A Caenorhabditis elegans Modell-System für Amylopathy Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen der Amyloid-Beta-Toxizität auf die neuronale Funktion und das Überleben zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst transgene C-Eleganz-Würmer konstruiert werden, die ein Amyloid-Beta-Peptid mit einem GFP-Reporter in einem SE sensorischen Neuronen exprimieren. Als nächstes wird die Verhaltenskonsequenz der Expression von Amyloid-Beta in einem SE-Neuron durch einen Chemotaxis-Assay bewertet.

Der dritte Schritt besteht darin, Primärkulturen von SE-Neuronen zu erhalten und dann kultivierte Neuronen mit pharmakologischen Wirkstoffen wie Q-V-D-O-P-H zu behandeln, um die toxische Wirkung von Amyloid-Beta zu unterdrücken. Letztendlich können die Ergebnisse die Auswirkungen der Amyloid-Beta-Toxizität auf die Funktion und das Überleben von SE-Neuronen durch Verhaltens- und pharmakologische Assays zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Neurodegeneration zu beantworten, wie z.B. die Aufklärung spezifischer zellulärer und molekularer Mechanismen.

Zugrunde liegende neurotoxische Wirkungen von Amyloid-Beta-Oligomeren. Die Verfahren werden von Dr. Zing Dwan, einem Postdoc aus meinem Labor, demonstriert. Für die Umwandlung werden 2%agros-Injektionspads benötigt. Geben Sie einen Tropfen heißen, in Wasser gelösten Aros auf einen gläsernen Deckglas, legen Sie schnell einen zweiten Deckschirm auf den Tropfen und klopfen Sie leicht darauf.

Bei der Herstellung der Injektionsmischung ist darauf zu achten, dass die oberen fünf Mikroliter, frei von Ablagerungen und anderen Verunreinigungen, in ein frisches Röhrchen für die Injektionsladung, die Injektionsmischung und das leere Plasmid in eine Injektionspipette durch Kapillarwirkung überführt werden. Ein halber Mikroliter reicht normalerweise aus, um 100 Würmer zu injizieren, um die Öffnung an der Injektionspipette zu erweitern. Reiben Sie die Spitze gegen den Rand eines Deckglases, das auf einem Glasschieber montiert ist. Halo Carbon 700 Öl. Die Qualität der Öffnung ist entscheidend.

Sie wird anhand der Spitzenform und vor allem anhand der Flussrate beurteilt, die durch die Strömung und die Größe der Blasen beurteilt wird, die sich an der Pipettenspitze als Reaktion auf den Injektionsdruck bilden. Geben Sie nun einen Tropfen 700 hallow Kohlenstofföl auf ein Injektionspad und übertragen Sie mehrere Würmer auf das Pad. Schiebe die Würmer mit einem Wurmpickel auf das Pad, bis sie an den Aros haften.

Die Würmer sollten in Reihen ausgerichtet sein, wobei die Bauchseiten ausgerichtet sind. Vermeiden Sie es, ihre Köpfe zu berühren. Wenn die Würmer nach mehreren Versuchen nicht auf dem Pad haften, versuchen Sie es mit einem frischen Pad oder erhöhen Sie die Agros-Dicke oder Konzentration des Pads.

Führen Sie nun die Pipette in den Wurm ein. Bewegen Sie zuerst den Tisch, um die Schnecke unter der Pipette zu positionieren. Positionieren Sie die Pipette neben dem zentralen Kern der Gonade.

Da das Zytoplasma von vielen Keimzellkernen geteilt wird, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass die injizierte DNA an die Nachkommen weitergegeben wird. Die Pipette sollte fast parallel zum Wurm liegen. Drittens, bewegen Sie die Spitze senkrecht in Richtung Körper, bis die Haut eingedrückt ist.

Klopfen Sie abschließend vorsichtig auf den Manipulator, um das Einsetzen der Spitzen zu induzieren. Injizieren Sie nun die DNA-Lösung. Üben Sie Druck auf die Pipette aus, bis die Keimdrüsendrümpfe anschwillt.

Stoppen Sie dann den Fluss und ziehen Sie die Schnecke von der Pipette. Testen Sie den Fluss der Nadeln und injizieren Sie dann die anderen Keimdrüsen, bevor Sie zum nächsten Wurm übergehen. Geben Sie nach den Injektionen etwa 10 Mikroliter Erholungspuffer zu den Würmern und warten Sie, bis sie zu schwimmen beginnen.

Nach dem Schwimmen fügen Sie ein gleiches Volumen M neun Puffer hinzu. Wenn die Würmer wieder schwimmen, füge M neun hinzu, bis die Lösung hauptsächlich M neun ist. Übertragen Sie nun jeden Wurm auf eine sitzende Platte.

Sammeln Sie GR-Würmer in einem Milliliter M neun Puffer in einem 50-Milliliter-Falkenröhrchen. Waschen Sie dann die Würmer mit M neun Puffer durch wiederholtes Zentrifugieren und Lösungswechsel, bis M neun nach dem Waschen klar ist. Geben Sie anschließend 10 Volumen basische Hypochloritlösung zu den Läusen.

Die pelletierten Würmer inkubieren die Würmer bei Raumtemperatur, bis etwa vier Fünftel von ihnen gebrochen sind, was in der Regel 10 Minuten dauert. Überwachen Sie die Reaktion, indem Sie Aliquots entnehmen, um sie mit einem Mikroskop zu betrachten. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie ein gleiches Volumen sterilen Eipuffers hinzufügen.

Anschließend werden die Eier und Schlachtkörper durch Zentrifugation bei 450 g für fünf Minuten gesammelt. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Geben Sie das gleiche Volumen Eipuffer zurück und zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei 450 g für fünf Minuten.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis der Puffer frei ist. Inkubieren Sie nun die Eier über Nacht in M neun Puffer und säen Sie sie am nächsten Tag auf handelsüblichen NGM-Platten aus. Bereiten Sie mehrere Würfel Agar vor, etwa einen halben Zentimeter an einer Seite.

Weichen Sie die Agarstücke zwei Stunden lang in einer Lösung ein, die den gewünschten Lockstoff enthält. Legen Sie ein Agarstück in eine 10 Zentimeter große Testplatte, in der die Position des Testspots und eines Kontrollspots markiert sind. Bereiten Sie fünf solcher Platten pro Experiment vor.

Lassen Sie die Platten einen chemischen Gradienten bilden, indem Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei 20 Grad Celsius stehen lassen. Geben Sie vor dem Experiment 10 Mikroliter 20 millimolare Natriumazide auf jede Stelle auf den Platten. Dies wirkt wie ein Betäubungsmittel.

Beginnen Sie das Experiment, indem Sie 20 alterssynchronisierte Würmer in die Mitte der Platte legen und die Platte dann für eine Stunde in einen 20 Grad Celsius heißen Inkubator legen. Nach einer Stunde werden die Tiere im Test über Kontrollspots gezählt und der CI-Index berechnet. Nachdem Sie die Gr-Würmer lysiert und die Eier und Schlachtkörper wie zuvor beschrieben gereinigt haben, suspendieren Sie sie wieder in zwei Millilitern sterilem Eipuffer und fügen Sie zwei Milliliter sterile 60%ige Saccharose in den Eipuffer hinzu.

Mischen Sie dann die Tube mit der Hand oder durch einen Vortex, bis die Eier vollständig resuspendiert sind. Die resuspendierten Eier 15 Minuten lang bei 450 mal G zentrifugieren. Sammeln Sie dann vorsichtig den mit Ei gefüllten Überstand und entsorgen Sie den Gaumen, um die restliche Saccharose zu entfernen, suspendieren Sie die Eier wieder in Eipuffer und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 450 g.

Sammeln und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und wiederholen Sie den Reinigungsvorgang dreimal an der Haube. Verwenden Sie einen sterilen Eipuffer, der eine Einheit pro Milliliter Chitinase enthält, um die pelletierten Eier zu resuspendieren. Lassen Sie die Eier 30 Minuten lang bei Raumtemperatur verdauen und beginnen Sie dann, die Reaktion unter einem inversen Zellkulturmikroskop zu überwachen.

Wenn 70 bis 80 % der Eierschalen verdaut sind, fügen Sie fünf Milliliter des vollständigen L 15-Nährmediums oder CM 15 hinzu. Um die Zellen zu isolieren, dissoziieren Sie die Zellen, damit sie keine Klumpen bilden, indem Sie sie einige Male durch eine 27-Gauge-Nadel fließen lassen. Geben Sie nun die Lösung durch eine Spritze mit einem Fünf-Mikron-Filter.

Die dissoziierte Zellsuspension wird durch Zentrifugation bei 450 g 15 Minuten lang pelletiert. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in CM 15. Um sicherzugehen, dass die Zellen dissoziiert sind, überprüfen Sie die Suspension unter einem Mikroskop.

Zum Schluss werden die dissoziierten Zellen auf zuvor beschichtete Glasdeckgläser plattiert. Mit Erdnusslektin können die Zellen länger als zwei Wochen bei Raumtemperatur mit normaler Luft gehalten werden. Unter Verwendung der beschriebenen Transformationstechniken wurde ein transgener Wurm konstruiert, um menschliches a Beta 42 in den a SE-Neuronen zu exprimieren, Neuronen, die wasserlösliche Lockstoffe wie Biotin mit Hilfe des Chemotaxis-Assays nachweisen.

Sieben Tage alte transgene Würmer wurden getestet. Die Kontrollen hatten keine Probleme, Biotin zu finden. Im Gegensatz dazu konnten nur wenige Würmer, die ein Beta 42 exprimierten, die Lockstoffstelle finden.

Der Chemotaxis-Index für Biotin betrug 0,68 gegenüber 0,12 für Kontroll- bzw. Versuchswürmer nach drei bis vier Tagen. Es gab auch einen kleinen, aber erkennbaren Rückgang des Index. Ein kultiviertes A-SER-Neuron exprimiert nach neun Tagen nach neun Tagen immer noch GFP.

Die GFP-Fluoreszenz verschwand jedoch und es wurde vermutet, dass Apoptose diese Theorie testet. Primäre A-SER-Neuronen wurden wie beschrieben präpariert und mit einem Breitspektrum-Caspase-Inhibitor ergänzt. Wie erwartet stoppte die Behandlung den Verlust der Fluoreszenz, was bestätigt, dass die Expression von humanem A beta 42 die Apoptose in A-SER-Neuronen auslöst.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die eleganten transgenen Würmer konstruiert, sie in Verhaltensaufsätzen untersucht und wie man Primärkulturen von Ambrose erhält.