Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein Modellsystem zu erstellen, um die Auswirkungen von Infrarot-Laserbeleuchtung auf auditorische Neuronen in vitro zu untersuchen. Dies wird durch Patch-Clamping erreicht, bei dem auditorische Neuronen in der gesamten Zellkonfiguration kultiviert werden, um ihre elektrischen Eigenschaften zu untersuchen. Anschließend kann die Exposition der Neuronen mit Laserstrahlung elektrische Reaktionen in der exponierten Zelle hervorrufen, die mit einem Patch-Clamp-Aufbau gemessen werden können.

Beleuchtungsparameter und Umgebungsvariablen können dann variiert werden, um ihre Auswirkungen auf laserinduzierte elektrische Reaktionen zu beobachten. Die auditorischen Neuronen, die dem Laserlicht ausgesetzt sind, zeigen als Reaktion auf jeden Laserpuls eine wiederholbare elektrische Aktivität für eine spätere Analyse. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zu den Mechanismen zu beantworten, die der Infrarotstimulation von Neuronen der Spiralganglien zugrunde liegen.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Infrarotstimulation von Spiralganglienzellen geben kann, kann sie auch auf andere Zelltypen oder vereinfachte Modelle wie Lipiddoppelschichten ausgeweitet werden, um die beteiligten physikalischen Prozesse weiter aufzuklären. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, um eine genaue Positionierung der Lichtleitung zu gewährleisten, da die resultierende Strahlenexposition ein kritischer Parameter ist, haben Sie Aufzeichnungs-Mikropipetten mit einem Widerstand von zwei bis sechs Megaohm vorbereitet. Sie können mit einem CO2-Laserabzieher aus geliehenem Silikatglas gezogen werden.

Bereiten Sie den fasergekoppelten Laser vor. Eine breite Palette von Glasfasern funktioniert. Das Durchtrennen einer Faser in einer Patchkabelkonfiguration mit FCPC-Steckverbindern in zwei Hälften erzeugt zwei Faserglieder mit einem Steckverbinder an einem Ende und einer freiliegenden Faser am anderen Ende.

Das sind die Zöpfe. Bereiten Sie die Bärenspitze eines Zopfes vor, indem Sie den Fasermantel entfernen, mit Ethanol reinigen und mit einem geeigneten Werkzeug unter einem Mikroskop spalten. Vergewissern Sie sich, dass die Spitze senkrecht zur Faserachse steht und flach erscheint.

Verbinden Sie das andere Ende des Faserpigtails bei Bedarf mit einem geeigneten Durchgangsstecker mit dem Ausgang des Stimulationslasers. Achten Sie an dieser Stelle immer darauf, die Ausgangsleistung des Lasers von der Faser zu messen. Tun Sie dies auch nach weiteren Tipp-Manipulationen.

Führen Sie nun die Faser in ein Futter ein und fixieren Sie das Futter auf dem entsprechenden Mikropositionierer. Bestimmen Sie als Nächstes den Winkel, den die optische Faser mit einem Deckglas bildet. Machen Sie ein Foto der Anordnung und berechnen Sie den Winkel mit dem Bild J. Sichern Sie nun die Verbindungen, die den Laser mit dem Datenerfassungssystem der Patch-Klemme synchronisieren.

Der digitale Ausgang des Patch-Clamp-Datenerfassungssystems sollte über einen externen Funktionsgenerator mit dem Laser verbunden werden, wodurch es möglich ist, Laserpulsparameter unabhängig vom Datenerfassungssystem festzulegen, das Signal, das zum Auslösen des Lasers verwendet wird, sollte wieder mit einem Eingang des Datenerfassungssystems verbunden werden, um sicherzustellen, dass das Timing und die Länge der Laserpulse gleichzeitig mit dem elektrophysiologischen Signal aufgezeichnet werden können, Stellen Sie die Flussrate des Perfusionssystems auf ein bis zwei Milliliter pro Minute ein. Es funktioniert ein Schwerkraftsystem mit einer Inline-Heizung zum schnellen Erhitzen der Lösung und einer Schlauchpumpe, um die verbrauchte Lösung durch Absaugen zu entfernen. Brunnen. Legen Sie ein Deckglas mit kultivierten Zellen in die Aufnahmekammer eines aufrechten Mikroskops, indem Sie ein Wasserimmersionsobjektiv mit hoher Vergrößerung und Phasenkontrast verwenden, und lokalisieren Sie ein Spiralganglienneuron.

Ein typisches Neuron eines Spiralganglienneurons ist phasenförmig, hell, rund und mit einem Durchmesser von etwa 15 Mikrometern und einem markanten Kern. Sobald ein geeignetes Neuron lokalisiert wurde, wechseln Sie zu einem Objektiv mit geringerer Vergrößerung und lokalisieren Sie das Zielneuron. Verwenden Sie dann den Mikropositionierer, um die optische Faser zu bewegen, bis sich die Spitze sowohl in der horizontalen als auch in der vertikalen Ebene in der Nähe des Zielneurons befindet.

Schalten Sie wieder auf das Objektiv mit hoher Vergrößerung um und positionieren Sie die Spitze der optischen Faser in der vorgesehenen Position neben dem Neuron. Bei der Einstellung der vertikalen Position der Faser ist es wichtig, dass die Unterkante der Faser auf der Decklippe aufliegt. Um die Unsicherheit über die Position der Faser zu minimieren, kann der Kontaktpunkt anhand von visuellen Hinweisen im Mikroskopbild identifiziert werden.

Sobald die Faser in Position ist, bewegen Sie sie um einen bekannten Betrag entlang ihrer Längsachse nach außen, um die Positionierung der Mikropipette nicht zu beeinträchtigen. Die Mikropipette sollte mit intrazellulärer Lösung gefüllt und sicher auf dem Kopftisch des Verstärkers befestigt werden. Üben Sie mit einem Schlauch, der an der Seite des Mikroelektrodenhalters befestigt ist, einen kleinen Überdruck aus, um ein Verstopfen der Mikropipette zu verhindern.

Bewegen Sie die Mikropipette mit einem Mikrom-Manipulator in Position knapp über dem Zielneuron und fahren Sie mit der Herstellung einer Giga-Ohm-Versiegelung fort. Notieren Sie die Membrankapazität, den Serienwiderstand und den Eingangswiderstand, wie sie aus der an den Strom angepassten Exponentialkurve bestimmt werden. Während des Siegelprüfimpulses.

Minimieren Sie die Kapazitätstransienten, indem Sie die Regler CP fast und CP slow am Verstärker anpassen. Schalten Sie dann den Verstärker in den Ganzzellenmodus und modifizieren Sie die Kapazitäts- und Widerstandskompensation, bis während des SEAL-Tests ein flacher Strom beobachtet wird. Wenden Sie als Nächstes eine Serienwiderstandskompensation mit einer Korrektur von etwa 70 % und einer Vorhersage von 70 % an und passen Sie die Kapazitäts- und Widerstandskompensationsregler an, um eine flache Testdichtung aufrechtzuerhalten.

Schalten Sie dann den Verstärker in den Stromzangen-Modus. Beachten Sie das Ruhemembranpotential ohne Strominjektion. Stellen Sie nun einen Haltestrom ein, um das Membranpotential auf dem gewünschten Niveau zu stabilisieren.

Neutralisieren Sie die Pipettenkapazität und stellen Sie die Brückenbalance ein, um den Spannungsabfall auszugleichen. Überprüfen Sie die Feuereigenschaften des Neurons, indem Sie mit depolarisierendem Strom stimulieren. Bewegen Sie an diesem Punkt die optische Faser wieder in Position neben dem Neuron mit Hilfe einer Bildgebungssoftware, die mit einer CCD-Kamera gekoppelt ist, um Bilder aufzunehmen, die zunächst auf die Ebene des Neurons fokussiert und dann auf die Oberkante der optischen Faser fokussiert sind.

Analysieren Sie die Bilder, um den Delta-Wert zu bestimmen, d. h. die Position der oberen Kante der optischen Faser relativ zum Zentrum des Zielneurons. Es ist sehr wichtig, die Position der optischen Faser genau zu kennen. Dies liegt daran, dass die Energie pro Einheit, Fläche oder Strahlungsstärke, die an die Zielzelle abgegeben wird, ein kritischer Parameter für die neuronale Stimulation im Infrarotbereich ist, und dies kann erheblich von der Position der Faser relativ zur Zelle beeinflusst werden.

Die optische Leistung dieses Lasers wird vom Computer über einen direkten Eingang zum Laser gesteuert und kann vor jeder Aufnahme manuell eingestellt werden. Pulslänge und Wiederholrate können über den Funktionsgenerator wie zuvor beschrieben gesteuert werden, stellen Sie sicher, dass die Daten sowohl vom Patch-Clamp-Kanal als auch vom Lasertriggerkanal von einer halben bis 15 Millisekunde Laserpulsen bei 0,25 bis fünf aufgezeichnet werden. Millijoule führen in der Regel zu messbaren elektrischen Reaktionen. Anfänglich.

Es kann sinnvoll sein, die Wiederholrate von Laserpulsen auf ein Hertz oder weniger einzustellen, um unerwünschte Effekte zu minimieren. Sobald alle Laserparameter eingestellt sind. Fahren Sie mit der Datenerfassung fort.

Neuronen von Spiralganglien reagieren auf Laserbeleuchtung mit wiederholbaren Wellenformen sowohl in der Spannungsklemme als auch in der Stromklemme Aufzeichnung von Konfigurationen als Reaktion auf 2,5 Millisekunden 0,8 Millijoule Laserpulse. Eine typische Zelle erzeugt einen Netto-Einströmstrom bei verschiedenen Haltepotentialen. Aktuelle Clamp-Aufzeichnungen zeigen eine stetige Membrandepolarisation im Verlauf dieser Laserpulse, gefolgt von einer annähernd exponentiellen Abnahme in Richtung des ruhenden Membranpotentials nach dem Puls.

In einigen Fällen kommt es auch zu einer kleinen zusätzlichen Membrandepolarisation im Anschluss an den Laserpuls. Das Beleuchten mit übermäßiger Energie oder die Einwirkung eines starken Temperaturanstiegs kann zu Zellschäden führen, die durch Verschlechterung der elektrischen Eigenschaften der Zellen oder sofortigen Zelltod beobachtet werden. Durch dieses Verfahren können eine Reihe von Umgebungsparametern wie die Lösungstemperatur oder chemische Faktoren variiert werden, um deren Wirkung auf die laserinduzierte elektrische Aktivität zu testen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern gefährlich sein kann und dass standardmäßige Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden sollten. Dazu gehören die Verwendung von Laserschutzbrillen, Warnschildern und die Sicherstellung, dass sich der Strahl nicht unbeabsichtigt mit stark reflektierenden Oberflächen schneidet.