Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane Kardiomyozyten aus humanen IPS-Zellen zu differenzieren, die unter fütterzellenfreien Bedingungen kultiviert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst IPS-Zellen in Platten mit ultraniedriger Anheftung platziert werden, um Embryoidkörper zu bilden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die gebildeten Embryoidkörper in mit Gelatine beschichtete Schalen zu überführen.

Wenn kontrahierende Bereiche erscheinen, werden diese manuell unter dem Stereomikroskop disseziert und auf mit Fibronectin beschichteten Schalen kultiviert. Zur weiteren Differenzierung besteht der letzte Schritt darin, durch enzymatische Verdauung kontrahierender Zellhaufen einzelne Kardiomyozyten zu gewinnen. Letztendlich können Ergebnisse die Differenzierung kardiomyozytenähnlicher Zellen zeigen, die typische strukturelle Marker wie beispielsweise kardiales Troponin mittels Immunfluoreszenzmikroskopie exprimieren.

Mit dieser Methode lässt sich eine zentrale Frage der kardiovaskulären Biologie beantworten, beispielsweise, welche Mechanismen die kardiale Differenzierung und Dysfunktion während der kardialen Entwicklung und bei Erkrankungen auf Ebene des menschlichen Kardiomyozyten antreiben. Dieses Verfahren ist äußerst interessant, da es die Generierung von Kardiomyozyten in vitro aus menschlichen Patienten und Individuen ermöglicht. Darüber hinaus erlaubt es, die Erkrankung im Reagenzglas nachzubilden, sodass neue Wirkstoffe vor einem Einsatz in vivo zunächst in vitro getestet werden können.

Beginnen Sie das Experiment mit konfluenten IPS-Zellkulturen, die auf 35 Millimeter großen, mit Matrigel beschichteten Platten gezüchtet wurden. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch ein Milliliter PBS, das ein Milligramm Diss enthält. Untersuchen Sie die Zellen mithilfe von abgerundeten Glaspipetten.

Entfernen Sie Bereiche mit differenzierten Zellen, wie kraterartige oder zystische Strukturen im Zentrum der Kolonien. Entfernen Sie außerdem alle Stellen, an denen sich die Zellen gelöst, abgeflacht und nach außen zu wandern scheinen. Inkubieren Sie die verbleibenden Zellen nun bei 37 Grad Celsius unter einem Brutraum, bis die Kolonieränder heller werden und sich zu lösen beginnen.

Dies dauert normalerweise zwischen fünf und sieben Minuten. Entfernen Sie an dieser Stelle die Dispa-Lösung und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter HESM. Danach entsorgen Sie die Waschlösung.

In einem frischen Milliliter HESM die Kolonien mit einem Zellabstreifer ablösen. Sammeln Sie die Kolonien in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Zellen anschließend mit einem weiteren Milliliter HESM ab und zentrifugieren Sie sie vier Minuten lang mit 1000 × g.

Fahren Sie anschließend mit der Aussaat der Zellen auf Matrigel fort und wechseln Sie das Medium täglich während der Kultivierung. Beginnen Sie damit, undifferenzierte iPS-Kolonien wie im vorherigen Abschnitt beschrieben zu gewinnen. Sobald die undifferenzierten Populationen isoliert wurden, suspendieren Sie sie vorsichtig in einem Milliliter EBM 20.

Verwenden Sie eine 2-Milliliter-Pipette und zerkleinern Sie die Zellklumpen nicht zu stark. Beschränken Sie das Pipettieren auf zwei oder drei Auf- und Ab-Bewegungen. Überprüfen Sie zwischen den Bewegungen die Größe der Kolonien unter dem Stereomikroskop.

Wenn die Kolonien alle ungefähr gleich groß sind, ist kein weiteres Mischen erforderlich. Impfen Sie die Zellen nun auf Ultra-Low-Attachment-Platten aus, wobei eine sechsbrüchige Platte pro geernteter Zellplatte verwendet wird. Vergessen Sie nicht, das Gefäß mit einem Milliliter EBM 20 auszuspülen und die Spülflüssigkeit auf die Platte zu verteilen.

Nach dem dritten Inkubationstag wechseln Sie das Medium unter Verwendung eines Mikroskops, um Embryoidkörper nicht zu entfernen. Halten Sie die Pipette nahe am Rand der Platte. Am siebten Tag überführen Sie die Embryoidkörper in Platten, die mit 0,1 % Gelatin beschichtet und 30 Minuten lang auf 37 Grad Celsius erwärmt wurden.

Geben Sie 35 bis 40 Embryoidkörper in jede 35-Millimeter-Schale mit zwei Milliliter Medium. Wechseln Sie das Medium während der Kultivierung regelmäßig zweimal pro Woche.

Überprüfen Sie die Embryoidkörper auf Bereiche mit Schlagaktivität und markieren Sie die Position dieser schlagenden Bereiche. Auf der Oberseite der Schalenabdeckung sollten sich schlagende, kontrahierende Bereiche nach etwa 10 bis 20 Tagen zeigen. Sobald Bereiche mit spontaner Kontraktion auftreten, wechseln Sie das Medium auf EBM. Nach dem Auftreten der kontrahierenden Bereiche weiterhin kultivieren und andere Bereiche auf der Platte bis zu einem Monat lang beobachten.

Insgesamt. In EBM zwei Defizite des Differenzierungsprozesses sind stark von mehreren Faktoren abhängig, wobei die spezifischen Zelllinien und die Charge des zur Induktion der kardialen Differenzierung verwendeten Serums die kritischsten sind. Um die höchste Effizienz zu erzielen, testen Sie mehrere Linien hinsichtlich ihres kardio-Genesepotenzials sowie verschiedene Serumschargen. Beginnen Sie damit, 12.

Brustplatten mit fünf Mikrogramm pro Quadratzentimeter Fibronectin in PBS, 300 Mikroliter pro Vertiefung, sollten die Oberfläche jeder Vertiefung vollständig bedecken. Die Platten unbedeckt in einer Zellkulturhaube trocknen lassen. Um den Beading-Bereich der Zellkultur zu entfernen, verwenden Sie eine ausgezogene Glaspipette und ein Skalpell.

Überführen Sie anschließend mit einer Ein-Milliliter-Pipette vier bis fünf Klammern in jede Vertiefung einer mit Fibronectin beschichteten Platte. Sobald alle Sammlungen durchgeführt wurden, geben Sie ein Milliliter EBM zwei zu den beladenen Vertiefungen auf der Sammelplatte und kennzeichnen Sie Bereiche, aus denen Zellen entfernt wurden. Danach wechseln Sie das Medium und stellen die Platte zurück in den Brutraum.

Wenn unter einem Stereomikroskop kleinere pulsierende Zellklumpen benötigt werden, pipettieren Sie die ausgeschnittenen Bereiche mehrmals durch eine Pipette. Dies erzeugt kleine Zellverbände, die jeweils nur wenige pulsierende Zellen enthalten. Im Kulturmedium.

Ersetzen Sie das Medium zweimal wöchentlich, bis die Proben zur Analyse bereit sind. Bereiten Sie zunächst Vier-Kammer-Objektträger mit einer Kantenlänge von vier Zentimetern vor, indem Sie diese mit 20 Mikrogramm Fibronectin beschichten, das in ausreichend PBS verdünnt ist, um die Oberfläche zu bedecken. Falls ein Glas-Träger verwendet wird, geben Sie zusätzlich 20 Mikrogramm Laminin hinzu.

Isolieren Sie den Bead-Kultur-Bereich, wie zuvor beschrieben. Überführen Sie die Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das 500 Mikroliter Kollagenase enthalten. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang und schütteln Sie das Röhrchen einmal während der Inkubation.

Nach 15 Minuten die Zellen durch eine 200-Mikroliter-Pipette bewegen, um Klumpen zu entfernen, falls noch welche vorhanden sind. Die Zellen in frisches Kollagenase zwei überführen und die Inkubation wiederholen, wenn keine großen Klumpen mehr übrig sind. Die Verdauung beenden, indem drei Milliliter EBM zwei ohne Assoinsäure hinzugefügt werden, wie jeweils vorbereitet.

Bewahren Sie die Röhrchen unter der Haube in einem beheizten Rack auf und zentrifugieren Sie sie vier Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1000 × g. Nach der Zentrifugation stellen Sie eine Suspension der Zellfraktionen aus derselben ursprünglichen Probe in einem Milliliter 0,25 %iger Trypsin-EDTA-Lösung in PBS her. Inkubieren Sie die Suspension anschließend fünf Minuten lang im beheizten Block und inaktivieren Sie das Trypsin mit vier Millilitern E BM zwei ohne Assoinsäure.

Als Nächstes werden die Zellen bis zu siebenmal durch eine 18-Gauge-Nadel an einer 2,5-Milliliter-Spritze geleitet, bis unter dem Mikroskop keine größeren Zellklumpen mehr sichtbar sind. Anschließend werden die Zellen bei 1000 ×g für vier Minuten zentrifugiert. Nun wird das Zellpellet in E BM zwei resuspendiert und auf Zweikammerobjektträgern ausplattiert.

Die Zellen sind nach zwei bis drei Tagen Inkubation bereit für Analysen. CMS wurden aus mehreren IPS-Zelllinien erzeugt. Diese Zelllinien wurden ursprünglich auf einer Ma-Feeder-Schicht generiert und unmittelbar danach mit einem definierten Medium auf Matrigel übertragen.

Die Zellen zeigten eine humane ESC-ähnliche Morphologie mit phasenhellen Rändern und prominenten Kernen. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass die iPS-Zellen den Transkriptionsfaktor T vier korrekt exprimierten und das TRA eins 60 Oberflächenantigen exprimierten. Die zytometrische Analyse bestätigte die Expression typischer Oberflächen-Antigene der Pluripotenz, SS EEA vier und TRA eins 60.

Die Gating-Strategie ist im linken Streudiagramm dargestellt. Eine Karyotyp-Analyse der auf Matrixgel kultivierten IP-FS-Zellen wurde ebenfalls durchgeführt. Die Differenzierung in die kardiale Linie wurde durch Aggregation der IPS-Zellen zu EBs ausgelöst, zusammen mit der Kultivierung in Gegenwart eines spezifischen Serums.

Und da die Bereiche mit sorbinsäureinduzierten Kontraktionen je nach verwendeter Zelllinie 20 bis 35 % der Gesamtkultur ausmachten, wurden kontrahierende CMS aus diesen Regionen durch enzymatische Verdauung isoliert und auf Proteinausprägung analysiert. Die Echtzeit-PCR zeigte eine Expression kardialspezifischer Ionenkanäle in den aus IPS-Zellen stammenden pulsierenden Zellen, nicht jedoch in nicht pulsierenden Zellen.

Diese Kanäle umfassten ein Alpha-1-Untereinheit eines spannungsabhängigen Kalziumkanals, eine Alpha-Untereinheit eines spannungsaktivierten Natriumkanals vom Typ 5, einen spannungsabhängigen Kaliumkanal der KQT-artigen Unterfamilie sowie beide Formen des Myosins. Die Immunfluoreszenzanalyse der schweren Ketten zeigte, dass einzelne aus IPS abgeleitete Kardiomyozyten die strukturellen Proteine alpha-sarkomerisches Aktin, kardiales Troponin I und das kardialspezifische Übergangs-Komplexprotein Connexin 43 exprimierten. Letztlich ebnete diese Technik den Weg für die Modellierung myokardialer Erkrankungen in vitro und ermöglicht es, Arzneimittel im menschlichen Kontext zu testen, ohne diese direkt in den menschlichen Körper einzubringen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man IPS-Zellen unter freien Bedingungen kultiviert und sie durch eine auf der Aggregation von Embryoidkörpern basierende Methode in Kardiomyozyten differenziert.