Name: Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Rekonstitution von Kv-Kanälen in Lipidmembranen für strukturelle und funktionelle Studien. Diese Methode ermöglicht elektrophysiologische Aufnahmen und elektronenkristallographische Analysen zur Untersuchung von Lipid-Protein-Wechselwirkungen.

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Die Studien über KvAP im Jiang Labor haben erhebliche Hilfe von Dr. Roderick MacKinnon Labor erhalten an der Rockefeller University. Besonderer Dank geht an Dr. Kathlynn Brown und Michael McQuire gehen für ihre Beratung und Hilfe auf unserem Phagen-Display Experimente. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIH (GM088745 und GM093271 zu Q-XJ) und AHA (12IRG9400019 zu Q-XJ) unterstützt.

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).</li>
<li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipids+and+proteins+interact+in+a+membrane%3A+a+molecular+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach.</a> Mol. Biosyst. 1, 203(2005).</li>
<li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipids+affect+the+activities+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">How lipids affect the activities of integral membrane proteins.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62(2004).</li>
<li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caveolae+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199(1998).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems%2C+lipid+rafts%2C+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269(2004).</li>
<li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+lipid+rafts%3A+from+model+membranes+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">The state of lipid rafts: from model membranes to cells.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257(2003).</li>
<li>Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Artificial+Bilayers+for+Electrophysiology+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments.</a> J. Vis. Exp. (20), e1033(2008).</li>
<li>Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-dependent+gating+of+a+voltage-gated+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel.</a> Nat. Commun. 2, 250(2011).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444, 775(2006).</li>
<li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422, 180(2003).</li>
<li>Jiang, Q. X., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+lipids+on+voltage-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of lipids on voltage-gated ion channels.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884(2012).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+SIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, W597(2012).</li>
<li>Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+solubilization+and+membrane+protein+reconstitution+using+Chaps+and+Chapso%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso.</a> Eur. J. Biochem. 243, 798(1997).</li>
<li>Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+liposome+and+proteoliposome+reconstitution+involving+Bio-Bead-mediated+Triton+X-100+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179(1990).</li>
<li>Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+tubular+crystals+by+reconstitution+of+detergent-solubilized+Ca2%28%2B%29-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase.</a> Biophys. J. 72, 2545(1997).</li>
<li>Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+sarcoplasmic+reticulum+Ca%282%2B%29-ATPase%3A+mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283(1992).</li>
<li>Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+phospholipid+vesicles+with+planar+phospholipid+bilayer+membranes.+II.+Incorporation+of+a+vesicular+membrane+marker+into+the+planar+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane.</a> The Journal of General Physiology. 75, 251(1980).</li>
<li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66, 1404(1994).</li>
<li>Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Biological+Techniques%22">Biological Techniques</a>. Sattelle, D. B. , Academic Press, Inc. San Diego. 133(1993).</li>
<li>Tien, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTien%2C+HT+%22Bilayer+lipid+membranes+%28BLM%29.+Theory+and+Practice%22">Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice</a>. , Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).</li>
<li>Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+composition+of+some+lipid+bilayer+membranes+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution.</a> The Journal of Membrane Biology. 10, 11(1972).</li>
<li>Henn, F. A., Thompson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+lipid+bilayer+membranes+separating+two+aqueous+phases%3A+composition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies.</a> Journal of Molecular Biology. 31, 227(1968).</li>
<li>Tao, X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Kv1.2+and+paddle+chimera+Kv+channels+in+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers.</a> J. Mol. Biol. 382, 24(2008).</li>
<li>Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+affecting+the+fusion+of+unilamellar+phospholipid+vesicles+with+planar+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1054(1984).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Display%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phage Display.</a> Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).</li>
<li>McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopanning+of+phage+displayed+peptide+libraries+for+the+isolation+of+cell-specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands.</a> Methods Mol. Biol. 504, 291(2009).</li>
<li>Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%3A+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753(2002).</li>
<li>Chami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+octyl+beta-thioglucopyranoside+in+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 133, 64(2001).</li>
<li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Q. Rev. Biophys. 25, 1(1992).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65(2003).</li>
<li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> J. Struct. Biol. 121 (2), 142(1998).</li>
<li>Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+2D+crystallization+of+membrane+proteins+using+methyl-beta-cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin.</a> J. Struct. Biol. 157, 321(2007).</li>
<li>Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 160, 295(2007).</li>
<li>Iacovache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2DX+robot%3A+a+membrane+protein+2D+crystallization+Swiss+Army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife.</a> J. Struct. Biol. 169, 370(2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Wiederherstellung der KvAP Kanäle in unterschiedlichen Membranen wurde in mehreren Studien 8-10 verwendet worden. Nach der Idee der Sicherstellung der Verteilung der Lipide zwischen Reinigungsmittel / Lipid Mischmizellen und die Protein / Reinigungsmittel / Lipid Mischmizellen, sind wir in der Lage, nahezu vollständige Wiederherstellung der KvAP in Membranen von sehr unterschiedlichen Lipiden zu erreichen. Jeder tetrameren KvAP Kanal benötigt ~ 100 Lipidmolekülen zur Deckung seiner Transmembrandomäne. Die...

Cells Austausch Materialien und Informationen mit ihrer Umgebung durch die Funktionen bestimmter Membranproteine ​​1. Membranproteine ​​in Zellmembranen funktionieren wie Pumpen, Kanäle, Rezeptoren, Enzyme intramembrane, Linker und strukturelle Unterstützer über Membranen. Mutationen, die die Membranproteine ​​beeinflussen wurden im Zusammenhang mit vielen Krankheiten des Menschen. In der Tat haben viele Membranproteine ​​die primären Angriffspunkte für Arzneimittel, da sie wichtige und leicht zugänglich in Zellmembranen sind. Es ist daher sehr wichtig, die Struktur und Funktion der Membranproteine ​​in Membranen zu verstehen, und es ermöglichen, neue Verfahren zu entwickeln, um die schädlichen Wirkungen von den mutierten Proteinen in menschlichen Krankheiten zu lindern. Lipide umgeben alle Membranproteine ​​in Doppelschichten 2, 3 integriert. In eukaryotischen Membranen werden die verschiedenen Arten von Lipiden bekannt, in Mikrodomänen 4, 5 durchgeführt werden.Viele Membranproteine ​​gezeigt, unter diesen Mikrodomänen sowie die sperrigen fluiden Phase Membranen 3, 6 verteilt werden. Der Mechanismus der Organisation der Mikrodomänen und die Lieferung von Membranproteinen in ihnen und der physiologischen Bedeutung dieser Distributionen sind zweifellos wichtig, sondern bleiben weitgehend unverstanden. Eine wichtige technische Schwierigkeit bei der Untersuchung der Auswirkungen auf die Lipid-Membran-Proteine ​​ist die zuverlässige Wiederherstellung der biochemisch gereinigten Membranproteinen in Membranen von gut kontrollierten Lipid-Zusammensetzung, so dass fast alle Proteine ​​funktionell rekonstituiert 7 sind. In den letzten Jahren haben wir Verfahren zur Wiederherstellung der Prototyp spannungsabhängigen Kaliumkanal von A. pernix (KvAP) in verschiedenen Membran-Systeme für die strukturelle und funktionelle Studien 8-10. Die Daten von anderen und uns zusammen zeigte, dass die Lipide sind wahrscheinlich ausschlaggebend für die Konformationsänderungen des SpannungsmessgerätDomänen eines spannungsabhängigen Ionenkanal kann formen die Strukturen einiger dieser Kanäle 11. In der nächsten, werden wir eine detaillierte Beschreibung unserer Methoden und kritischen technischen Tipps, die wahrscheinlich zu gewährleisten wird die erfolgreiche Reproduktion unserer Ergebnisse sowie die Erweiterung unserer Methoden zum Studium von anderen Membranproteinen bieten.

<table><tbody><tr><td>Trypton</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltosid</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>Sol-Qualität</td></tr><tr><td>n-Octyl-&#946;-D-Glucosid </td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td>Aprotinin in Ana-Qualität</td></tr><tr><td></td><td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0,025</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Bead SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti Polar Lipide</td><td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti Polar Lipide</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>DOGS</td><td>Avanti Polar Lipide</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC </td><td>Avanti Polar Lipide</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-DOPE </td><td>Avanti Polar Lipide</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipide</td><td>890890C</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Agarose-Kügelchen </td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschlauch</td><td>Spectrum Laboratories, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>Pentan</td><td>Fisher</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>Dekantan</td><td>TCI America</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>Toronto Research Cemicals</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstitution eines kv-kanal in lipidmembranen für strukturelle und funktionelle studien

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Um die Lipid-Protein-Interaktion in einer reductionistic Weise zu untersuchen, ist es notwendig, die Membranproteine ​​in Membranen von definierten Lipid-Zusammensetzung einzuarbeiten. Wir untersuchen die Lipid-Gating-Effekte in einem Prototyp spannungsabhängigen Kalium-(KV)-Kanal und haben detaillierte Verfahren zur Wiederherstellung der Kanäle in verschiedene Membran-Systemen gearbeitet. Unsere Rekonstitution Verfahren nehmen Berücksichtigung sowohl Waschmittel-induzierte Fusion von Vesikeln und die Fusion von Protein / Detergensmicellen mit der Lipid / Detergens gemischte Mizellen und der es wichtig ist, ein Gleichgewicht Verteilung von Lipiden bei der Protein / Detergens / Lipid-und Reinigungsmittel / Lipid-Mischmicellen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass das Einfügen der Kanäle in der Lipidvesikel relativ zufällig in Ausrichtungen, und die Rekonstitution Wirkungsgrad ist so hoch, dass keine nachweisbaren Proteinaggregate in Fraktionierungsexperimente beobachtet. Wir haben die Rekonstitution verwendetd Kanäle, um die Konformationen der Kanäle in verschiedenen Lipiden zu bestimmen, notieren elektrischen Aktivitäten von einer kleinen Anzahl von Kanälen in planaren Lipiddoppelschichten eingebaut, Bildschirm für Exterieur-spezifischen Liganden aus einer Phagen-Peptid-Bibliothek angezeigt, und unterstützt das Wachstum von 2D-Kristallen der Kanäle in den Membranen. Die Rekonstitution hier beschriebenen Verfahren kann zur Untersuchung anderer Membranproteine ​​in Lipid-Doppelschichten, insbesondere für die Untersuchung der Lipid-Wirkungen auf den eukaryotischen spannungsgesteuerten Ionenkanälen angepasst werden.

Der allgemeine Ablauf der Versuche zur Reinigung des KvAP Kanal in biochemischen Homogenität ist in 1A beschrieben. Typische Proben, die während der Expression und Reinigung des Proteins wird in der SDS-PAGE-Gel in 1B gezeigt. Das Protein nach der IMAC Reinigung relativ rein ist. Die Ausbeute des KvAP Kanal ist etwa 1,0 mg / Liter Kultur. Solubilisierung von Lipidvesikeln mit Detergenzien muss für jedes Paar von Lipid gegen Reinigungsmittel eingearbeitet wer...

Verfahren zur vollständigen Auflösung des Prototyps spannungsabhängigen Kaliumkanal in Lipid-Membranen beschrieben. Die rekonstituierten Kanäle sind für biochemische Assays, elektrische Aufnahmen, Liganden-Screening und Elektronen kristallographische Untersuchungen geeignet. Diese Methoden können allgemeine Anwendungen auf die strukturelle und funktionelle Studien anderer Membranproteine.

Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine detaillierte Beschreibung der Techniken zur funktionellen und strukturellen Untersuchung der Wirkung von Lipiden auf Membranproteine bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein spannungsabhängiger Kaliumkanal exprimiert und gereinigt wird. Der zweite Schritt ist die Rekonstitution des Ionenkanals.Anschließend erfolgt die elektrische Aufzeichnung aus Ionenkanälen in Lipiddoppelschichten zur funktionellen Untersuchung der Ionenkanäle. Der letzte Schritt ist die Kristallisation der Ionenkanäle in der Membran zur Strukturaufklärung. Letztendlich werden biochemische Assays, elektrophysiologische Methoden und die elektronenmikroskopische Kristallographie eingesetzt, um die Auswirkungen von Lipiden auf die Bewegung des Spannungssensors von Ionenkanälen zu untersuchen.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund zahlreicher technischer Details bei der Proteindreherealisierung und biologischen Ableitungen Schwierigkeiten haben. Hoffentlich hilft Ihnen dieser Film dabei, das gesamte Verfahren durchzuführen und erfolgreich abzuschließen. Die Demonstration des gesamten Verfahrens wird von Dr. H

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Reconstituting funktionellen Membranproteinen in riesige Liposomen definierter Zusammensetzung ist ein leistungsfähiges Konzept, wenn es mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie kombiniert. Dagegen dürfen herkömmliche Riese Liposomen Produktion unvereinbar mit Proteinstabilität. Wir beschreiben Protokolle zur Herstellung Riese Liposomen aus reinem Lipide oder kleine Liposomen, die Ionenkanäle.

Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung - Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden.

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Beschrieben wird hier ein schnelles und wirksames Verfahren für die funktionelle Rekonstitution von gereinigten Wildtyp- und mutierten CFTR-Proteins, die die Aktivität für dieses Chloridkanal, der bei zystischer Fibrose fehlerhaft ist bewahrt. Iodid-Efflux aus rekonstituierter Proteo von CFTR vermittelten ermöglicht Untersuchungen der Kanalaktivität und die Auswirkungen von kleinen Molekülen.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

Dieser Artikel beschreibt bestimmte Methoden um biochemische Menge Waschmittel solubilisiert TRPV1 für spektroskopische Analyse zu erhalten. Die kombinierte Protokolle bieten Biochemische und biophysikalische Werkzeuge, die angepasst werden können, um die strukturelle und funktionelle Studien für Säugetier-Ionenkanäle in einer Membran-kontrollierten Umgebung zu erleichtern.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

Auswertung zweidimensionaler (2D) Kristallisation Studien für die Bildung geordneter membrane protein-Arrays ist eine höchst kritische und schwierige Aufgabe in Elektronenkristallographie. Hier beschreiben wir unseren Ansatz in Screening und Identifizierung von 2D-Kristallen von überwiegend kleinen Membranproteine ​​im Bereich von 15 - 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Wir werden zeigen, wie man die Wirkung einer einzelnen Punktmutation auf die Funktion eines Ionenkanals zu studieren.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

Erfahren Sie die Rekonstitution von Kv-Kanälen in Lipidmembranen für strukturelle und funktionelle Studien. Diese Methode ermöglicht elektrophysiologische Aufnahmen und elektronenkristallographische Analysen zur Untersuchung von Lipid-Protein-Wechselwirkungen.

Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

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