Produktion von Xenopus tropicalis Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Wir beschreiben die Sammlung von unbefruchteten

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, einen zytoplasmatischen Extrakt aus unbefruchteten Xenopus tropic Kallus-Eiern herzustellen, der zur Rekapitulation vieler zellulärer Prozesse in vitro verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst Hormone injiziert werden, um den posttropischen Ena-Kallus zur Eiablage unbefruchteter Eier zu veranlassen. Als nächstes werden die Eier gesammelt, gewaschen und durch Zentrifugation zerkleinert und das Zytoplasma der Eizelle isoliert.

Dann wird der Extrakt verwendet, um Mikrotubuli, assoziierte Proteine und RNAs zu reinigen, um einen genomweiten Überblick über mRNA zu erhalten. Es werden Lokalisierungsergebnisse erzielt, die zeigen, dass Hunderte von mRNAs spezifisch mit myotischen Mikrotubuli assoziiert sind, basierend auf der Hochdurchsatzsequenzierung von Mikrotubuli-assoziierten RNAs. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Opus Lavis Eiextrakten besteht darin, dass zap tropic ein Sequenzgenom haben, das eine umfassende Identifizierung von transkribierten Sequenzen und exprimierenden Proteinen ermöglicht, was derzeit mit zap lavis nicht möglich ist, um X tropische Eier für die Isolierung von Extrakten zu erzeugen.

Beginnen Sie mit der Zubereitung von zwei Konzentrationen von humanem Choriongonadotropin oder HCG. Zuerst suspendieren wir 10.000 Einheiten lyophilisiertes HCG-Pulver in 10 Millilitern sterilem deionisiertem Wasser für eine Endkonzentration von 1000 Einheiten pro Milliliter. Kombinieren Sie dann einen Milliliter der verdünnten Lösung mit neun Millilitern Wasser für eine Endkonzentration von 100 Einheiten pro Milliliter.

Lagern Sie beide Lösungen am ersten Tag bei vier Grad Celsius zwischen zwei und 15:00 Uhr. Bereiten Sie vier bis sechs Frösche für die Eiablage vor, indem Sie sie in den dorsalen Lymphsack in der Nähe der Kloake mit 0,2 Millilitern von 100 Einheiten pro Milliliter HCG injizieren, um die Menge an Froschabfällen zu minimieren, die während der nachfolgenden Injektionen vorhanden sind. Lassen Sie die Frösche am zweiten Tag um zwei bis 15:00 Uhr fasten. Verabreichen Sie denselben Fröschen am nächsten Tag eine zweite identische Injektion. Wiederholen Sie die Injektion zwischen sieben und 10:00 Uhr, wie hier angegeben, um die Frösche für die Eiablage vorzubereiten, füllen Sie einen sechs Liter fassenden Plastikeimer mit frischem Tankwasser.

Die Frösche dazugeben und im Dunkeln bei 25 Grad Celsius aufstellen. Die Eiablage sollte innerhalb von vier Stunden beginnen und nach sieben Stunden abgeschlossen sein. Bereiten Sie in der Zwischenzeit Puffer, Lösungen und Medikamente gemäß dem Textprotokoll vor.

Um feuerpolierte Glaspastierpipetten herzustellen, brechen Sie das Ende von einer Fünf- und Dreiviertelzoll-Glaspipette ab, um eine breite Öffnung zu erhalten, und setzen Sie sie einer Flamme aus. Um die Spitze zu glätten. Bereiten Sie ein 500-Milliliter-Glasbecherglas für die Lagerung von Eiern vor, indem Sie eine 0,2%ige Gelatinelösung schwenken, um die Wände des Becherglases zu beschichten.

Entsorgen Sie dann die unbenutzte Gelatinelösung. Wenn die Eiablage abgeschlossen ist, sammelst du die Eier aus dem Plastikeimer und drückst jeden Frosch bei Bedarf einmal vorsichtig zusammen, um die restlichen Eier zu isolieren. Waschen Sie die Eier einmal mit Aquarienwasser und geben Sie sie mit gerade so viel Aquarienwasser auf den mit Gelatine überzogenen Schnabel, dass die Eier nass bleiben.

Um den Extrakt langsam zuzubereiten, geben Sie etwa 300 Milliliter eines XMMR an die Wand des Becherglases, um die physische Erregung der Eier zu minimieren, und lassen Sie sie absetzen. Dekantieren Sie den Überstand, um Schmutz zu entfernen, und wiederholen Sie die MMR-Wäsche. Zwei weitere Male nebenbei, um die Eier zu deieren, so viel MMR wie möglich abfüllen und 125 Milliliter frisch zubereitete Dey-Lösung hinzufügen. Etwa fünf Minuten lang ununterbrochen schwenken.

Nach ein paar Minuten sind die sich auflösenden Geleeschichten sichtbar. An dieser Stelle die Flüssigkeit umfüllen und die restlichen 125 Milliliter frische Geleelösung hinzufügen. Auch hier die Lösung kontinuierlich schwenken, bis die Eier sehr fest zusammenpacken und sich alle mit ihren pflanzlichen Polen zum Boden der Schüssel hin ausrichten.

Die nun de jelly Eier sind empfindlich gegenüber mechanischer Manipulation. So viel Flüssigkeit wie möglich schnell abfüllen und vorsichtig eine X XB-Waschlösung hinzufügen und schwenken, damit sich das X auf dem Boden des aktivierten Becherglases absetzen kann. X tropicalis-Eier, die dem zytostatischen Faktor oder dem Liquorarrest entkommen sind, erscheinen geschnürt.

Geschwollenes Weiß und wie ein Pseudo-Dekolleté neigen dazu, an der Oberfläche zu bleiben. Verwenden Sie eine Transferpipette aus Kunststoff, um diese zusammen mit Hautstücken und Strahlabfällen zu entfernen, und dekantieren Sie so viel Lösung wie möglich, bevor Sie das Waschen wiederholen. Noch zwei Mal, dann die Eier zweimal mit CSF XB waschen und dekantieren, bevor sie in CSF xb suspendiert werden.

Außerdem mit einer mit Gelatine behandelten, feuerpolierten Pipette. Übertragen Sie die Eier in Ultrazentrifugenröhrchen mit CSF XB plus und achten Sie darauf, dass das X nicht der Luft ausgesetzt wird. Legen Sie die Röhrchen in 15-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen mit einem Wasserkissen und schleudern Sie die Eier in einer klinischen Zentrifuge bei 200 g für eine Minute.

Erhöhe die Geschwindigkeit auf 800 GS und drehe dich 30 Sekunden lang. Verwenden Sie einen Aspirator, um so viel Puffer wie möglich aus den Eiern zu entfernen. Sie sollten oben fast trocken sein.

Dann die Eier schnell in eine sova RC six Zentrifuge umfüllen, die mit einem HB six Rotor ausgestattet ist, und 15 Minuten bei 17.000 GS und 20 Grad Celsius schleudern. Mit einer 18-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist. Entfernen Sie die gelbe zytoplasmatische Schicht zwischen der Pigment- und der Lipidschicht.

Durchstechen Sie dann die Seite des Röhrchens und ziehen Sie langsam am Spritzenzylinder, um die zytoplasmatische Extraktschicht zu sammeln, wobei Sie die Pigmentkörner so weit wie möglich vermeiden. Übertragen Sie es in ein neues Ultrazentrifugationsröhrchen. In ein Zentrifugenröhrchen aus Glas mit Wasserkissen geben und bei 17.000 GS bei 20 Grad Celsius 20 Minuten lang schleudern.

Nachdem Sie die Extraktion ein zweites Mal wiederholt haben, übertragen Sie das Zytoplasma in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen und schätzen Sie das Volumen, das typischerweise 300 bis 500 Mikroliter Extrakt pro Frosch aus einer gesunden Froschkolonie beträgt. Fügen Sie dann Cyto D und Leptin, PEPs, Statin und Chios, Statin oder LPC hinzu. Fügen Sie die Endkonzentrationen von jeweils eins bis 1000 hinzu.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um gut zu mischen, und vermeiden Sie Luftblasen, um maximale Aktivität zu erhalten. Lagern Sie den Extrakt und führen Sie experimentelle Manipulationen bei Raumtemperatur durch, um einen Aqua-Extrakt von 100 bis 200 Mikrolitern herzustellen. Taxol in einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren zugeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Für Kontrollreaktionen behandeln Sie ein äquivalentes Volumen des Extrakts mit dem Mikrotubuli-Destabilisierungsarzneimittel, kein Conazol und reservieren Sie 100 Mikroliter unbehandelten Extrakt für die Analyse, verdünnen Sie die mit dem Arzneimittel behandelten Extrakte mit 10 Volumina BRB 80 plus 30 % Glycerin, dann montieren Sie 14 Milliliter Polypropylenröhrchen mit rundem Boden, die ein 10 Milliliter Kissen von B rrb 80 plus 60 % Glycerin enthalten. Anschließend die mit dem Medikament behandelte Extraktreaktion mit einer Pipettenspitze mit breitem Durchgang vorsichtig auf das BRB 80 plus 60%ige Glycerinkissen auftragen und mit Röhrchenadaptern 10 Minuten lang bei 17.000 GS und 20 Grad Celsius zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand mit unsedimentiertem Extraktmaterial und waschen Sie die Grenzfläche zweimal mit deionisiertem Wasser für die mit Taxol behandelte Probe.

Saugen Sie das verbleibende Kissenvolumen langsam an. Achten Sie darauf, das gelartige Pellet, das Mikrotubuli, Mikrotubuli-assoziierte Proteine und Mikrotubuli-assoziierte RNAs enthält, nicht zu stören. Die Probe, die nicht mit Cortisol behandelt wurde, enthält kein sichtbares Material.

Wir suspendieren das Pellet in einem Milliliter Triazol und fahren mit den Anweisungen des Herstellers zur Isolierung von RNA fort, bis zu 100 Mikroliter unbehandelter Extrakt können direkt in einem Milliliter Triol resuspendiert werden. Verwenden Sie schließlich ein kommerziell erhältliches Kit zur Vorbereitung einer Transkriptombibliothek, die für die RNA-Sequenzierung geeignet ist In dieser Abbildung. Die Kumasi-Gel-Analyse von Mikrotubuli, die aus X-tropischen Extrakten gereinigt wurden, die mit Taxol behandelt wurden, bestätigt, dass Alpha-Beta-Tubulin in einer Taxol-abhängigen Weise sedimentiert und die wichtigste Proteinspezies darstellt, die in diesen Präparaten zurückgewonnen wird.

Niedrigere Konzentrationen zusätzlicher Proteine sind auch im Taxol-Pellet vorhanden, jedoch nicht in Zubereitungen, die mit dem Mikrotubuli-Depolymerisationsarzneimittel nool behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass Proteine in der Taxol-Fraktion Mikrotubuli-assoziierte Proteine sind, wie hier zu sehen. Die Analyse der RNA-Zusammensetzung von X-Tropic-Extrakten deutet darauf hin, dass sowohl RRNA als auch TRNA in den Liquorextrakten und dem Mikrotubuli mit Taxol-Pellet vorhanden sind, was mit früheren Ergebnissen übereinstimmt. Diese Translation erfolgt an Mikrotubuli und Spindeln in X lavis Ei-Extrakten.

Eine hier gezeigte Linienspur der Gelprojektion zeigt, dass das mRNA-Signal in den Mikrotubuli, die Taxol-Pellets enthalten, deutlich niedriger ist, vor allem in der Region, die über 28 S-R-R-N-A wandert, was darauf hindeutet, dass eine Untergruppe von mRNAs mit Mikrotubuli in x tropic cosedimentiert. Nach diesem Verfahren wird nachgedacht. Andere Methoden wie die Zellzyklusanalyse können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie lokalisierte mRNAs den Aufbau der myotischen Spindel beeinflussen.