Prostaglandin Extraktion und Analyse in Caenorhabditis elegans

Dieses Verfahren zielt darauf ab, Prostaglandine und andere Eicosanoide in Extrakten von Meereseleganz zu identifizieren und zu messen. Zuerst züchten Sie die Würmer in großflächigen Kulturen. Extrahieren Sie dann mit einer Extraktionstechnik für flüssige Flüssigkeiten die hydrophilen Lipide aus dem Wurmgewebe und injizieren Sie die Lipidextrakte in eine HPLC-Säule, die mit einem Massenspektrometer gekoppelt ist.

Analysieren Sie dann die Daten aus der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie. Letztendlich kann dieser lc-MSMS-Ansatz für gereinigte warme Extrakte neue Metaboliten identifizieren und auch bekannte Metaboliten wie die Prostaglandine der S-Serie messen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. Enzymimmunoassays, besteht also darin, dass sie hochempfindlich und spezifisch ist, während sie gleichzeitig umfassend und flexibel ist und diese Technik von Hugh Hong, einem Doktoranden aus meinem Labor für die ergänzende Fütterung der Würmer Pellet und NA 22, demonstrieren wird.

Bakterienkultur durch Zentrifugation, Verwerfen des Überstands und Wiederbelebung des Bakterienpellets in 100 Millilitern M neun Puffer. Lagern Sie die konzentrierte Bakterienlösung bei vier Grad Celsius. Starten Sie die Wurmkulturen auf fünf extra großen NGM-Platten.

Vermehren Sie die Würmer drei bis vier Generationen lang, bis die Platten voller Schwerkraft sind. Erwachsene verhindern ein Verhungern von etwa einem Milliliter der konzentrierten Bakterien auf die Wurmplatten nach Bedarf. Trocknen Sie ihn vollständig an der Luft, bevor Sie den Deckel aufsetzen.

Als nächstes die Greifhermaphroditen von den Platten mit M neun Puffer abwaschen. Ernten Sie die Würmer in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen. Lassen Sie dann die Würmer am Boden absetzen.

Entsorgen Sie den Überstand, der Bakterien, Eier und Würmer im Larvenstadium enthält. Nun Resus, die restlichen Würmer in 15 Milliliter M neun Puffer suspendieren und vorsichtig mischen. Verteilen Sie 200 Mikroliter der Wurmsuspension auf jede der 60 besäten N GM-Platten.

Lassen Sie die Wurmlösung gut vermischt, bis alle Platten ausgesät sind, um sicherzustellen, dass sie ungefähr die gleiche Anzahl von Würmern erhalten. Verteile die Würmer auf den Tellern. Züchten Sie die Würmer für zwei bis vier Generationen und ergänzen Sie sie mit einem Milliliter konzentrierter Bakterien pro Platte und einem Zeitraum von 12 bis 24 Stunden.

Wenn die Teller voll mit erwachsenen GR-Tieren sind, ernten Sie die Würmer einen Stamm nach dem anderen. Die Würmer mit M neun Puffer von den Platten waschen und in sechs 50-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen umfüllen. Füllen Sie die Röhrchen mit M neun Puffer, um die Würmer zu waschen.

Wenn sich der erwachsene Greifer auf dem Boden abgesetzt hat, entfernen Sie etwa 35 Milliliter des Überstands. Ziehe dann die Würmer in ein oder zwei Röhrchen. Wiederholen Sie den Waschgang M neun dreimal oder bis der Überstand mit einer Pastipipette mit großem Durchmesser durchsichtig ist.

Übertragen Sie so viele Würmer wie möglich in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen. Fünf Minuten lang bei 1000 RCF zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Wiederhole die Ernte-, Wasch- und Konsolidierungsschritte für die anderen Stämme.

Lagern Sie die Lagerbestände der geernteten Wurmstämme bei minus 80 Grad Celsius. Beachte das Gewicht eines konischen Polypropylenrohrs mit einer glühenden Rasierklinge. Schneide ein gefrorenes Polypropylen-Röhrchen mit geernteten Würmern in die Nähe der Sechs-Milliliter-Marke.

Unter sterilen Bedingungen. Übertragen Sie etwa sechs Gramm gefrorenes Wurmpellet auf die Gedankenprobe. Fügen Sie ein Nanogramm des internen Standards und 12 Milliliter eiskalte Aceton-Kochsalzlösung hinzu.

Mit der BHT-Mischung 1,5 Milliliter der Wurmaufschlämmung auf 12 selbststehende Kunststoffröhrchen mit fünf Millilitern auf jedes Röhrchen verteilen. Fügen Sie 0,7 Milliliter der stark stabilisierten Zirkonoxidkügelchen hinzu. Homogenisieren Sie die Schneckensuspension bei Bedarf.

Wiederholen Sie den Vorgang für eine weitere Minute, um mit einer 9-Zoll-Weidepipette weniger als 10 % der intakten Würmer zu erhalten. Füllen Sie das Homogenat, aber nicht die Kügelchen vorsichtig in vier konische 10-Milliliter-Glasröhrchen. Kombinieren Sie die Kügelchen aus drei Tuben und waschen Sie sie mit einem Milliliter Aceton-Kochsalzlösung, die BHT enthält.

Wiederholen Sie diese Wäsche für die verbleibende Perle, die die Röhrchen enthält. Übertragen Sie die Waschlösung auf Eis in die Glasröhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie das Homogenat 10 Minuten lang bei 1000 g.

Bei vier Grad Celsius wird der Überstand aus jedem Röhrchen in ein sauberes konisches 10-Milliliter-Glasröhrchen überführt. Geben Sie dann in einer chemischen Haube das gleiche Volumen Hexan zu jedem Röhrenwirbel bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden. Nach Zentrifusion bei vier Grad Celsius bei 1000 G für 10 Minuten.

Die obere Phase, die das Hexan und die neutral geladenen Lipide enthält, wird bei zwei Millimol Ameisensäure verworfen, um die untere wässrige Phase anzusäuern. Test mit pH-Streifen auf einen pH-Wert von 3,5. Geben Sie nun die gleichen Mengen Chloroform in jeden Röhrenwirbel bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden.

Zentrifugieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius bei etwa 1000 GS pro 10 Minuten. Führen Sie eine Glaspipettenspitze in die untere Chloroformphase ein und versuchen Sie, die feste Grenzfläche durch Kippen des Röhrchens zu vermeiden. Ziehen Sie die Extrakte aus vier Röhrchen in ein einzelnes konisches 15-Milliliter-Glasröhrchen.

Spülen Sie die Luft im Glasrohr mit Stickstoffgas und inkubieren Sie bei minus 20 Grad Celsius für 24 Stunden bis zwei Wochen. Nach dem Auftauen des Extrakts die verbleibende milchige, wässrige Deckschicht, falls vorhanden, entsorgen. Mit einer neuen Pipette.

Übertragen Sie das Chloroform in ein mit Teflon ausgekleidetes halbes DRM-Glasfläschchen in einer chemischen Haube. Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel in einem schonenden Stickstoffgasstrahl und lagern Sie die Proben bis zu zwei Wochen lang bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie zunächst Stammlösungen von einzelnen Referenzprostaglandinen in Methanol vor.

Erzeugen Sie nun eine Standardkurve durch serielle Verdünnung in 80%Methanol. Als nächstes lösen Sie die getrockneten Sea Elegance Lipidextrakte zur Analyse in 200 Mikrolitern 80% Methanol auf. Injizieren Sie 20 bis 50 Mikroliter der Probe in die Umkehrphasensäule und führen Sie eine Gradientenanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben, unter Verwendung der ESI-Schnittstelle im Negativionenmodus.

Führen Sie das Säulenabwasser in das Massenspektrometer ein. Stellen Sie das Kollisionsgas auf 10 Elektronenvolt ein. Die Kollisionsenergie liegt bei minus 35 Elektronenvolt.

Die Temperatur liegt bei 600 Grad Celsius. Das Entrümpelungspotential bei minus 90 und das Zellaustrittspotential bei minus 11 erzeugen eine Standardkurve, um die verschiedenen Klassen von Prostaglandinen, die in den extrahierten Proben vorhanden sind, mit Hilfe von Analytikersoftware zu analysieren. Verarbeiten Sie die Daten, um Prostaglandine zu identifizieren, die in den Wurmextrakten enthalten sind.

Survey-Scans der drei mutierten Wurmextrakte vom Wildtyp und des Fetts zeigen die globalen Ionenkonzentrationen im Massenbereich von 315 bis 360 atomaren Masseneinheiten. Im Vergleich zu den Wildtyp-Würmern fehlen den fetten drei Mutanten die meisten 20 Kohlenstoff-PFAS, wie z. B. ein Prostaglandin der F-3-Klasse zeigt. Da das Master-Charge-Verhältnis 3 51 grau hinterlegt ist, können MRM-Analysen die verschiedenen Klassen von Prostaglandinen identifizieren.

Zum Beispiel sind die Prostaglandine der F1-Klasse in Wildtyp-Extrakten sowie mehreren anderen hydrophoben Verbindungen mit längeren Retentionszeiten enthalten, die den Massenübergang variieren, was eine weitere Analyse der Prostaglandine der F-2- und F-3-Klasse ermöglicht, was darauf hindeutet, dass die Wurmextrakte mehrere Prostaglandin-Isomere jeder Klasse enthalten. Der Vergleich der kollisionsinduzierten Zersetzung des Meereseleelegance-Prostaglandins mit dem Standard-Prostaglandin kann verwendet werden, um die Produktion von Ionen von Zu erwartende Spaltstellen. Um die Lipidoxidation zu verhindern.

Denken Sie daran, die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen zu treffen. Fügen Sie beispielsweise das Antioxidans VHT zur angegebenen Lösung hinzu und spülen Sie den Extrakt mit Stickstoffgas aus.