Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in Saccharomyces cerevisiae

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines Leuchtkäfer-Luciferase-GFP-Fusionsprotein zu untersuchen,

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wiederlöslichkeit und -faltung von Proteinen in vivo nahezu in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie und enzymatischen Assays zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen mit einem Plasmid transformiert werden, das Glühwürmchen-Luziferase enthält, die mit grün fluoreszierendem Protein oder F-F-L-G-F-P fusioniert ist. Der zweite Schritt besteht darin, die Expression des F-F-L-G-F-P-Proteins zu induzieren, gefolgt von einer Cycloheximid-Behandlung, um die Produktion des Proteins zu stoppen.

Messen Sie anschließend die Luciferase-Aktivität vor und für einen bestimmten Zeitraum nach der thermischen Denaturierung. Der letzte Schritt besteht darin, Zellen sichtbar zu machen, um die Löslichkeit des F-F-L-G-F-P-Proteins zu bestimmen. Letztendlich werden Fluoreszenzmikroskopie und enzymatische Assays verwendet, um die Effizienz der Reaktivierung eines modellierten entfalteten Enzyms in mehreren Stämmen zu quantifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Endpunktanalyse besteht darin, dass Sie die Aktivität des Proteins mit dem Aggregationsstatus über die Zeit korrelieren können. Um die Beziehung zwischen diesen beiden Phänomenen zu bestimmen, kann diese Methode helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Proteinhomöostase zu beantworten, z. B. wie spezifische Chaperone und COS-Chaperone zur Disaggregation und Rückfaltung eines Modellproteins beitragen und wie diese beiden Aktivitäten in der Zelle voneinander abhängig sind. Das Glühwürmchen-Luciferase-grün fluoreszierende Proteinfusionsprotein F-F-L-G-F-P wird aus diesem Plasmid unter der Kontrolle des repressiblen MET-25-Methionin-Promotors exprimiert.

Unter Verwendung eines angepassten Lithiumacetat-vermittelten Protokolls wird das Plasmid in zwei Croce-Vinier-Stämme transformiert, einen Wildtyp-Stamm und einen für HSP 1 0 4 delatierten Stamm. Eine Hefe disaggregiert, die eine wichtige Rolle bei der Reparatur aggregierter fehlgefalteter Proteine spielt. Da der Erfolg dieses Experiments davon abhängt, dass es rechtzeitig durchgeführt wird, sollte vor der Induktion von F-F-L-G-F-P-Kulturröhrchen, die Medien, Mikrozentrifuge, Röhrchen und Luziferium enthalten, Folgendes vorbereitet werden. Die benötigte Menge an Luzifer basiert auf der Anzahl der Proben und der gewünschten Anzahl von Replikaten zuzüglich ca. 1.200 Mikroliter für den Schlauch.

Das Heißwasserbad auf das Programm 42 Grad Celsius vorwärmen. Der Platten-Reader für den Flash-Lumineszenz-Assay stellte die Temperatur auf 30 Grad Celsius ein. Stellen Sie den Platten-Reader so ein, dass er Luziferian Shake hinzufügt, und lesen Sie jede Vertiefung einzeln ab, um die Lumineszenz zu lesen, die auf Endpunkt-Messwert eingestellt ist. Eine Integrationszeit von fünf Sekunden und eine Sensitivitätsstufe von 180 für den Wiederfindungsassay zwischen den einzelnen Messwerten sind so eingestellt, dass sie fünf Minuten lang geschüttelt, um 20 Minuten verzögert und weitere fünf Minuten geschüttelt werden.

Laden Sie Delucci in den Injektor und stellen Sie den Injektor so ein, dass er 50 Mikroliter Luzifer abgibt, um eine Endkonzentration von etwa 23 Mikrogramm pro Probe zu erhalten, um das Verfahren zur Induktion von F-F-L-G-F-P-Inkubationszellen in fünf Millilitern synthetischem Komplettmedium ohne Uracil SC minus YURA bei 30 Grad Celsius zu beginnen, während es am folgenden Tag über Nacht rotiert. Messen Sie OD 600 und inokulieren Sie frische Kulturen in fünf Millilitern SC minus Yura auf OD 600 von etwa 0,2. Inkubieren Sie Kulturen mit einer Rotation bei 30 Grad Celsius, bis sie die logarithmische Phase erreichen, d. h. OD 600 zwischen 0,8 und 1,0 Zentrifugenzellen in konischen 15-Milliliter-Röhrchen bei 4.400 U/min für drei Minuten.

Dekantieren, Überstehen und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser. Übertragen Sie resuspendierte Zellen für 30 Sekunden bei 6.000 U/min in eine Mikrozentrifugenröhrchenzentrifuge und entsorgen Sie die überstehenden Reanimations-Suspendzellen in fünf Millilitern synthetischem vollständigem Medium ohne Uracil und Methionin, SC minus YURA minus met, inkubieren Sie Zellen in diesem Medium, während Sie eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius rotieren. Die Entfernung von Methionin induziert die Expression von F-F-L-G-F-P Nach einer Stunde entmutigten Zentrifugenzellen den Überstand und waschen DD H2O. Nach dem Verwerfen des DDH suspendieren zwei O Resus-Zellen in fünf Millilitern SC minus Edia, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Cycloheximid enthalten, um die Proteinexpression zu hemmen.

Fahren Sie sofort mit dem enzymatischen F-F-L-G-F-P-Wiederfindungsassay fort. Beginnen Sie mit diesem Verfahren unmittelbar nachdem die Zellen in Medien resuspendiert wurden, die Cycloheximid enthalten. Später wird von jeder Probe ein Milliliter aus der Messung von D 600 entnommen, um die Lumineszenz vor dem Heizschock zu messen.

Richten Sie zunächst Kontrollen ein, die einen Wasserblindwert und Zellen mit einem leeren Vektor in einer durchgehenden weißen 96-Well-Platte umfassen, und übertragen Sie dann 100 Mikroliter Zellen für jede Probe mit der gewünschten Anzahl von Replikaten. Beginnen Sie mit dem Lesen der Platte mit den programmierten Spezifikationen, um die FFL-MOTY von F-F-L-G-F-P zu denaturieren. Inkubieren Sie die Fünf-Milliliter-Kultur bei 42 Grad Celsius und schütteln Sie sie 25 Minuten lang.

Beginnen Sie mit den Lumineszenzmessungen im Erholungsassay unmittelbar nach der Entnahme der Zellen aus dem Inkubator, was einer Zeit von 0,0 entspricht. Messen Sie die Lumineszenz zum ersten Zeitpunkt und alle 30 Minuten für 90 Minuten. Um Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, zentrifugieren Sie einen Milliliter Zellen 30 Sekunden lang bei 6.000 U/min und entfernen Sie den Überstand der Resusse.

Suspendieren Sie das Zellpellet in zwei Mikrolitern DDH zwei o. Mischen Sie zwei Mikroliter Zellen plus zwei Mikroliter 2%Low Melt Agros auf einem Objektträger und fügen Sie ein Deckglas hinzu. Um eine einzelne Zellebene zu erhalten, drücken Sie einen Finger leicht in die Mitte des Deckglases und drehen Sie, bis sich das Deckglas nur noch schwer bewegen lässt.

Die Zellen werden auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 100-fach-Ölobjektiv sichtbar gemacht. Verwenden Sie DIC, um Zellen zu visualisieren, und den Fitz-Filter, um die GFP-Fluoreszenz zu visualisieren. Machen Sie mehrere Bilder für jeden Stamm zu jedem Zeitpunkt.

Für die Quantifizierung sollten die Felder für Bilder etwa 15 bis 30 Zellen für die quantitative postexperimentelle Analyse enthalten. Um dieses Verfahren zu beginnen, induzieren Sie F-F-L-G-F-P-Expressions- und Wärmeschockzellen, wie zuvor gezeigt, und zentrifugieren Sie dann die Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen bei 4.400 U/min für zwei Minuten. Überstand entsorgen und Zellen mit 500 Mikrolitern Wasser waschen.

Nach dem Verwerfen des Wassers werden die Zellen in 10 bis 15 Mikrolitern SC minus Yura suspendiert. Für jeden Stamm wird ein fünf mal fünf Millimeter großer Abschnitt einer SC minus Yura-Agar-Platte ausgeschnitten. Legen Sie den Agar-Abschnitt auf eine etwa 55 Millimeter große Glasbodenschale mit der Zahl-Null-Schale, wobei sich die Agar-Oberfläche am unteren Rand der Platte befand.

Pipettieren Sie vier Mikroliter Zellen nach oben und verteilen Sie sie mit der Pipettenspitze auf der Agaroberfläche. Etwa eine Minute stehen lassen. Lege dann mit einer Pinzette den Agar-Abschnitt mit der Vorderseite nach unten auf dieselbe Glasschale.

Drücken Sie die Zellen auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 100-fach-Ölobjektiv leicht nach unten. Verwenden Sie DIC, um Zellen zu visualisieren, und den Fit e-Filter zur Visualisierung der GFP-Fluoreszenz, indem Sie je nach Dichte der Kultur Koordinaten für zwei bis vier Fokusebenen für jeden Stamm festlegen. Stellen Sie die Kamera so ein, dass sie über einen Zeitraum von 90 Minuten alle fünf Minuten einen Z-Stapel von Bildern mit dem entsprechenden Bereich aufnimmt.

Um die Rolle des Hefeproteins HSP 1 0 4 bei der Rückfaltung von hitzedenaturierten Proteinen zu untersuchen, wurde ein Lumineszenz-Flash-Assay verwendet, um die Aktivität von F-F-L-G-F-P in Wildtyp- und HSP 1 0 4-Delta-Zellen vor dem Hitzeschock und unmittelbar nach dem Hitzeschock für jeden angegebenen Zeitpunkt zu überwachen. Die Ergebnisse zeigten einen schrittweisen Anstieg der Aktivität über 90 Minuten, der schließlich zu einer Wiederfindung von mehr als 80 % beim Wildtyp führte Zellen. Der Delta-Stamm HSP 1 0 4 erholte sich im gleichen Zeitraum um 19 % der ursprünglichen Aktivität. Darüber hinaus war das Ausmaß der initialen Inaktivierung im HSP 1 0 4 delta-Stamm viel höher, was durch die Aktivität von 26 % im Wildtyp gegenüber 11 % im HSP 1 0 4 delta angezeigt wird.

Dies deutet darauf hin, dass HS P 1 0 4 eine schützende Rolle bei der Vorspannung spielt oder während des thermischen Inaktivierungsschritts schnell mit der Denaturierung von F-F-L-G-F-P assoziiert, um den Verlust der enzymatischen Aktivität zu reduzieren. Populationsmikroskopie bestätigt. Die Zellen des Assays für die enzymatische Aktivität wurden 0, 30, 60 und 90 Minuten nach dem Hitzeschock entnommen und durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht

Die hellgrünen Punkte innerhalb der Zellen stellen die F-F-L-G-F-P-Aggregate dar. Die Quantifizierung erfolgte durch Zählung von etwa 100 Zellen in vier bis fünf Feldern und Berechnung des Prozentsatzes der Zellen, die Aggregate enthalten. Es wurde beobachtet, dass fast alle Zellen im HSP 1 0 4 delta-Mutantenstamm mindestens ein F-F-L-G-F-P-Aggregat beibehielten, verglichen mit der Anzahl der Aggregate im Wildtyp-Stamm, die innerhalb von 90 Minuten nach dem Hitzeschock einer Einzelzelle um 62% abnahm.

Die automatisierte Mikroskopie zeigte, dass F-F-L-G-F-P in Wildtyp-Zellen im Vergleich zu HSP 1 0 4 delta-Zellen mit einer höheren Rate resolubilisiert wurde. Diese Abbildung zeigt repräsentative Standbilder, die von einem ZS-Stack projiziert wurden, der über einen Zeitraum von 90 Minuten aufgenommen wurde. Darüber hinaus war die Dynamik der Proteinaggregate in Wildtyp- und HS P 1 0 4-Zellen sehr unterschiedlich, Delta-Zellen in den Wildtyp-Zellaggregaten neigten dazu, vor der Solubilisierung zu fusionieren, wie in diesem Film gezeigt.

In HSP 1 0 4 delta-Zellen fusionieren die Aggregate vor der Solubilisierung nicht und die Solubilisierungsrate ist geringer als in Wildtyp-Zellen Nach der Beherrschung. Diese Technik kann in etwa drei Stunden durchgeführt werden, beginnend mit Zellen der mittleren logarithmischen Phase.