RNAi-vermittelte Gene Knockdown Doppelzimmer und Gustatorisch Perception Measurement in Honey Bees (

Dieses Video-Protokoll demonstriert neuartige Techniken, um in erwachsenen Honigbienen gleichzeitig zwei Gene zu hemmen, und anschließend einen Proboscis-Verlängerungs-Reflex-Test (PER-Assay) durchzuführen, um den Effekt der doppelten Genhemmung auf die gustatorische Wahrnehmung der Honigbiene zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst doppelsträngige RNAs synthetisiert werden, die gezielt gegen die Gene für drei Proteine, Vitellin, Genin, Ultrasphärisch, sowie gegen das grüne Fluoreszenzprotein gerichtet sind.

Da das Gen, das für GFP kodiert, nicht im Genom der Honigbiene vorkommt, dient die doppelsträngige RNA von GFP als negativer Kontrollansatz. Der zweite Schritt besteht darin, doppelsträngige RNA mittels vier Behandlungsstrategien in Honigbienen zu injizieren. Die Injektion erfolgt entweder mit doppelsträngiger GFP-RNA allein, einer einzelnen Injektion mit einem Gemisch aus VG- und USP-doppelsträngiger RNA, einer Injektion mit doppelsträngiger vg-RNA am ersten Tag, gefolgt von einer Injektion mit doppelsträngiger USP-RNA am zweiten Tag, oder einer Injektion mit doppelsträngiger USP-RNA am ersten Tag, gefolgt von einer Injektion mit doppelsträngiger VG-RNA am zweiten Tag. Nach den Injektionen wurden die Bienen mit farbkodierten Farbpunkten entsprechend den Behandlungen markiert und in einen Stock zurückgebracht.

Sechs Tage später wird die Gen-Knockdown-Wirkung von VG und USP in den behandelten Bienen mittels Echtzeit-PCR überprüft, und der Effekt eines doppelten VG- und USP-Knockdowns auf die Geschmackswahrnehmung wird mittels PER-Assay bestimmt. Letztendlich zeigt sich, dass Bienen mit doppeltem Knockdown signifikante Verringerungen der Expression der VG- und USP-Gene sowie signifikante Steigerungen der Geschmackswahrnehmung gegenüber Saccharose aufweisen. Unsere Interferenzmethode ist ein leistungsstarkes Werkzeug, mit dem wir Genfunktionen aufdecken können.

Es wird typischerweise verwendet, um ein einzelnes Gen gezielt anzusteuern. Gene sind jedoch Teil komplexer regulatorischer Netzwerke. Eine Möglichkeit, jeden biologischen Prozess besser zu verstehen, besteht darin, zu untersuchen, wie Gene innerhalb genetischer Netzwerke miteinander interagieren.

Dazu müssen wir mehrere Gene gleichzeitig manipulieren. Bisher konnten wir in Insekten jeweils nur ein Gen gleichzeitig stilllegen; hier möchten wir Ihnen erstmals zeigen, wie man zwei Gene bei Honigbienen statt nur eines ausschalten kann. Die proboszidale Extensionreflex (PER)-Methode ist eine sehr nützliche Technik zur Messung der gustatorischen Wahrnehmung, die als Verhaltensindikator für das soziale Verhalten von Honigbienen dient.

Beispielsweise nektarbewohnende Bienen mit hoher gustatorischer Wahrnehmung reifen verhaltensmäßig schnell, sammeln früh im Leben und bevorzugen die Sammlung von Pollen. Um dieses Verfahren zu beginnen, entwerfen Sie Primer für doppelsträngige RNAs, die auf die Gene zur Herunterregulation abzielen, mithilfe der kostenlosen Software primer.Three. In diesem Experiment werden die beiden Gene vitelli, genin oder VG sowie ultras spherical oder USP zur Herunterregulation gezielt.

Zusätzlich zu VG und USP wurden Primer für doppelsträngige RNA entworfen, die ein Kontrollgen für das grün fluoreszierende Protein, oder GFP, gezielt ansprechen, welches nicht im Honigbienen-Genom vorhanden ist. Anschließend erfolgt die Synthese der doppelsträngigen RNA für VG, USP und GFP mittels In-vitro-Transkription unter Verwendung des RibMax T7-RNA-Produktionssystems von Promega.

Nach der Reinigung der doppelsträngigen RNAs mithilfe standardisierter Verfahren sollte jedes Pellet aus doppelsträngiger RNA in nukleasefreiem Wasser gelöst werden, um die Wirksamkeit der Genherunterregulation sicherzustellen. Die Konzentration der doppelsträngigen RNA sollte dabei etwa neun bis 10 Mikrogramm pro Mikroliter betragen. Um die Bienen für die Injektion vorzubereiten, kühlen Sie frisch geschlüpfte Bienen für ein bis zwei Minuten in einem Kühlschrank bei vier Grad Celsius. Sobald die Bienen immobilisiert sind, befestigen Sie drei bis vier Bienen parallel auf Petrischalen, die mit festem Wachs gefüllt sind, indem Sie Insektennadeln quer zwischen ihre Abdomen und Thoraces stecken.

Kühlen Sie die Bienen erneut für etwa eine bis zwei Minuten in einem vier Grad Celsius kalten Kühlschrank. Stellen Sie sicher, dass die Bienen vollständig bewegungslos sind. Die Bienen sollten locker aussehen, nicht eingerollt oder verkrümmt.

Vollständige Immobilisierung ist wichtig, da jede Bewegung die Wundgröße und die Sterblichkeit erhöhen könnte. Bienen, die zusammengerollt oder verkrümmt sind, wurden zu lange gekühlt und sollten aufgrund der hohen Sterblichkeit nicht verwendet werden. Setzen Sie eine Einweg-Nadel der Stärke 30 auf eine Hamilton-Mikrospritze.

Füllen Sie die Spritze mit drei Mikrolitern doppelsträngiger RNA und stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblase in der Spritze befindet. Wenn eine Einzelinjektionsstrategie verwendet wird, wird die Spritze mit einer Mischung der doppelsträngigen RNAs der beiden Gene gefüllt. Wenn eine zweitägige Injektionsstrategie verwendet wird, wird die Spritze mit einer der beiden doppelsträngigen RNAs gefüllt.

Führen Sie die Nadel an einer Seite des Abdomens ein. Um innere Organe nicht zu beschädigen, drücken Sie den Spritzenkolben langsam, damit die doppelsträngige RNA langsam aufgenommen werden kann. Da doppelsträngige RNA sehr viskos ist, dauert es zwei bis drei Sekunden, bis sie vollständig aus der Spritze ausgepresst ist.

Nachdem der Kolben vollständig heruntergedrückt wurde, lassen Sie die Nadel vier bis fünf Sekunden lang in der Wunde. Beobachten Sie die Bienen drei bis fünf Sekunden lang nach den Injektionen. Wenn eine Hämolymphe-Tropfen aus der Wunde austritt, entsorgen Sie die Biene und markieren Sie den Thorax der Bienen mit verschiedenen Farben entsprechend den unterschiedlichen Behandlungen.

Zu diesem Zeitpunkt, falls die Einzelinjektionsstrategie verwendet wird, die Bienen eine Stunde lang in einem Behälter mit bereitgestelltem Honig beobachten und sie anschließend wieder in einen Stock zurückbringen. Falls hingegen die zweitägige Injektionsstrategie angewendet wird und nur die erste doppelsträngige RNA injiziert wurde, die Bienen in einen Zylindergitterkäfig mit seitlich bereitgestelltem Honig setzen. Die Bienen am folgenden Tag über Nacht in einem Inkubator bei 34 Grad Celsius und 80 % Luftfeuchtigkeit aufbewahren.

Injizieren Sie dieselben Bienen mit der zweiten doppelsträngigen RNA, wobei das gleiche Verfahren wie bei der ersten doppelsträngigen RNA angewendet wird. Lassen Sie die Bienen eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einem Behälter mit bereitgestelltem Honig regenerieren und führen Sie sie anschließend in einen Stock ein. Sechs Tage nach den Injektionen sammeln Sie die behandelten Bienen aus dem Stock, ohne einen Raucher zum Öffnen des Bienenstocks zu verwenden.

Rauch wird nicht verwendet, da er die Geschmackswahrnehmung der Bienen beeinflussen könnte, die in diesem Verfahren getestet wird. Sammeln Sie die Bienen mit einer weichen Pinzette in Zylinderkäfigen aus Metallgitter, wobei nicht mehr als drei Bienen pro Käfig untergebracht werden, um die Bienen zu montieren. Für den PER-Test.

Kühlen Sie die Bienen bei vier Grad Celsius, bis sie vollständig immobilisiert sind. Befestigen Sie jede Biene vertikal in einem speziell für PER konzipierten Plastikröhrchen. Verwenden Sie Klebeband, um den Hinterleib im Röhrchen zu fixieren, während der Kopf aus dem Röhrchen herausragt.

Stellen Sie die Röhrchen auf ein Gestell mit zwei Reihen kleiner Kunststoffsäulen. Eine Reihe ist nummeriert, sodass den angebrachten Bienen eine ID-Nummer zugewiesen werden kann. Stellen Sie die Gestelle mit den behandelten Bienen für zwei Stunden in einen Inkubator bei 34 Grad Celsius und 80 % Luftfeuchtigkeit, während die Bienen inkubiert werden.

Stellen Sie eine Reihe von Saccharose-Wasser-Lösungen her. Füllen Sie die Lösungen in Spritzen mit Nadeln der Größe 15 bis 20 Gauge für den PER-Test ein.

Die Bienen werden in Gruppen getestet. Berühren Sie zuerst die Antenne jeder Biene mit einem Tropfen einer 0%-Lösung, die aus Wasser besteht, danach testen Sie mit 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% und 30% Saccharose. Verwenden Sie Wasserlösungen und lassen Sie zwischen jeder Lösung mindestens zwei Minuten Abstand.

Es dauert normalerweise etwa zwei Minuten, um 20 Bienen mit einer Konzentration von Saccharose zu testen. Daher sollten sich in jeder Gruppe immer mehr als 20 Bienen befinden. Wenn eine Biene ihren Rüssel vollständig ausstreckt, wird dies als positiver Reaktion in Echtzeit gewertet.

Die PCR-Analyse bestätigte, dass sowohl die Einzelinjektion als auch die zweitägige Injektionsstrategie die Transkriptmengen von Fiji und USP bei Honigbienen signifikant verringerten. Sechs Tage nach der Injektion der doppelsträngigen RNA zeigen diese Diagramme den RQ-Wert, der das relative Quantifizierungsniveau der Zielgentranskripte angibt, und die verschiedenen Buchstaben über den Balken kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen. Die nachgeschaltete Analyse ergab, dass die Unterdrückung des USP-Transkripts durch die Einzelinjektion mit einem Gemisch aus doppelsträngiger RNA sowie durch die zweitägige Injektion mit VG zuerst und USP danach signifikant niedriger war als bei der zweitägigen Injektion mit USP zuerst und VG danach.

Dies deutet darauf hin, dass VG ein primärer Regulator in der Regelkreisschleife von VG und juvenilen Hormonen sein könnte. GUA-basierte Antwortwerte oder GRS für die behandelten Bienen wurden aus den Ergebnissen des Proboscis-Verlängerungs-Tests oder PER-Assays wie hier gezeigt berechnet. Die GRS bei Bienen, die mit einer Mischung aus doppelsträngiger RNA gegen VG und USP injiziert wurden, war signifikant höher als die GRS bei den GFP-Kontrollbienen, was darauf hindeutet, dass die Bienen mit doppelter Genunterdrückung empfindlicher gegenüber Saccharose waren.

Die verschiedenen Buchstaben über den Balken kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen. Dargestellt ist hier ein möglicher regulatorischer Netzwerkzusammenhang zwischen Vg, Ultras, sphärisch und Juvenilhormon, der durch gleichzeitige Unterdrückung der Gene VG und USP aufgedeckt wurde. Während eine alleinige Herunterregulation von USP keine Veränderung des Juvenilhormons bewirkt, führt eine doppelte Herunterregulation von VG und USP zu einem stärkeren Anstieg des Juvenilhormons als eine alleinige Herunterregulation von VG.

Dies legt nahe, dass Vitelli nicht nur die Produktion von Juvenilhormon hemmt, sondern auch eine Rückkopplungsreaktion des Juvenilhormons auf die USP-Abschaltung unterdrückt. Bei doppelter Abschaltung resultiert der starke Anstieg der Juvenilhormonproduktion aus einer verminderten Hemmung durch VI-Genin, verursacht durch die VG-Abschaltung, sowie aus einer kompensatorischen Reaktion auf eine verminderte Juvenilhormon-Transduktion, hervorgerufen durch die USP-Abschaltung. Eine detailliertere Diskussion dieses regulatorischen Netzwerks findet sich im begleitenden Protokolltext.

Durch die Anwendung eines doppelten Gen-Knockdown-Ansatzes haben wir einen detaillierten Zusammenhang zwischen den essentiellen Genen vitellogenin, ultraspiracle, sphärisch und dem Juvenilhormon aufgezeigt, den wir nicht hätten entdecken können, wenn nur ein einziges Gen unterdrückt worden wäre. Mit dieser Technik können Forschende nun die Wechselbeziehungen zwischen Genen innerhalb regulatorischer Netzwerke untersuchen. Die Proboscisreflex-Methode (PR) ist ein Standardverfahren zur Messung der Geschmackswahrnehmung bei Honigbienen; sie ist jedoch sehr empfindlich gegenüber der Handhabung, weshalb beim Umgang mit den Tieren sowie bei der Aufrechterhaltung konsistenter Umweltbedingungen äußerste Sorgfalt erforderlich ist.

Des Weiteren ist es ratsam, eine kurze Zeitspanne festzulegen und darauf zu achten, dass sich Wetter und Umweltbedingungen nicht ändern, falls die Untersuchung über mehrere Tage durchgeführt wird.