Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane Kardiomyozyten von humanen IPS-Zellen zu unterscheiden, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert werden. Dies wird erreicht, indem IPS-Zellen zunächst in extrem niedrige Anhaftungsplatten plattiert werden, um Embryokörper zu bilden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die gebildeten Embryokörper in mit Gelatine überzogene Schalen zu überführen.

Wenn sich Kontraktionsbereiche bilden, werden diese manuell unter dem Stereomikroskop präpariert und auf mit Fibronektin beschichtete Schalen plattiert. Für die weitere Differenzierung besteht der letzte Schritt darin, einzelne Kardiomyozyten durch enzymatische Verdauung von kontrahierenden Clustern zu erhalten. Letztendlich können die Ergebnisse die Differenzierung von Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen zeigen, die typische strukturelle Marker, d.h. kardiales Troponin, durch Immunfluoreszenzmikroskopie exprimieren.

Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage im Bereich der kardiovaskulären Biologie zu beantworten, z. B. welchen Mechanismus die Kardiodifferenzierung und -dysfunktion während der Kardioentwicklung und bei Erkrankungen auf der Ebene der menschlichen Kardiomyozyten antreibt. Dies ist eine sehr interessante Technik, da sie die Erzeugung von Kardiomyozyten in vitro aus menschlichen Patienten und menschlichen Individuen ermöglicht. Und im zweiten Fall ermöglicht es die Rekapitulation der Krankheit im Reagenzglas, so dass neue Medikamente in vitro experimentiert werden können, bevor sie in vivo verabreicht werden.

Beginnen Sie mit konfluenten IPS-Zellkulturen, die auf 35 Millimeter Matrigel-beschichteten Platten gezüchtet werden. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch einen Milliliter PBS, der ein Milligramm Diss enthält. Untersuchen Sie die Zellen mit hornlosen Glaspipetten.

Entfernen Sie Regionen mit differenzierten Zellen wie kraterartige oder zystische Strukturen im Zentrum von Kolonien. Entfernen Sie auch alle Bereiche, in denen sich die Zellen getrennt oder abgeflacht haben und nach außen zu wandern scheinen. Die restlichen Zellen werden nun bei 37 Grad Celsius unter einer Kulturhaube inkubiert, bis die Koloniegrenzen heller werden und sich zu lösen beginnen.

Dies dauert in der Regel zwischen fünf und sieben Minuten. Entfernen Sie zu diesem Zeitpunkt die Dispa-Lösung und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter HESM. Entsorgen Sie dann die Waschlösung.

In einem frischen Milliliter HESM verwenden Sie einen Zellheber, um die Bienenvölker zu ernten. Sammeln Sie die Kolonien in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie anschließend die Zellen mit einem weiteren Milliliter HESM und schleudern Sie sie vier Minuten lang mit dem 1000-fachen G herunter.

Fahren Sie dann mit der Beschichtung der Zellen auf Matrigel fort und wechseln Sie das Medium täglich während der Kultivierung. Beginnen Sie mit der Ernte undifferenzierter IPS-Kolonien, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Sobald die undifferenzierten Populationen isoliert wurden, werden sie vorsichtig in einem Milliliter EBM 20 suspendiert.

Brechen Sie mit einer Zwei-Milliliter-Pipette die Zellklumpen nicht zu stark auf. Beschränken Sie das Pipettieren auf zwei oder drei Hübe. Überprüfen Sie die Größe der Kolonien unter dem Stereoskop zwischen den Strichen.

Wenn die Völker alle ungefähr gleich groß sind, brauchen sie nicht weiter gemischt zu werden. Plattieren Sie nun die Zellen auf Platten mit extrem niedrigem Anhaftungspotenzial, wobei Sie eine Sechs-Well-Platte pro Platte mit den geernteten Zellen füllen. Vergessen Sie nicht, die Tube mit einem Milliliter EBM 20 zu spülen und die Spülung auf die Platte zu verteilen.

Nach dem dritten Tag der Inkubation ist das Medium mit einem Mikroskop zu wechseln, um eine Entnahme der Embryonen zu vermeiden. Halten Sie die Pipette nahe am Rand der Platte. Am siebten Tag werden die Embryokörper auf Platten gelegt, die mit 0,1 %iger Gelatine beschichtet sind und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erhitzt wurden.

Geben Sie 35 bis 40 Embryokörper in jede 35-Millimeter-Schale in zwei Milliliter Medium. Während der Kultivierung. Wechseln Sie das Medium regelmäßig zweimal pro Woche.

Überprüfen Sie die Embryokörper auf schlagende Bereiche und markieren Sie, wo sich die Perlenbereiche befinden. Auf der Oberseite der Schale sollten nach etwa 10 bis 20 Tagen Abperlungen erscheinen. Wenn Bereiche mit spontaner Kontraktion auftreten, schalten Sie ihr Medium auf EBM um zwei Nachdem die kontrahierenden Bereiche erscheinen, kultivieren und überwachen Sie andere Bereiche auf der Platte bis zu einem Monat lang.

insgesamt. Bei EBM zwei ist ein Mangel des Differenzierungsprozesses stark von mehreren Faktoren abhängig, von denen die kritischsten die spezifischen Zelllinien und die Serumcharge sind, die zur Induktion der Kardiodifferenzierung verwendet wird. Um die höchste Effizienz zu erzielen, testen Sie mehrere Linien auf das kardiogene Potenzial und verschiedene Chargen des Serums: Beginnen Sie mit der Beschichtung von 12.

Well-Platten mit fünf Mikrogramm pro Quadratzentimeter Fibronektin in PBS 300 Mikrolitern pro Well sollten die Oberfläche jedes Wells vollständig bedecken. Lassen Sie die Platten unbedeckt in einer Zellkulturhaube trocknen. Um den Abperlbereich der Zellkultur zu entfernen, verwenden Sie eine gezogene Glaspipette und ein Skalpell.

Übertragen Sie dann mit einer Ein-Milliliter-Pipette vier bis fünf Klemmen in jede Vertiefung einer mit Fibronektin beschichteten Platte. Wenn alle Entnahmen durchgeführt wurden, fügen Sie einen Milliliter EBM zwei zu den geladenen Vertiefungen auf der Sammelplatte hinzu, die Bereiche markieren, in denen Zellen entnommen wurden. Wechseln Sie dann das Medium und legen Sie die Platte wieder in die Kulturhaube.

Wenn kleinere schlagende Klumpen unter einem Stereomikroskop erforderlich sind, führen Sie die explantierten Bereiche durch eine Pipette. Dadurch entstehen kleine Cluster, die einige schlagende Zellen enthalten. In der Kultur.

Wechseln Sie das Medium zweimal wöchentlich, bis es für die Analyse bereit ist. Bereiten Sie zunächst vier Quadratzentimeter große Objektträger mit zwei Kammern vor, indem Sie sie mit 20 Mikrogramm Fibronektin beschichten, das in genügend PBS verdünnt ist, um die Oberfläche zu bedecken. Wenn ein Glasträger verwendet wird, fügen Sie zusätzlich 20 Mikrogramm Laminin hinzu.

Isolieren Sie den Bead-Kulturbereich wie zuvor beschrieben. Übertragen Sie die Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 500 Mikrolitern Kollagenase-Röhrchen. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang und schütteln Sie das Röhrchen einmal während der Inkubation.

Bewegen Sie die Zellen nach 15 Minuten durch eine 200-Mikroliter-Pipette, um Klumpen zu entfernen, falls noch Klumpen vorhanden sind. Übertragen Sie die Zellen in die frische Kollagenase zwei und wiederholen Sie die Inkubation, wenn keine großen Klumpen mehr übrig sind. Beenden Sie die Verdauung, indem Sie drei Milliliter EBM hinzufügen, zwei ohne so viel Sojasäure, wie sie jeweils zubereitet sind.

Lagern Sie die Röhrchen in einem beheizten Gestell unter der Haube und zentrifugieren Sie sie dann bei 1000-facher G für vier Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Zentrifugieren stellen Sie eine Suspension der Zellfraktionen aus derselben Ausgangsprobe in einem Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA in PBS her. Dann die Suspension fünf Minuten lang in dem erhitzten Block inkubieren, das Trypsin mit vier Millilitern E BM zwei ohne Sojasäure inaktivieren.

Führen Sie die Zellen anschließend bis zu sieben Mal durch eine 18-Gauge-Nadel auf einer 2,5-Milliliter-Spritze, bis unter dem Mikroskop keine großen Klumpen mehr sichtbar sind. Dann zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei 1000 mal G. Nun resuspendieren Sie das Zellpellet in E BM two und plattieren Sie es auf zwei Vertiefungskammer-Objektträgern.

Nach zwei bis drei Tagen Inkubation sind die Zellen bereit für die Analyse. CMS wurden aus mehreren IPS-Zelllinien generiert. Diese Linien wurden zunächst auf einer Meth-Feeder-Schicht erzeugt und sofort mit einem definierten Medium auf Matrigel aufgebracht.

Die Zellen zeigten eine humane ESC-ähnliche Morphologie mit phasenhellen Rändern und markanten Kernen. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass die IPS-Zellen den Transkriptionsfaktor T vier korrekt exprimierten und das Oberflächenantigen TRA one 60 korrekt exprimierten. Die zytometrische Analyse bestätigte die Expression typischer Oberflächen-Pluripotenz-Antigene, SS EEA vier und TRA 1 60.

Die Gating-Strategie ist im linken Scatter dargestellt. Eine Karyotypanalyse der auf Matrixgel gezüchteten IP FS-Zellen wurde ebenfalls durchgeführt. Die Induktion in die kardiale Linie wurde durch die Aggregation der IPS-Zellen zu ebs ausgelöst, zusammen mit der Kultivierung in Gegenwart eines bestimmten Serumtyps.

Und da die Sorbinsäure-Kontraktionsflächen je nach verwendeter Zelllinie 20 bis 35 % der Gesamtkultur ausmachten. Kontraktive CMS wurden aus diesen Regionen durch enzymatischen Verdau isoliert und auf Proteinexpression analysiert. R-T-P-C-R fand die Expression von kardialen spezifischen Ionenkanälen, die in den IPS-abgeleiteten schlagenden Zellen exprimiert wurden, aber nicht in nicht schlagenden Zellen.

Diese Kanäle umfassten einen Alpha-Kanal, eine Untereinheit eines spannungsabhängigen Kalziumkanals, eine Alpha-Untereinheit eines spannungsgesteuerten Natriumkanals vom Typ 5, einen Kaliumspannungs-gesteuerten Kanal der KQT-ähnlichen Unterfamilie und beide Formen von Myosin. Die Schwerketten-Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass einzelne IPS-abgeleitete Kardiomyozyten die Strukturproteine Alpha-Sarkomerik, Aktin, kardiales Troponin I und die kardiale spezifische Verbindung, Conexion 43, exprimierten. Schließlich hat diese Technik den Weg für die Modellierung von Myokarderkrankungen in vitro geebnet und ermöglicht das Experimentieren mit Medikamenten im menschlichen Umfeld, ohne das Medikament in den menschlichen Körper zu injizieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man IPS-Zellen unter freien Bedingungen hält und sie durch eine Methode, die auf der Aggregation von Embryonen basiert, in Kardiomyozyten unterscheidet.