Vorbereitung des Mgm101 Rekombinationsprotein von MBP-based Tagging-Strategie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, große oligomere DNA-bindende Proteine wie MGM 1 0 1 mithilfe der Maltose-Bindeprotein- oder MVP-Tagging-Strategie herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst der offene Leserahmen von MGM 1 0 1 downstream von MVP in den PMLC zwei E-Vektor kloniert wird, um eine Expression in e coli zu ermöglichen. Das M-V-P-M-G-M 1 0 1-Fusionsprotein wird anschließend aus e coli mittels AMLO-Affinitätschromatographie gereinigt.

MGM 1 0 1 wird anschließend durch proteolytische Spaltung von MVP freigesetzt und mittels Kationenaustauschchromatographie von MVP getrennt. Schließlich werden die MGM 1 0 1-Ringe durch Größenauschlusschromatographie auf Homogenität gereinigt. Letztendlich erhält man etwa 0,8 Milligramm lösliches MGM 1 0 1.

Aus einem Liter Bakterienkultur kann die biochemische und strukturelle Charakterisierung dieses Proteins durchgeführt werden, das für die DNA-Reparatur in Mitochondrien wichtig ist. Der Hauptvorteil der Verwendung einer mit einem sterblichen Bindungsprotein markierten Version von MGM 1 0 1 liegt darin, dass diese Version weniger toxisch, löslicher und stabiler ist als die nicht-markierte Version. Dadurch können wir eine hohe Expression des nativen MGM 1 0 1-Proteins in E. coli erreichen.

Hallo, mein Name ist Sarah Vicki. Ich bin wissenschaftliche Angestellte in der Forschungsgruppe von Dr. Jji TEN an der SUNY Upstate Medical University. Meine Kollegin Wan Wong und ich werden nun die Expression und Reinigung von MGM101 demonstrieren. Beginnen Sie mit der Erzeugung des Fusionsproteins, indem Sie mittels PCR die reife MGM101-Kodiersequenz amplifizieren.

Schließen Sie die ersten 22 aminoterminalen Reste von MGM 1 0 1 nicht ein, die als gespalten bekannt sind. Nach dem Import in die Mitochondrien wird das amplifizierte MGM 1 0 1 stromabwärts der MAL E-Sequenz positioniert, die für das Maltose-Bindepotein oder MVP in einer modifizierten Version des Expressionsvektors PM MAL C zwei E kodiert. Dies erzeugt die M-V-P-M-G-M 1 0 1-Fusion mit einem Linker, der eine Spaltstelle für die Precision-Protease enthält. Das Plasmid wird zunächst konstruiert, indem E. coli-Transformanten ohne die Blau-Weiß-Auswahl ausgewählt werden.

Das resultierende Plasmid PLC zwei E, MGM 1 0 1 wird anschließend in den E. coli-Stamm BL zwei eins Codon plus DE drei RIL eingeführt und auf LB-Platten, die Ampicillin und Chloramphenicol enthalten, kultiviert. Beginnen Sie damit, eine frische 10 Milliliter Probe des supplementierten LB-Mediums mit den E. coli-Transformanten zu beimpfen und diese über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 UPM zu inkubieren. Inokulieren Sie am nächsten Tag zwei Liter des supplementierten LB-Mediums mit 10 Millilitern der Vorkultur.

Züchten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Wenn die OD 600 den Wert 0,5 erreicht hat, induzieren Sie die Expression des M-B-P-M-G-M 1 0 1 Fusionsproteins durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 0,3 Millimolar und züchten Sie die Zellen weitere fünf Stunden unter Schütteln bei 30 Grad Celsius. Nach Ablauf der fünf Stunden überführen Sie die Kulturen in 500 Milliliter Zentrifugenflaschen und sammeln die Zellen durch Zentrifugation.

Nach dem Verwerfen des Überstandes 30 Milliliter Lysepuffer, der Proteaseinhibitoren enthält, hinzufügen und das Zellpellet durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendieren. Anschließend die Zellsuspension 20 Sekunden lang auf Eis sonifizieren. Unter Verwendung eines Ultraschallprozessors mit 50 % Tastverhältnis die Zellen 30 Sekunden lang auf Eis abkühlen lassen.

Danach die Beschallung und Abkühlung zwei weitere Male wiederholen. Die Suspension dabei auf Eis halten. Ein Milliliter einer Lösung mit zwei Milligramm pro Milliliter hinzufügen.

DNAs eine Probe schütteln Sie das Zelllysat zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Nachdem zwei Stunden vergangen sind, stellen Sie die endgültige Salzkonzentration auf 500 Millimolar ein, indem Sie vier Milliliter einer fünf Molaren Natriumchloridlösung zu 36 Millilitern Lysat hinzufügen.

Danach das Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius entfernen. Das Überstand in ein frisches Gefäß überführen. An diesem Punkt kann ein 20-Mikroliter-Aliquot verwendet werden, um die Wirksamkeit der Lyse durch Beschallung zu überwachen.

Auf einem SDS-Seitengel. Als Nächstes wird das Zelllysat über eine Amylose-Säule geleitet. Um das MVP-MGM-1-0-1-Fusionsprotein zu reinigen, geben Sie zunächst 1,5 Milliliter einer 50 %igen AMLO-Harz-Suspension in ein 15-Milliliter-Kegelrohr.

Danach 13 Milliliter Lysepuffer hinzufügen, um es zu equilibrieren, und bei 2000 × g fünf Minuten lang zentrifugieren. Diesen Waschschritt noch viermal wiederholen, dann das Harz in 0,75 Milliliter Lysepuffer resuspendieren. Die equilibrierte AMLO-Suspension zum Zelllysat geben und über Nacht vorsichtig bei vier Grad Celsius schütteln.

Am nächsten Tag das Lysat-Amylose-Harz-Gemisch auf eine Säule für die Econo-Säulenchromatographie laden, die in einem Kühlschrank installiert ist. Den Hahn öffnen, um die nicht gebundenen Proteine durch Schwerkraftfiltration in ein Sammelgefäß laufen zu lassen. Anschließend wird das AMLO-Harz gewaschen, indem 300 Milliliter Waschpuffer eins hinzugefügt werden.

Einmal durchlaufen lassen. Den Waschschritt mit 150 Milliliter Waschpuffer zwei erneut durchführen. Nach Zugabe des Ellucian-Puffers und Sammeln des EIT gemäß der schriftlichen Anleitung die Ausbeute und Reinheit von M-V-P-M-G-M 1 0 1 bestimmen, indem eine Aliquot des EIT auf ein SDS-Page-Gel aufgetragen wird.

Nachdem das Gel gelaufen ist, führen Sie eine Kumasi-Färbung durch, wobei eine hauptsächliche einzelne Bande von etwa 70 Kilodalton sichtbar sein sollte. Geben Sie 50 Einheiten Präzisionsprotease zu den M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs hinzu und geben Sie diese in ein Dialyseröhrchen mit Dialysepuffer. Lassen Sie den Spaltvorgang über Nacht bei vier Grad Celsius ablaufen.

Führen Sie ein SDS-Page-Gel wie zuvor durch. Um die Effizienz des Schnitts zu beurteilen, sollte eine vollständige Spaltung zwei Banden von 42 und 28 Kilodalton ergeben, die jeweils MVP und MGM 1 0 1 entsprechen. Laden Sie das gespaltene MVP MGM 1 0 1 mittels mehrfacher Injektionen auf eine Bio-Scale Mini Macro-Prep-High-S-Kartusche, die mit einem BioRad Biologic DUO-Flow-FPLC-System verbunden ist.

Beginnen Sie die Kationenaustausch-Chromatographie mit einer stufenweisen Salzgradientenelution von fünf Millimolar 300, Millimolar 500, Millimolar 750 und 1000 Millimolar Natriumchlorid. Dieser wird durch Mischen von Puffer A und Puffer B hergestellt. Stellen Sie die Flussrate auf 0,5 Milliliter pro Minute ein. Sammeln Sie Fraktionen zu je zwei Milliliter in einem Fraktionssammler. Typischerweise eluiert MGM 1 0 1 bei 500 Millimolar Salzgehalt.

Kombinieren Sie die Fraktionen für den MGM101-Peak und überprüfen Sie die Reinheit des Proteins mittels SDS-PAGE-Gel. Der MGM101-Peak sollte nach der Kombination der Proteinfraktionen aus der Kationenaustausch-Chromatographie ein einzelnes Band von etwa 28 Kilodalton aufweisen, nachdem das Protein über Nacht bei vier Grad Celsius im GF-Equilibrationpuffer dialysiert wurde. Danach überführen Sie das Protein in eine Amicon Ultra-15-R-Zentrifugalfiltereinheit und zentrifugieren bei 3000 × g bei vier Grad Celsius, um das Protein zu konzentrieren.

Sobald das Volumen auf etwa ein Milliliter reduziert ist, das MGM 1 0 1 auf einer kalibrierten Supra-Six-Prep-Grade-Säule auftragen, die mit dem Chromatographiepuffer vorgespült wurde, und die Größenausschlusschromatographie mit dem Chromatographiepuffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 Millilitern pro Minute starten. Große oligomere Proteine eluieren in frühen Fraktionen, während kleine Proteine in späten Fraktionen eluieren. Die MGM 1 0 1-Ringe eluieren bei etwa 400 Kilodalton.

Sammeln Sie die Fraktionen der gereinigten MGM101-Peaks mithilfe eines Fraktionssammlers. Geben Sie Aliquote der Fraktionen auf ein 12 % SDS-PAGE-Gel, um die endgültige Qualität des Proteins zu überprüfen. Konzentrieren Sie das Protein anschließend mit Aveva. Zentrifugieren Sie sechsmal bei 3000 × g und 4 °C.

Die Protein-Aliquots anschließend durch zweiminütiges Eintauchen in flüssigen Stickstoff in Mikrozentrifugenröhrchen schnell einfrieren. Die Proben bei minus 80 Grad Celsius innerhalb von sechs bis zwölf Monaten lagern. Die MGM-1-0-1-Proben für den Einzelstrang-DNA-Bindungs-Assay und für die strukturelle Visualisierung mittels Transmissionselektronenmikroskopie verwenden.

Die Ergebnisse des elektrophoretischen Mobilitätsverschiebeassays zeigen, dass das gereinigte MGM101 eine starke Bindungsaktivität gegenüber einsträngiger DNA besitzt. Die einsträngige DNA-Sonde wird zunehmend in den Mulden eines nativen Polyacrylamidgels durch das oligomere MGM101 zurückgehalten.

Da M GM 1 0 1 in einer Konzentration von mehr als 400 Nanomolar zugegeben wird. Diese Elektronenmikroskopaufnahmen zeigen die übergeordnete strukturelle Organisation von MGM 1 0 1. Das frisch hergestellte M GM 1 0 1 liegt als deutliche Ringe mit einem Durchmesser von 20 Nanometern vor, die mittels negativer Anfärbung in der Transmissionsmikroskopie sichtbar gemacht werden können.

Nach mehreren Wochen Lagerung bei vier Grad Celsius bildet MGM 1 0 1 supramolekulare helikale Filamente. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Woche abgeschlossen werden.

Vielen Dank fürs Zuschauen.