Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine detaillierte Beschreibung der Techniken zur funktionellen und strukturellen Untersuchung der Wirkung von Lipiden auf Membranproteine zu liefern. Dies wird erreicht, indem zunächst der spannungsgesteuerte Kaliumkanal exprimiert und gereinigt wird. Der zweite Schritt ist die Rekonstitution der Ionenkanäle.

Als nächstes wird die elektrische Aufzeichnung der Ionenkanäle in Lipiddoppelschichten für die funktionelle Studie der Ionenkanäle durchgeführt. Der letzte Schritt ist die Kristallisation der Ionenkanäle in der Membran zur Strukturaufklärung. Letztendlich werden biochemische Assays, elektrophysiologische Methoden und elektronenkristallographische Untersuchungen verwendet, um die Lipideffekte auf die Bewegung des Spannungssensors von Ionenkanälen zu untersuchen.

Im Allgemeinen werden Menschen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund vieler technischer Details in der Proteinrekonstitution und Bioaufzeichnungen Schwierigkeiten haben. Hoffentlich hilft Ihnen dieser Film, der Prozess, das gesamte Verfahren zu durchlaufen und erfolgreich zu sein. Die Demonstration des gesamten Verfahrens wird von Dr. Hui Jim aus meinem Labor durchgeführt.

Vor der Lipidaufbereitung befanden sich ein 14-Milliliter-Einweg-Reagenzglas aus Glas, ein Schraubglasröhrchen und eine 250-Mikroliter-Glasspritze mit Chloroform. Übertragen Sie dann 10 Milliliter Chloroform in das Reagenzglas. Zur Herstellung von POPE- und POPG-Liposomen werden 3,75 Milligramm POPE und 1,25 Milligramm POPG in Chloroform in das Glasröhrchen mit Schraubverschluss überführt.

Trocknen Sie die Lipide unter einem kontinuierlichen Strom von Argongas, wenn kein sichtbares Chloroform mehr übrig ist. Probieren Sie das Lipid eine Stunde lang unter Raumvakuum weiter aus. Geben Sie anschließend 440 Mikroliter salzarmen Puffer oder Wasser in den getrockneten Lipidwirbel

Die Tube, um die Lipide mit Feuchtigkeit zu versorgen. Die Lipidsuspension sollte weißlich und tur aussehen. Danach wird die Lipidsuspension in einem eiskalten Bad beschallt, bis die Vesikellösung durchscheinend wird.

Dann bei 50 Mikrolitern von drei molaren Kaliumchlorid und 10 Mikrolitern von 0,5 molaren TM zu der Mischung, so dass die endgültige Lipidsuspension 300 millimolare Kaliumchlorid und 10 millimolare TM enthält, inkubieren Sie die Lösung in einem Rotator für zwei Stunden bei Raumtemperatur, um die Bildung von mit Lipiddetergens vermischten M-Zellen zu ermöglichen. Nach der Inkubation sollte die Suspension aufgrund der durch das Detergens induzierten Verschmelzung der kleinen ELLA-Vesikel etwas trüb werden. Wenn das Protein auf mehr als zwei Milligramm pro Milliliter konzentriert ist, fügen Sie die aufgeführten Komponenten und die Lipidwaschmittelmischung hinzu, um ein Milliliter Endvolumen zu erhalten.

Dann inkubieren Sie das Protein-Lipid-Waschmittel-Gemisch im Glasröhrchen in einem Rotator für weitere zwei Stunden. Die Zubereitung des KVAP in Mischung mit dem Detergens solubilisiert DTaP oder DOGS ist ähnlich wie die Lipidpräparation für P-O-P-E-P-O-P-G Vesikel. Die Beschallung von hydratisierten Lipiden in kleine Unli-Vesikel dauert jedoch länger als die der P-O-P-E-P-O-P-G-Lipide, die DOGS-Vesikel können langsam miteinander verschmelzen und kleine ölige Tröpfchen bilden, um das Dote oder DOGS vollständig zu lösen.

Die beschallten Vesikel werden mit 10 millimolaren TM und 40 millimolaren beta og gemischt. Das Lipidwaschmittelgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und sollte ziemlich klar sein und keine kleinen Partikel oder Tröpfchen enthalten. Mischen Sie als Nächstes das KVAP-Protein mit dem durch Detergens solubilisiertem DTaP oder DOGS in einem Protein-Lipid-Verhältnis, das kleiner oder gleich eins zu 10 ist.

Das Protein-Detergens-Lipid-Gemisch wird zwei bis drei Stunden lang bei Raumtemperatur mit kontinuierlicher Orbitalrotation inkubiert. Zur Demonstration der langsamen Entfernung von Detergenzien mit relativ hohem CMC-Gehalt, wie z. B. DM und Beta og. Bereiten Sie zunächst zwei Liter Dialysepuffer für jede Millilitermischung vor.

Schneiden Sie dann einen geeigneten Dialyseschlauch aus und waschen Sie ihn mit DI-Wasser, um zu überprüfen und sicherzustellen, dass der Schlauch nicht undicht ist. Laden Sie anschließend das Protein-Lipid-Waschmittelgemisch in den Dialyseschlauch. Klemmen Sie beide Enden des Schlauchs mit minimalem Platz über der Lösung.

Legen Sie den beladenen Schlauch auf eine Rührplatte in den Dialysepuffer, so dass sich der Schlauch langsam in Lösung dreht. Wechseln Sie den Dialysepuffer einmal alle acht Stunden. Bereiten Sie nun die Styroporkügelchen für die Entfernung von Reinigungsmitteln vor, die einen niedrigen CMC aufweisen, indem Sie zunächst 0,5 Gramm trockene Kügelchen auftragen.

Geben Sie sie dann in ein 50-Milliliter-Corning-Rohr und fügen Sie 20 Milliliter Methanol hinzu, beschallen Sie die Lösung in einem Bad, beschallen Sie sie fünf Minuten lang, um eingeschlossene Blasen zu entfernen, und geben Sie sie anschließend fünf Minuten lang bei 5.000 RP auf die Kügelchen, dekantieren Sie das Methanol vollständig und wiederholen Sie die Wäsche mit Ethanol und Milli Q-Wasser. Lagern Sie dann die gewaschenen Kügelchen in 20%igem Ethanol bei vier Grad Celsius und wechseln Sie ihn vor der Verwendung durch einen waschmittelfreien Puffer. Schätzen Sie die Menge an Waschmitteln in der zu behandelnden Protein-Lipid-Waschmittelmischung und berechnen Sie die Menge an Kügelchen, die zum Entfernen der Waschmittel benötigt werden.

Wiegen Sie die nassen Kügelchen ohne überschüssiges Wasser ab und geben Sie sie direkt zur Proteinmischung und warten Sie mindestens 15 bis 20 Minuten, bis die Kügelchen ihre volle Wirkung entfalten. Um 8,7 Milligramm DDM in einem Milliliter Lösung zu entfernen, insgesamt 87 Milligramm Polystyrolkügelchen wie Biokügelchen, wird SM zwei in fünf gleiche Portionen aufgeteilt. Mischen Sie das Protein-Lipid-Waschmittelgemisch mit jeder Fraktion 20 bis 30 Minuten lang mit konstanter End-over-End-Rotation bei Raumtemperatur.

Schleudere die Perlen herunter, übertrage dann den Überstand auf die nächste Fraktion der Perlen und wiederhole den Vorgang bis zum Ende. Beginnen Sie in diesem Schritt mit der Reinigung eines Reagenzglases und eines braunen Fläschchens mit einem Schraubverschluss mit Teflonoberfläche und einem Satz Glasspritzen mit Chloroform. Trocknen Sie dann das braune Fläschchen unter einem Strahl Argongas.

Als nächstes werden 0,75 Milligramm POPE und 0,25 Milligramm POPG in Chloroform in das Glutfläschchen überführt und das Chloroform mit Argongas verdampft. Geben Sie danach 0,2 Milliliter Pentan in das Fläschchen, um die getrockneten Lipide aufzulösen, und trocknen Sie vollständig ab, um das restliche Chloroform zu entfernen. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter Decan in das Fläschchen, um das getrocknete Lipid aufzulösen.

Malen Sie nun das runde Loch an der zylindrischen Oberfläche des Doppelschichtbechers mit den Lipiden, ohne dass eine Lipidlösung in das Loch gelangt. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis das Jahrzehnt vollständig verdunstet ist, um elektrische Aufzeichnungen von KVAP-Kanälen in Lipidschichten durchzuführen. Setzen Sie den Becher in die Aufnahmekammer ein, setzen Sie die Salzbrücken ein und verbinden Sie die Elektroden mit den beiden Seiten des Aufnahmebechers.

Geben Sie die Zystenlösung in die Elektrodenlöcher und die CYS- und trans-Lösung in die Außen- und Innenbecher in der Kammer. Stellen Sie dann den Potentialversatz zwischen zwei Seiten des Bechers auf weniger als zwei Millivolt ein und malen Sie dann Lipid über das Loch in der Kappe. Warten Sie, bis die Membran dünner wird und relativ stabil wird.

Sobald die Membran stabil wird. Schießen Sie 0,5 bis einen Mikroliter Kanal mit Vesikel, indem Sie das feine Ende einer P-Spitze mit zwei Pipetten direkt über dem Loch positionieren. Die Bläschen fallen über das Loch nach unten auf den Boden des Bechers.

Um die KVAP-Kanäle in der Doppelschicht zu testen. Aus dem Haltepotential von minus 80 Millivolt wird aufgrund der schnellen Inaktivierung und langsamen Erholung von einer Aktivierung ein langes Intervall, etwa 120 Sekunden für Kanäle in PEPG-Membranen, zwischen zwei Impulsen gegeben. Sobald die Größe des Stroms gut aussieht, gleichen Sie die Ionenkonzentrationen in den Lösungen auf beiden Seiten der Membran aus, indem Sie zusätzliche Ionensalze auf der Seite mit niedriger Konzentration hinzufügen.

Hier ist ein Bild eines negativ gefärbten 2D-Kristalls, der Mitte der Kristalloptimierung. Die Kristalle wurden mit 6%Ammoniummoat, pH 6,4 plus 0,5%Triose gefärbt, da sie durch den Zucker manchmal miteinander aufgetürmt waren. Das schwarze quadratische Kästchen kennzeichnet hier einen Bereich, der das Beugungsmuster mit Beugungsflecken hervorruft.

Bei etwa 20 Angström ist hier ein Kryo-EM-Bild eines 2D-Kristalls aus einer Probe, die der zuvor gezeigten ähnelt. Die Probe wurde mit 3%TLOs gemischt und durch direktes Tauchen eingefroren und unter einem Kryo-EM bei 50.000 Decks abgebildet. Klar ist, dass es lokale Defekte in der Kristallpackung gab.

Hier ist ein weiteres Kryo-EM-Bild eines weiter optimierten Kristalls. Das Exemplar wurde in 0,75 % Tannin und 10 % Baumhallo eingebettet, und das Bild wurde bei 50.000 x aufgenommen. Die geraden Linien in der engen Packung deuteten darauf hin, dass die Kanäle bei dieser Art von Kristallen gut geordnet waren, während die beiden schwarzen Pfeile die quadratischen Vektoren markieren.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, hoffe ich, dass Sie ein gutes Gefühl dafür bekommen, wie Sie richtig mit Lipiden und Proteinen umgehen, und dieses Video wird Ihnen hoffentlich helfen, die Wirkung von Lipidprotein in der Membran effizienter zu untersuchen.