von 50 ug / ml vorbereiten. Komplettem Wachstumsmedium kann bei 4 ° C für nicht länger als eine Woche gelagert werden. </li><li> Ernte iPS Kolonien wie oben (Schritte 1.6 bis 1.9) beschrieben. </li><li> Resuspendieren vorsichtig in 1 ml EBM-20 mit einer 2 ml Pipette. Vermeiden Aufbrechen Klumpen zu viel - und Abpipettieren nicht mehr als 2-3x, die Überprüfung der Größe der Kolonien unter dem Stereomikroskop. Platte auf ultra-low Befestigungsplatten im Verhältnis 1:1 (zB für eine 35 mm-Schale, verwenden Sie 1 Well einer 6-Well-Platte). Spülen Rohr mit 1 ml EBM-20 und in den Teller. </li></ol> Anmerkung: Die Größe der Kolonien auf die Differenzierung, die Steuerung der Effizienz und Timing der kardialen Induktion. Aggregation von homogen große EBs wurde gezeigt, dass die Variabilität während der Differenzierung beobachtet reduzieren. <ol start="4"><li> Am 3. Tag, EBM-20 einmal zu ändern mit Hilfe eines Mikroskops zu vermeiden erneutfernung von EBs. Halten Pipette nahe der Plattenkante und entfernen Medium. </li><li> Am Tag 7, Schalter EBs Platten mit 0,1% Gelatine und zuvor bei 37 ° C für 30 Minuten platziert beschichtet. Falls erforderlich, können Gelatine entfernt, und die Platten ließ unter einer Zellkultur Haube O / N. In 35-40 EK pro 35 mm-Schale. </li><li> Prüfen EBs für den Sieg gegen Gebiete und Änderung EBM-20 zweimal pro Woche. Markieren Sie heraus, wo schlagen Bereichen sind auf der Oberseite der Schale Abdeckung, um sie unter dem Stereomikroskop Lokalisierung zu erleichtern. Öffentlicher Bereiche sollten nach etwa 10-20 Tagen erscheinen. </li><li> Als Gebiete mit spontanen Kontraktion erscheinen, schalten mittel-bis EBM-2 (Vorbereitung als EBM-20, mit 2% FBS statt) und isolieren sie wie unten beschrieben in Abschnitt 3. </li><li> Weiter auf andere Bereiche für das Schlagen und ändern Medium zweimal pro Woche bis gegen Bereiche für weitere Experimente nötig sind, zu überprüfen. </li></ol> Hinweis: Wirkungsgrad der Differenzierung ist stark abhängig vonmehreren Faktoren ab, sind die kritischen wobei bestimmte Zelllinien und der Ansatz von Serum verwendet, um Herz-Differenzierung zu induzieren. Um die höchste Effizienz zu erzielen, Test Zelllinien für kardiomyogenen Potential und verschiedenen Chargen von Serum. 3. Beating Bereiche Isolation und Kultur <ol><li> Coat 12-Well-Platten (4 cm 2 Fläche) oder die Platten von Interesse mit 5 ug / cm 2 Fibronektin, in PBS verdünnt, um genügend Volumen, um die gesamte Fläche vollständig abdecken (300 ul insgesamt pro Well in 12-Well-Platten) zu machen. Halten aufgedeckt in Zellkultur Kapuze und trocknen lassen. Die Platten können gewickelt und bei 4 ° CO / N. </li><li> Entfernen schlagen Bereich mit einem Glas gezogen Pasteur Pipette und Skalpell, je nach Bedarf. Übertragen auf Fibronectin-beschichteten Platten mit einer 1 ml Pipette. </li><li> 1 ml EBM-2. </li><li> Überqueren Sie die Platte, um die Bereiche, in denen Zellen wurden entfernt angeben und ändern Sie das Medium. Die Platten können gehalten werden bis zu 1 Monat, wie andere Bereiche b beginnen kannessen später. </li></ol> Hinweis: Wenn kleinere Klumpen schlagen benötigt werden, Pipette die explantierten Bereich nach oben und unten mehrmals unter dem Stereomikroskop, bis es in kleinere Stücke bricht. Dies wird in Gruppen von ein paar Schläge Zellen (siehe Film 3) führen. <ol start="5"><li> Ändern Medium zweimal pro Woche bis bereit für die Analysen. </li></ol> Hinweis: Kardiomyozyten aus diesem Protokoll erhaltenen besitzen fetalen wie morphologische und funktionelle Eigenschaften; Reifung gegenüber einem Erwachsenen-ähnlichen Phänotyp kann durch Erhöhen der Zeit in Kultur weiter differenzieren diese Zellen erhalten werden. 4. Einzel-Beating Cells Isolierung und Analyse <ol><li> Coat 2-Kammer-Objektträgern (4 cm 2 Fläche) oder andere geeignete Träger mit 5 ug / cm 2 Fibronektin in ausreichender PBS verdünnt, um die gesamte Kultur bedecken. Wenn ein Glasträger dient, Mantel mit Laminin und Fibronektin (5 ug / cm &lt;sup&gt; je 2). </li><li> Entfernen Sie schlagen mit einer Pasteurpipette / Skalpell von den Platten aus dem Abschnitt 3. </li><li> Verwendung einer 1 ml abpipettiert, Zellen in ein 15 ml Röhrchen mit 500 ul Collagenase II (480 U / ml in PBS mit Mg und Ca), Inkubation 15 min bei 37 ° C und schüttelt das Rohr einmal während der Inkubation. </li><li> Pipette nach oben und unten mit einer 200 ul Pipette. Wenn irgendwelche Klumpen bleiben, an die frische Collagenase II übertragen und wiederholen Sie Schritt 4.3. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4,4 bis keine großen Klumpen übrig sind. </li><li> Inactivate Kollagenase mit 3 ml EBM-2 (kein AA). Das Rohr kann dann unter der Haube in einem beheizten Rack belassen werden, bis andere Rohre bereit sind. Zentrifuge bei 1.000 rcf für 4 min. </li><li> Pellet in 1 ml 0,25% Trypsin / EDTA (verdünnt aus einer 0,5%-Lager in 1X PBS) und bei 37 ° C inkubieren für 5 min. Kombinieren Fraktionen Aufschlüsse aus dem gleichen ursprünglichen Probe. </li><li> Trypsin inaktivieren mit 4 ml EBM-2 (kein AA). Pass-Zellen durch eine 18G Nadel auf einer 2,5-ml-Spritze nicht mehr than 7x. Zentrifuge bei 1.000 rcf für 4 min. </li><li> Zellpellet in 1 ml EBM-2 pro Well und Platte. Zellen können zur funktionellen und morphologischen Analysen 2-3 Tage nach der Beschichtung verwendet werden. </li></ol>

<ol><li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases%3A+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li>
<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li>
<li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes%3A+a+methods+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li>
<li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li>
<li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+models+for+genetic+cardiovascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders.</a> Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465, 808-812 (2012).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li>
<li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li>
<li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147(2012).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li>
</ol>

Keine finanziellen Interessen offen zu legen.

Pluripotenten Stammzellen haben das Potenzial, spontan differenzieren sich in CMs, wenn auch mit geringer Effizienz und hohe Variabilität zwischen Linien. Die Entwicklung neuer Induktion Methoden wurde deshalb zur Verbesserung der Effizienz des Verfahrens und der sich in Richtung mehr definierten Protokollen konzentriert. Allerdings sind die meisten dieser neuen Differenzierungsmethoden ziemlich komplex und erfordert aufwendige Kulturbedingungen Feinsteuerung der Zeitpunkt und die Konzentration der Reagenzien, und die B...

Historisch gesehen hat die Untersuchung der genetischen und molekularen Mechanismen, die menschliche Entwicklung und die Krankheit auf die Erzeugung von gentechnisch veränderten Tiermodellen basiert. Allerdings scheitern zahlreichen menschlichen Phänotypen bei Mäusen erfolgreich repliziert werden, vor allem wegen der biologischen Unterschiede zwischen den beiden Arten. Auf der anderen Seite, zu menschlichen Geweben zugreifen kann begrenzt werden und oft nicht genügend Material für eingehende experimentelle Untersuchungen erhalten werden. Das Gebiet der Herz-Kreislauf-Biologie leidet unter diesen beiden Einschränkungen: die Physiologie des menschlichen Herzens ist signifikant verschieden von der Maus, und eine beträchtliche Menge von Herzgewebe ist nur post-mortem oder während einer Herzoperation. Das Finden einer optimalen Quelle für die Differenzierung von funktionellen humanen CMS hat deshalb zu einem zentralen Thema in der Herz-Kreislauf-Biologie und viel Anstrengung wurde unternommen, um dieses Problem zu beheben. Verschiedene Zelltypen wurden vorgeschlagen, including Skelettmyoblasten, lokalen kardialen Stammzellen, Knochenmark mononukleären Zellen, Endothelzellen Vorläuferzellen und mesenchymalen Stammzellen. Allerdings erhaltenen Daten unter Verwendung dieser Zellen noch nicht durchgängig 4. Die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen (ESC) und die ersten 5 bahnbrechende Entdeckung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Yamanaka und Thomson 6,7 später schien Lösungen: Diese Zellen haben die Fähigkeit, unbegrenzt zu wachsen und das Potenzial zu geben steigen, um alle Zellen Derivate der drei Keimblätter, einschließlich der CMs. Die Verwendung von IPS-Zellen bietet weitere Vorteile: ist aus autologen adulten Zellen abgeleitet, tragen sie die gleichen Genom des Individuums oder Patienten, aus denen sie abgeleitet sind. Sie ermöglichen damit die Entwicklung von in-vitro-Modelle, die die Untersuchung von menschlichen genetischen Erkrankungen und Mechanismen der Entwicklung zu erleichtern. Auf Grund dieser Eigenschaft können iPS-Zellen auch overcome Probleme im Zusammenhang mit Immunabwehr und ethische Fragen 8. Aus diesen Gründen, obwohl WSR noch den Goldstandard im Bereich der Stammzellbiologie darstellen, sind Forscher weltweit nun mehr bewegen zu iPS-Technologie. iPS-Zellen werden nun verwendet werden, um menschliche Krankheiten in vitro-Modell für verschiedene Bedingungen, einschließlich angeborenen Herz-Kreislaufstörungen 9,10. Vor kurzem hat Anwendung von iPS-Zellen Krankheit Modellierung für monogenic Herzerkrankungen (dh Long-QT-Syndrome, katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie) und Pathologien, bei denen Herzfehler sind Teil eines komplexen Phänotyp (dh Leopard und Timothy-Syndrom, dilatative Kardiomyopathie) durchgeführt. Diese Berichte bestätigt, dass Patienten-spezifischen iPS-Zellen, die in CMs differenziert werden ähnliche phänotypische und funktionelle Eigenschaften aufweisen, wie die Krankheit in vivo. Allerdings gibtsind noch viele Herausforderungen, um die Wirksamkeit zu induzieren die iPS-Zellen in das Herz-Linie zu verbessern. Spontane Generation von CMS aus menschlichen WSR über Aggregatbildung genannt Embryoidkörpern (EVG) haben erfolgreich 17 bewährt. Seit dieser Entdeckung wurden viele andere Methoden vorgeschlagen worden. Viele Gruppen haben sich die Effizienz der Differenzierung Protokoll weiterentwickelt und haben zu chemisch definierten und Tier-product-freie Kultur Reagenzien bewegt (siehe Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) für eine umfassende Überprüfung aller bestehenden Methoden 3 ). Dennoch ist die klassische Methode auf EB Aggregation basiert immer noch das am häufigsten für die Durchführung funktionelle Studien und Erforschung von Krankheiten Mechanismen eingesetzt. Unsere vorgeschlagene Protokoll basiert auf der Aggregation von iPS-Zellen in EBs und Kultur in Gegenwart von Serum und Ascorbinsäure, die gezeigt wurde, dass die kardiale Differenzierung Prozess zu verbessern und po Basissitively Auswirkungen auf die Reifung dieser Zellen 18,19. In diesem Artikel werden wir durch diese Methodik im Detail zu gehen und zeigen, wie Feeder-freie iPS-Zelllinien zur Erzeugung von Patienten-spezifischen iPS-abgeleiteten CMs verwenden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Medien und Reagenzien</td></tr><tr><td>Human-ESC-qualifizierte Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Tauen Sie die 5-ml-Flasche bei 4 μg auf; C auf Eis O/N, aliquot in vorgekühlten Kryoröhrchen auf Eis, gemäß den Verdünnungsanweisungen des Datenblatts und bei -20 & deg lagern; C .</td></tr><tr><td>Fibronektin, aus menschlichem Plasma, 0,1%ige Lösung</td><td>Sigma</td><td>F0896-2MG</td><td>Arbeitskonzentration: 5 &mu; g/cm2</sup</td></tr><tr><td>>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>Arbeitskonzentration: 5 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>PBS (ohne Mg und Ca), 10X</td><td>Lonza</td><td>BE17-515F</td><td></td></tr><tr><td>PBS (mit Mg und Ca), 10X</td><td>Bio Sera</td><td>XC-S2067/500</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, neutrale Protease, Grad II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Lagerbestand: 10 mg/ml in DMEM-F12 bei -20 &deg; C, Arbeitslösung: 1 mg/ml in PBS (ohne Mg/Ca)</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA, 0,5</td>%<td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 2</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td>Verdünnt auf 480 U/ml (z. B. 1,6 mg/ml) in PBS mit Mg und Ca</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Ersatz (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Auftauen bei 4 > C, aliquot und bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>F&#8211; tal Rinderserum (Herkunft Südamerika)</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>Chargen sollten auf ihr kardiogenes Potenzial getestet werden. Tauwetter bei 4 Grad; C, hitzeinaktiviert bei 56 °; C für 30 min, aliquotieren und bei -20 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>PenStrep, Penicillin-Streptomycin, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA, 100X</td><td>Invitrogen</td><td>11140-135</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ergänzung, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapt&#8211; thanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine, aus Schweinehaut</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Brühe bei 1% in Wasser herstellen, bei -20 °C lagern. Auf 0,1 % in PBS verdünnen und bei 4 μg aufbewahren; C</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td>Supplement 5X mit dem Basismedium kombinieren, aliquotieren und bei -20 °C lagern. Bewahren Sie das gesamte Medium nicht bei 4 ° C auf. C für mehr als 1 Woche</td></tr><tr><td>Nutristem hESC XF</td><td>Stemgent von Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>Auftauen bei 4 &Grad; C O/N, aliquotieren und bei -20 &deg lagern; C bis zum Gebrauch. Aliquots können bei 4 &° gehalten werden; C für nicht länger als eine Woche.</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5853</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td>Bereiten Sie die Brühen mit 10 mg/ml in Wasser vor. Lagern Sie Aliquots bei -20 > C im Dunkeln. In der Endkonzentration (500X)</td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>35 mm Kulturschalen</td><td>Becton Dickinson</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platten</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Permanox 2-Well-Kammer-Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>2-Well-Objektträger aus Glas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten, Oberfläche mit extrem geringer Anhaftung</td><td>Corning Incorporated</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>18G-Nadel</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Glaspasteurpipetten, 230 mm</td><td>VWR International</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>2,5 ml Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>300188</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ausrüstungen</td></tr><tr><td>IVF Workstation</td><td>KSystem, von Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ1500 Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human cardiomyocytes: eine differenzierung protokoll von feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten stammzellen

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Um die Ereignisse Antreiben Entwicklung des Herzens zu untersuchen und um die molekularen Mechanismen, die zu myokardialen Erkrankungen beim Menschen zu bestimmen, ist es wichtig, erste funktionalen humanen Kardiomyozyten (CMS) zu erzeugen. Die Verwendung dieser Zellen in der Wirkstoffforschung und toxikologischen Studien wäre auch sehr vorteilhaft, so dass neue pharmakologische Moleküle zur Behandlung von Herzerkrankungen vor, klinisch Zellen menschlichen Ursprungs validiert werden. Von den möglichen Quellen der CMs sind induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu den vielversprechendsten, da sie direkt aus leicht zugänglichen Patientengewebe abgeleitet werden und besitzen eine intrinsische Fähigkeit, die zu allen Zelltypen des Körpers 1 zu geben. Mehrere Methoden zur Differenzierung iPS-Zellen in CMs vorgeschlagen worden, angefangen von der klassischen Embryoidkörpern (EVG) Aggregation Ansatz zur chemisch definierten Protokollen 2,3. In diesem Artikel werden wir vorschlagen, ein EBS-basiertes Protokoll und zeigen, wie diese method eingesetzt werden, um effizient zu erzeugen funktionale CM-Zellen aus Feeder-freie iPS-Zellen werden.

In unseren Studien haben wir erzeugt CMs aus mehreren iPS-Zelllinien. Diese Linien wurden zunächst auf einem MEF Feeder-Schicht erzeugt, sondern wurden sofort auf Matrigel platziert mit einem definierten Medium (entweder mTESR1 oder Nutristem). Verschiedene Tests wurden verwendet, um die Wartung der morphologischen Eigenschaften, die Expression von Markern typisch für pluripotente Zellen (OCT-4, SSEA4 und TRA1-60) und ihre Stabilität des Genoms (Abbildung 1) zu überprüfen. I...

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane Kardiomyozyten aus humanen IPS-Zellen zu differenzieren, die unter fütterzellenfreien Bedingungen kultiviert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst IPS-Zellen in Platten mit ultraniedriger Anheftung platziert werden, um Embryoidkörper zu bilden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die gebildeten Embryoidkörper in mit Gelatine beschichtete Schalen zu überführen.Wenn kontrahierende Bereiche erscheinen, werden diese manuell unter dem Stereomikroskop disseziert und auf mit Fibronectin beschichteten Schalen kultiviert. Zur weiteren Differenzierung besteht der letzte Schritt darin, durch enzymatische Verdauung kontrahierender Zellhaufen einzelne Kardiomyozyten zu gewinnen. Letztendlich können Ergebnisse die Differenzierung kardiomyozytenähnlicher Zellen zeigen, die typische strukturelle Marker wie beispielsweise kardiales Troponin mittels Immunfluoreszenzmikroskopie exprimieren.Mit dieser Methode lässt sich eine zentrale Frage der kardiovaskulären Biologie beantworten, beispielsweise, welche Mechanismen die kardiale Differenzierung und Dysfunktion während der kardialen Entwicklung und bei Erkrankungen auf Ebe

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung menschlicher Kardiomyozyten, das die modulierte kardiale Differenzierung kleiner Moleküle und die durch Glukoseentzug vermittelte Kardiomyozytenreinigung kombiniert und die Produktion von gereinigten Kardiomyozyten für die Zwecke der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Wirkstoffscreenings ermöglicht.

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen in vitro ermöglicht den Zugang zu großen Mengen an Herzgewebe in vitro für die Grundlagenforschung und klinische Anwendungen.  Dieses Protokoll verwendet den atrialisierenden Faktor Grem2, um sowohl die Anzahl der erhaltenen Kardiomyozyten zu erhöhen als auch Kardiomyozyten mit einem atrialen Phänotyp zu erzeugen.

Die Differenzierung der Atrial Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen Mit dem BMP-Antagonisten Grem2

Hier präsentieren wir ein robustes, schnelles und skalierbares Protokoll zur Differenzierung von Kardiomyozyten für humane pluripotente Stammzellen (hPSCs). Kardiomyozyten, die mit dieser groß angelegten Methode gewonnen werden, können eine ausreichende Zellzahl für ihren effektiven Einsatz bei der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen beim Menschen, beim Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und möglicherweise in klinischen Anwendungen liefern.

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.

Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Die elektrophysiologische Charakterisierung von Kardiomyozyten, die aus menschlichen Pluripotenten Stammzellen (hPSC-CMs) stammen, ist entscheidend für die Modellierung von Herzkrankheiten und für die Bestimmung von Arzneimittelwirkungen. Dieses Protokoll liefert die notwendigen Informationen, um hPSC-CMs auf Multi-Elektroden-Arrays zu dissoziieren und zu plattieren, ihr Feldpotential zu messen und ein Verfahren zur Analyse von QT- und RR-Intervallen zu verwenden.

Elektrophysiologische Analyse von humanen Pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs) unter Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays (MEAs)

Hier präsentieren wir eine Methode, um effizient die kardialen Differenzierung junge Quellen humaner mesenchymaler Stammzellen um funktionelle, Auftraggeber, Cardiomyocyte-wie Zellen erzeugen Potenzial in-vitro-.

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Hier beschreiben wir eine skalierbare Methode mit einer einfachen Kombination von Activin A und Lentivirus-vermittelten Id1-Überexpression, erste Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen zu generieren.

Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Dieser Artikel enthält eine Reihe von Protokollen für die Entwicklung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CM) Netzwerken, die auf Multiwell-MEA-Platten kultiviert werden, um die Zellmembran für Aktionspotenzialmessungen reversibel zu elektroporatieren. Hochdurchsatzaufzeichnungen werden von denselben Zellstandorten wiederholt über Tage hinweg abgerufen.

Human iPSC-Derived Cardiomyozyte Networks auf Multiwell Micro-Elektroden-Arrays für recurrent Action Potential Recordings

Hier stellen wir ein Protokoll zur robusten Erzeugung und Erweiterung menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patienteneigenen peripheren Blutes vor.

Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes

Erfahren Sie die Differenzierung funktioneller menschlicher Kardiomyozyten aus iPS-Zellen mittels Embryoidkörper-Protokoll. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare kardiale Zellgenerierung für Forschung und Therapieansätze.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Weitere Videos entdecken