Name: A Caenorhabditis elegans Modell-System für Amylopathy Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Erfahren Sie, wie Amyloid-Beta-Toxizität in C. elegans untersucht wird, um neuronale Funktion und Überleben zu bewerten. Diese Methode nutzt transgene Würmer und Chemotaxis-Assays für Neurodegenerationsforschung.

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<p class="jove_content"&gt; Wir danken Dr. Shuang Liu für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Die PCL12 Konstrukt war ein Geschenk Form Dr. Christopher D.-Link. Diese Arbeit wurde von zwei National Science Foundation Zuschüsse (0842708 und 1026958) und ein AHA Zuschuss (09GRNT2250529) auf FS unterstützt.</p

1. Bau von transgenen Worms <ol><li> Transformation. <ol><li> Bereiten Injektion Pads. Geben Sie einen Tropfen von heißem, 2% Agarose in Wasser gelöst, auf ein Deckglas. Schnell stellen ein zweites Deckglas auf dem Tropfen und klopfen es. Nachdem die Agarose erstarrt ist, Dia-Deckgläser auseinander, und backen das Deckglas-Pad in einem Vakuumofen bei 80 ° CO / N. </li><li> Ziehen Pipetten. Wir verwenden eine Sutter P-97 Abzieher 1/0.5 mm OD / ID Borosilikatglas Kapillaren mit Faden ziehen. Pipetten mit geschlossener Spitze, die offen zu einem späteren Zeitpunkt unterbrochen geschmiedet. </li><li> Bereiten Injektion mischen. Machen Sie das Gemisch, das die Einspritzung DNA von Interesse (20 ng / ul pro Konstrukt) zzgl. leer Plasmid-DNA zu einer endgültigen Konzentration von 150 ng / ul. Zentrifuge die Injektion Mischung, jede Verunreinigung zu entfernen. Dieser Schritt ist wichtig, weil Verunreinigungen reduzieren Transformationseffizienz. Übertragen Sie die Top-5-ul (Ablagerungen und andere Verunreinigungen sammeln sich im Boden) in ein frisches Röhrchen zu be in Injektion verwendet. </li><li> Legen Injektion Mischung durch Kapillarwirkung. Der Boden der Pipette in der Injektion Mischung getaucht. Typischerweise 0,5 ul ausreichen, um 100 Würmer injizieren. </li><li> Legen Injektionspipette. Legen Sie die Pipette auf den Halter des Mikromanipulators und brechen sie offen durch Reiben ihrer Spitze gegen die Kante eines Deckglas auf einem Objektträger aus Glas oder alternativ gegen Schmutz auf der Agarose-Pad angebracht. Dies ist ein entscheidender Schritt, da zu groß Tipps Schäden der Wurm zu klein und Tipps sind leicht verstopft. Die Qualität der abgebrochene Spitze kann durch die Form und vor allem durch die Strömungsgeschwindigkeit gemessen werden. Die Fließgeschwindigkeit kann durch die Größe der Blasen, die sich aus der offenen Spitze in einem Tropfen Halogenkohlenstoff 700 Öl in Reaktion auf einen Einspritzdruck eingetaucht beurteilt werden. </li><li> Übertragen Würmer Injektion Pad. Geben Sie einen Tropfen von 700 Halocarbonöl auf einer Spritzgießmaschine Pad und übertragen mehrere (1 oder 2 für Anfänger) Würmer auf das Öl. Verwenden Sie einen Wurm holen, um die Würmer nach unten drücken, auf das Kissen, bis diey auf der Agarose haften. Worms sollte in Reihen mit ventralen Seiten in die gleiche Richtung orientiert. Berühren Wurm den Kopf. Wenn nach mehreren Versuchen die Würmer auf dem Pad nicht einhalten, mit einem frischen Pad ersetzen oder erhöhen Agarose Dicke und / oder Konzentration. </li><li> Legen Sie die Pipette in die Wurm. Durch Bewegen der Bühne, positionieren Sie den Wurm unter der Pipette. Positionieren Sie die Pipette in den zentralen Kern der Gonade, weil seine Zytoplasma von vielen Keimzelle Kernen gemeinsam genutzt wird. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, die injiziert DNA viele Nachkommen zu liefern. Die Pipette sollte liegen fast parallel zu der Schnecke (~ 15 ° -25 ° Winkel). Drücken Sie vertikal die Spitze der Pipette nach unten des Wurms Körper, bis die Haut gedrückt wird. Dann vorsichtig am Manipulator tippen, um die Spitze Einsetzen induzieren. Für beste Ergebnisse spritzen beide Keimdrüsen. </li><li> Injizieren Sie die DNA-Lösung. Üben Sie Druck auf die Pipette, bis die Gonade schwillt an. Stoppen Sie den Fluss und ziehen Sie den Wurm aus der Pipette. Testen Sie die Nadel für Durchfluss und verschieben Sie dannzum nächsten Wurm, und wiederholen Sie die Schritte Injektion. </li><li> Recover die Würmer: Fügen Sie einen Tropfen (~ 10 ul) Erholung Puffer auf die Würmer und inkubieren, bis die Würmer schwimmen beginnen. In das gleiche Volumen M9, warten, bis wieder Würmer Schwimmen und mehrmals wiederholen, bis die Lösung ist meist M9. Individuell übertragen Würmer gesetzten Platten. </li></ol></li><li> Integration. <ol><li> Zeigen 40 gesund, wohlgenährt, L4 Würmer in eine frische Platte </li><li> Irradiate mit γ-ray mit 4.000 rad für 40 min. Übertragen bestrahlten Würmer (P0) in frischen, OP50 ausgesät Platten (4 Würmer / Platte). Worms kann alternativ mit einer Dosis von 300 J / m 2 UV-Vertices bestrahlt werden. </li><li> Übertragen 10-20 F1 Transformanten von jeder Platte zu einzelnen Platten bezeichnen die Platten mit dem entsprechenden P0 Ursprungs. </li><li> Einzel-out 2-4 F2 Transformanten für jeden F1 zu getrennten Platten. Überprüfen Sie die F3 Nachkommen für 100% Transmission der Transformation Marker. Typischerweise 1-3% der Nachkommen einer bestrahlten Wurm will eine Integration Veranstaltung. </li><li> Machen Bestände von drei oder mehr unabhängigen Transformantenlinien. </li></ol></li></ol> 2. Behavioral Assays <ol><li> Alter-Synchronisation. <ol><li> Wachsen Würmer in Standard 10 cm NGM-Platten + OP50 E. coli, bis eine große Population von schwangeren Erwachsenen erreicht ist (3-5 Tage). </li><li> Sammeln Sie die Würmer in 50 ml Falcon-Röhrchen durch die Aussetzung in 1 ml M9-Puffer. </li><li> 5 ml M9-Puffer und Zentrifuge bei 450 xg für 3 min. Überstand verwerfen. Wiederholen Sie 3-4x. </li><li> Am Ende der letzten Zentrifugation den Überstand entfernen und hinzufügen 10 Bände der grundlegenden Natriumhypochlorit-Lösung (0,5 M NaOH, 1% Natriumhypochlorit frisch gemischt) zu den pelletierten Würmer. Inkubation bei RT für ~ 10 min. Die Lyse Reaktion kann, indem ein Tropfen der Lysereaktion auf einem Deckglas und Prüfung der Würmer unter dem Mikroskop beobachtet werden. Bei rund 80% der Würmer gebrochen werden sollte die Reaktion gestoppt werden. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion durch Lyse adding das gleiche Volumen an sterilem Puffer Ei. </li><li> Sammeln Sie die Eier (und Karkassen) durch Zentrifugation bei 450 xg für 5 min. </li><li> Waschen Sie die Eier mit sterilem Ei Puffer 2-3x. </li><li> Inkubieren Sie die Eier O / N in M9-Puffer und Samen sie auf Standard NGM-Platten. </li></ol></li><li> Chemotaxis-Assay. <ol><li> Bereiten Sie mehrere Stücke von Agar etwa 0.5x0.5x0.5 cm. Wir deponieren die Agar in einer 10-cm-Platte und wir schneiden die Agar Brocken von dort. </li><li> Einweichen Agar Chunk in einer Lösung, die das gewünschte Lockstoff (bei Sättigung nahe-sättigenden Konzentrationen) für 2 Stunden. Typische Lockstoffe Lysin (0,5 M), Biotin (0,2 M). </li><li> Deposit ein Agar-Stück in einer 10 cm Testplatte in dem der Ort einer Test-Ort und ein Kontrollfeld markiert wurden (Abb. 1A). Erlauben Äquilibrierung und Bildung eines Gradienten O / N (1B). Bereiten Sie 5 Platten für ein einzelnes Experiment. </li><li> Vor dem Experiment werden 10 ul 20 mM NaN 3 (anesthetic) an jedem Punkt. </li><li> Platz 20 Jahren synchronisiert Würmer in der Mitte der Platte. Die Platte wird in den Inkubator bei 20 ° C. </li><li> Nach 1 Stunde, zählen die Tiere auf den Test / Kontrolle Flecken und berechnen Sie die Chemotaxis-Index (CI) wie folgt: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" /> wobei N, N-Test und N Cnt., geben Sie die Gesamtzahl der Tiere, die Zahl der Tiere in der Prüfung vor Ort und die Anzahl der Tiere in der Kontrollgruppe vor Ort. </li></ol></li></ol> 3. Primäre embryonale Zellkultur <ol><li> Lyse Würmer wie im Alter-Synchronisation beschrieben. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von Lyse das gleiche Volumen an sterilem Ei Puffer und Zentrifuge bei 450 xg für 5 min. Sanft Überstand verwerfen dabei darauf achten, nicht zu verlieren pelletiert Eier. Wiederholen Sie 2-3x oder bis Überstand klar ist. </li><li> Sedimentierte Eier (und Karkassen) In 2 ml sterile Ei-Puffer und 2 ml sterile 60% Saccharose in Ei-Puffer. Mischen Sie diese Lösung, bis Eier vollständig resuspendiert (wie sie zu Klumpen unter Zentrifugation neigen) von Hand oder durch Vortexen. </li><li> Zentrifuge bei 450 xg für 15 min. </li><li> Vorsichtig den Überstand (mit den Eiern) in ein steriles Röhrchen. Verwerfen Pellet enthält die Kadaver und andere Nebenprodukte der Lyse. </li><li> Rückstände von Saccharose durch Resuspendieren die Eier in Ei-Puffer und Zentrifugieren bei 450 xg für 5 min. Vorsichtig sammeln und den Überstand verwerfen. 3x wiederholen. </li><li> Unter einer laminaren Haube resuspendieren pelletiert Eier in sterile Ei-Puffer mit 1 U / ml Chitinase bei RT, um die Eierschalen zu verdauen. Nach 30 min beginnen, um die Reaktion (unter einem inversen Mikroskop Zellkultur) zu überwachen. Jede Charge von Chitinase hat eine etwas andere Tätigkeit. Typischerweise Verdauung in 1 h abgeschlossen. </li><li> Bei etwa 70-80% Eierschalen werden von Chitinase Add CM-15 (L-15 Zellkultur med. verdautium enthaltend 10% fötales Rinderserum, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin). Dissociate Zellen unter Verwendung einer Spritze mit einer 27-Gauge. Filtern Sie die Zellsuspension mit einer 5,0 um Filter zu intakten Embryonen zu entfernen, Klumpen von Zellen und Larven. </li><li> Pellet das dissoziierte Zellsuspension durch Zentrifugation bei 450 xg für 15 min. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in CM-15 Zellkulturmedium. </li><li> . Platte dissoziierten Zellen auf Glas-Deckgläschen zuvor mit Erdnuss-Lectin (0,1 mg / ml) in Wasser gelöst beschichtet Hinweis: Zellen müssen an dem Substrat, um zu differenzieren. </li><li> Die Zellen können bei RT (16-20 ° C) in Luft für mehr als 2 Wochen aufrechterhalten werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Hier beschreiben wir einen kombinierten Ansatz, um zelluläre und molekulare Aspekte der amylopathies mit C. studieren elegans. Die Vorteile dieses Ansatzes sind:. 1) niedrige Kosten C.elegans im normalen Petrischale mit Bakterien geimpft gehalten, bei Raumtemperatur. 2) Leistungsstarke Genetik. Transgene Tiere können in wenigen Monaten erreicht werden und eine Vielzahl von Promotorsequenzen ist, um die Expression des gewünschten Gens in spezifischen Neuronen fahren. 3) Einfach, gut charakteris...

Amyloid beta (Aß) ein Peptid mit 36-43 Aminosäuren, die nach sequentieller Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) durch β und γ-Sekretase 1 gebildet wird. Die γ-Sekretase verarbeitet die C-terminalen Ende der Aß-Peptid und ist verantwortlich für die variable Längen 5. Die häufigsten Formen von Aß Aß sind 40 und 42 Aß, wobei letzteres häufiger pathologische Zustände wie AD 5 zugeordnet. Bei hohen Konzentrationen Aß Form β-Faltblättern, dass aggregieren zu bilden Amyloid-Fibrillen 6. Fibrillen Ablagerungen sind der Hauptbestandteil der senilen Plaques umliegenden Neuronen. Beide Plaketten und diffusionsfähig, nicht-Plaque Aß-Oligomere, wird angenommen, dass die zugrunde liegenden pathogenen Formen von Aß darstellen. Laboruntersuchung der neuronalen amylopathies wird durch die Tatsache, dass diese Bedingungen Zeitlicher Verlauf kompliziert. Daher ist es important zu genetisch manipulierbaren Tiermodellen komplementären entwickeln Mäuse-mit kurzen Lebensdauer. Diese Modelle können verwendet werden, um bestimmte Aspekte der amylopathies-Regel zellulären und molekularen und aufgrund ihrer Einfachheit dazu beitragen, das Wesen des Problems zu erfassen aufzuklären. Der Wurm Caenorhabditis elegans ist diese Kategorie fällt. Es hat eine kurze Lebensdauer, ~ 20 Tage und darüber hinaus grundlegende zelluläre Prozesse einschließlich der Regulierung der Genexpression, Protein-Trafficking, neuronale Konnektivität, Synaptogenese, Zellkommunikation und Tod sind ähnlich wie Säugetierzellen 7. Einzigartige Merkmale des Wurms enthalten leistungsfähige Genetik und der Mangel an einem Schiff, das zu neuronalen Schäden unabhängig von Gefäßschäden studieren können. Andererseits begrenzt der Mangel eines Gehirns die Verwendung von C. elegans zu studieren viele Aspekte der Neurodegeneration. Darüber hinaus kann die Wiedergabe und Identifizierung der anatomischen Verteilung der Läsionen in diesem Organismus durchgeführt werden. Andere Limittionen wie die Schwierigkeit, sowohl Unterschiede in der Genexpression Profile und Wertminderungen von komplexen Verhalten und Memory-Funktion zu beurteilen. Hier beschreiben wir Methoden, um C zu erzeugen elegans Modelle amylopathies.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. NGM</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>3 g</td></tr><tr><td>bakteriologischer Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td>17 g</td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>AMRESCO</td><td>J636</td><td>2,5 g</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td>Auf 975 ml</td></tr><tr><td colspan="4">Sterilisiert durch Autoklavieren, dann die folgenden Elemente hinzufügen und gut mischen</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml von 1 M Stamm</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>1 ml von 1 M Stamm</td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3045</td><td>1 ml von 5 mg/ml Stamm (in Ethanol)</td></tr><tr><td>Kaliumphosphatpuffer</td><td></td><td></td><td>25 ml von 1M Stamm</td></tr><tr><td colspan="4">2. Kaliumphosphatpuffer</stark></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>108,3 g</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>35,6 g</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td>Auf 1 L</td></tr><tr><td colspan="4">Sterilisiert durch Autoklavieren</td></tr><tr><td colspan="4">3. M9 Puffer</stark></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat einbasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>3 g</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>6 g</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>1 ml von 1 M Vorrat</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td>Auf 1 L bringen</td></tr><tr><td colspan="4">Sterilisiert durch Autoklavieren</td></tr><tr><td colspan="4">4. Eipuffer (pH 7,3, 340 mOsm)</stark></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>118 mM</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>48 mM</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td>auf 1 l</td></tr><tr><td colspan="4">Sterilisiert durch Autoklavieren</td></tr><tr><td colspan="4">5. CM-15</td></tr><tr><td>L-15 Kulturmedium</td><td>Gibco</td><td>11415</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>50 g/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Auf 340 mOsm einstellen, dann steril in autoklavierte Flaschen filtern und bei 4 μg lagern; C</td></tr><tr><td colspan="4">6. Sonstige Reagenzien</stark></td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstoff 700 Öl</td><td>Halogenkohlenwasserstoff Produkte</td><td>9002-83-9</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; m Acrodisc Spritzenvorsatzfilter</td><td>PALL Co.</td><td>4199</td><td></td></tr><tr><td>Chitinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6137-5UN</td><td></td></tr><tr><td>Lektin (Erdnuss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhypochloritlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

a<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; modell-system für amylopathy study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy ist ein Begriff, der anomalen Synthese und Akkumulation von Amyloid-beta (Aß) im Gewebe mit der Zeit beschreibt. Aß ist ein Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) und wird in Lewy-Körper-Demenz, Einschlusskörperchenmyositis und zerebrale Amyloid-Angiopathie 1-4 gefunden. Amylopathies schrittweise mit der Zeit entwickeln. Aus diesem Grund einfache Organismen mit kurzen Lebensdauer kann helfen, molekulare Aspekte dieser Bedingungen aufzuklären. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle zu Aß-vermittelte Neurodegeneration mit den Wurm Caenorhabditis elegans zu untersuchen. So konstruieren wir transgene Würmer durch Einspritzen kodierende DNA menschlichen Aß 42 in die Syncytial Keimdrüsen von erwachsenen Hermaphroditen. Transformantenlinien werden durch eine Mutagenese-induzierte Integration stabilisiert. Nematoden sind Alter durch das Sammeln und Säen ihre Eier synchronisiert. Die Funktion der Neuronen, Aß 42 ist in opportun Verhaltensstörungen Assays getestet (Chemotaxis Assays). Primäre neuronale Kulturen aus Embryonen gewonnen werden, um Verhaltensänderungen Daten zu ergänzen und die neuroprotektive Wirkung von anti-apoptotischen Verbindungen testen.

Mit unserem Protokolle untersuchen wir die Auswirkungen der menschlichen Aß 42 Oligomer auf die neuronale Funktion 8. Ein Fragment, das menschliche Aß 42 und der künstlichen Signalpeptid kodierende Sequenz von Feuer Vektor pPD50.52 Konstrukt wurde aus PCL12 9 unter Verwendung der Primer, die eine Sma 1 Restriktionsendonukleasestelle an den Enden eingeführt. Das Fragment wurde dann in einem Konstrukt, das ein 2.481 bp FLP-6-Promotor-Sequenz in den Vektor pPD95.75 Feuer...

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu studieren<em&gt; C. elegans</em&gt;. Wir zeigen, wie Würmer, die humane Aß konstruieren<sub&gt; 42</sub&gt; In Neuronen und wie sie ihre Funktion in Verhaltens-Assays zu testen. Wir zeigen, wie man weiter primären neuronalen Kulturen, die für pharmakologische Tests verwendet werden können, zu erhalten.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen der Toxizität von Amyloid-beta auf die neuronale Funktion und das Überleben von Neuronen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst transgene C. elegans-Würmer konstruiert werden, die ein Amyloid-beta-Peptid mit einem GFP-Reporter in den SE-Sinnesneuronen exprimieren. Anschließend wird die Verhaltenswirkung der Expression von Amyloid-beta in den SE-Neuronen mittels eines Chemotaxis-Assays bewertet.Der dritte Schritt besteht darin, primäre Kulturen von aSE-Neuronen zu gewinnen und anschließend die kultivierten Neuronen mit pharmakologischen Substanzen wie Q-V-D-O-P-H zu behandeln, um die toxische Wirkung von Amyloid-Beta zu unterdrücken. Letztendlich können die Ergebnisse die Auswirkungen der Amyloid-Beta-Toxizität auf die Funktion und das Überleben von aSE-Neuronen mittels Verhaltens- und pharmakologischer Tests aufzeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Neurodegeneration zu beantworten, beispielsweise durch die Aufklärung spezifischer zellulärer und molekularer Mechanismen.Den zugrunde liegenden neurotoxischen Wirkungen von Amyloid-Beta-Oligomeren. Die Verfahren werden von Dr. Zing Dwan, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Für die Transformation sind 2 % Agarose-Injektionspolster erforderlich. Geben Sie einen Tropfen heißer Agarose, gelöst in Wasser, auf ein Glas-Deckglas und platzieren Sie schnell ein zweites Deckglas auf den Tropfen, wobei Sie es leicht andrücken.Beim Herstellen der Injektionsmischung unbedingt zentrifugieren und die oberen fünf µL, frei von Partikeln und anderen Verunreinigungen, in ein frisches Gefäß für die Injektionsladung überführen. Die Injektionsmischung und leeres Plasmid durch Kapillarwirkung in eine Injektionspipette aufnehmen. Eine halbe µL-Menge reicht gewöhnlich aus, um 100 Würmer zu injizieren. Um die Öffnung der Injektionspipette zu vergrößern, deren Spitze gegen den Rand eines auf einem Objektträger befestigten Deckglases in Halocarbon-700-Öl reiben. Die Qualität der Öffnung ist entscheidend.Es wird anhand der Spitzenform beurteilt, und vor allem anhand der Flussrate, die durch den Fluss und die Größe der Bläschen, die an der Pipettenspitze als Reaktion auf den Injektionsdruck entstehen, bewertet wird. Geben Sie nun einen Tropfen 700 Hallow Carbon Oil auf ein Injektionspad und übertragen Sie mehrere Würmer auf das Pad. Verwenden Sie einen Wurmlöffel, um die Würmer auf das Pad zu drücken, bis sie an den Aros haften.Die Würmer sollten in Reihen ausgerichtet sein, wobei ihre ventralen Seiten übereinstimmen. Vermeiden Sie es, ihre Köpfe zu berühren. Falls die Würmer nach mehreren Versuchen nicht an dem Pad haften, probieren Sie ein neues Pad aus oder erhöhen Sie die Dicke oder Konzentration des Agarose-Pads.Setzen Sie nun die Pipette in den Wurm ein. Bewegen Sie zunächst den Objekttisch, um den Wurm unter der Pipette zu positionieren. Positionieren Sie die Pipette anschließend neben dem zentralen Kern des Gonads.Da sein Zytoplasma von vielen Keimzellkernen geteilt wird, erhöht sich dadurch die Wahrscheinlichkeit, dass die injizierte DNA an die Nachkommen weitergegeben wird. Die Pipette sollte nahezu parallel zum Wurm liegen. Drittens bewegen Sie die Spitze vertikal in Richtung des Körpers, bis die Haut eingedrückt wird.Zum Schluss den Manipulator vorsichtig antippen, um die Einführung der Pipettenspitzen zu bewirken. Nun die DNA-Lösung injizieren. Druck auf die Pipette ausüben, bis sich die Gonaden aufblähen.Dann stoppen Sie den Fluss und ziehen den Wurm von der Pipette ab. Prüfen Sie den Nadelstrom und injizieren Sie anschließend die anderen Gonaden, bevor Sie zum nächsten Wurm übergehen. Nach den Injektionen geben Sie etwa 10 Mikroliter Rekonvaleszenzpuffer zu den Würmern hinzu und warten, bis sie zu schwimmen beginnen.Wenn die Würmer schwimmen, eine gleiche Menge M-neun-Puffer hinzufügen. Sobald die Würmer mit dem Schwimmen fortfahren, weiteren M-neun-Puffer hinzufügen, bis die Lösung überwiegend aus M-neun-Puffer besteht. Überführen Sie nun jeden Wurm auf eine angefeuchtete Petrischale.Sammeln Sie GR-Würmer in einem Milliliter M9-Puffer in einem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Waschen Sie die Würmer anschließend mit M9-Puffer durch wiederholte Zentrifugation und Lösungsaustausch, bis der M9-Puffer nach der Wäsche klar ist. Geben Sie danach 10 Volumina basische Hypochloritlösung zu den Würmern.Die pelletierten Würmer werden bei Raumtemperatur inkubiert, bis etwa vier Fünftel von ihnen zerbrochen sind, was typischerweise 10 Minuten dauert. Überwachen Sie die Reaktion, indem Sie Aliquots entnehmen und unter dem Mikroskop betrachten. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens steriler Eipufferlösung.Danach sammeln Sie die Eier und Kadaver durch Zentrifugation bei 450 G während fünf Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Geben Sie ein gleiches Volumen Eipuffer zurück und zentrifugieren Sie das Gefäß erneut bei 450 G während fünf Minuten.Wiederholen Sie den Vorgang, bis das Pufferlösung klar ist. Inkubieren Sie die Eier nun über Nacht in M9-Puffer und säen Sie sie am nächsten Tag auf standardmäßige NGM-Platten aus. Bereiten Sie mehrere Agarwürfel vor, die etwa einen halben Zentimeter Kantenlänge aufweisen.Die Agar-Stücke zwei Stunden lang in einer Lösung mit dem gewünschten Lockstoff einweichen. Ein Agar-Stück in eine 10 cm große Testplatte geben, in der die Positionen einer Teststelle und einer Kontrollstelle markiert wurden. Pro Experiment fünf derartige Platten herstellen.Lassen Sie die Platten über Nacht bei 20 Grad Celsius stehen, damit sich ein chemischer Gradient bildet. Vor dem Experiment geben Sie 10 µL einer 20 mM Natriumazid-Lösung auf jeden Punkt der Platten. Dies wirkt als Anästhetikum.Beginnen Sie das Experiment, indem Sie 20 alterssynchronisierte Würmer in die Mitte der Platte geben und die Platte dann eine Stunde lang in einen Inkubator bei 20 Grad Celsius stellen. Zählen Sie nach einer Stunde die Tiere auf den Test- im Vergleich zu den Kontrollstellen und berechnen Sie den CI-Index. Nachdem die gr-Würmer lysiert und die Eier sowie Kadaver wie zuvor beschrieben gereinigt wurden, resuspendieren Sie sie in zwei Milliliter sterilem Ei-Puffer und geben zwei Milliliter sterilem 60 %igen Saccharoselösung in Ei-Puffer hinzu.Anschließend das Gefäß von Hand oder mit dem Vortex gründlich mischen, bis die Eier vollständig resuspendiert sind. Die resuspendierten Eier bei 450 ×g für 15 Minuten zentrifugieren. Danach vorsichtig den eihaltigen Überstand sammeln und das Pellet verwerfen, um den restlichen Saccharose zu entfernen; die Eier anschließend in Eipuffer resuspendieren und bei 450 ×g für fünf Minuten zentrifugieren.Sammeln Sie das Überstandsvolumen vorsichtig ab und entsorgen Sie es, und wiederholen Sie den Reinigungsvorgang anschließend dreimal im Sicherheitswerkbank. Verwenden Sie sterilen Eipuffer, der eine Einheit pro Milliliter Chitinase enthält, um die pelletierten Eier erneut in Suspension zu bringen. Lassen Sie die Eier 30 Minuten bei Raumtemperatur verdauen und überwachen Sie dann den Reaktionsverlauf unter einem invertierten Zellkultur-Mikroskop.Wenn 70 bis 80 % der Eierschalen verdaut sind, fügen Sie fünf Milliliter vollständiges L-15-Kulturmedium oder CM-15 hinzu. Um die Zellen zu isolieren, dissoziieren Sie diese, damit sie keine Klumpen bilden, indem Sie die Suspension mehrmals durch eine 27-Gauge-Nadel leiten. Danach lassen Sie die Lösung durch eine Spritze mit einem fünf-Mikrometer-Filter laufen.Sedimentieren Sie die dissoziierte Zellsuspension durch Zentrifugation bei 450 G für 15 Minuten. Anschließend entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellpellets in CM 15. Um sicherzustellen, dass die Zellen dissoziiert sind, überprüfen Sie die Suspension unter dem Mikroskop.Schließlich die dissoziierten Zellen auf zuvor beschichtete Glasdecken plattieren. Mit Erdnuss-Lektin können die Zellen bei Raumtemperatur unter normaler Luftatmosphäre über zwei Wochen lang gehalten werden. Mithilfe der beschriebenen Transformationsmethoden wurde ein transgener Wurm konstruiert, der menschliches A Beta 42 in den ASI-Neuronen exprimiert, also in Neuronen, die wasserlösliche Attraktanten wie Biotin mittels Chemotaxis-Assay detektieren.Sieben Tage alte transgene Würmer wurden getestet. Die Kontrollen hatten keine Schwierigkeiten, Biotin zu finden. Im Gegensatz dazu konnten nur wenige Würmer, die Beta-42 exprimierten, die Lockstoffstelle finden.Der Chemotaxis-Index für Biotin betrug 0,68 im Vergleich zu 0,12 für die Kontroll- und Versuchswürmer nach drei bis vier Tagen. Es zeigte sich außerdem ein geringer, aber nachweisbarer Rückgang des Index. Eine kultivierte A-SER-Neuron-Zelle im Alter von vier Tagen, die nach neun Lebens tagen noch GFP exprimierte.Jedoch verschwand die GFP-Fluoreszenz, und es wurde eine Apoptose vermutet, um diese Theorie zu überprüfen. Primäre A-SER-Neurone wurden wie beschrieben hergestellt und mit einem Breitband-Caspase-Inhibitor ergänzt. Wie erwartet, stoppte die Behandlung den Verlust der Fluoreszenz, was bestätigte, dass die Expression von humanem A-beta-42 in A-SER-Neuronen Apoptose auslöst.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die eleganten transgenen Würmer herstellt, sie in Verhaltensversuchen untersucht und wie man eine Primärkultur aus Ambrose erhält.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Assaying β-Amyloid-Toxizität mit Hilfe eines transgenen C. elegans Modell

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