Name: Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Erfahren Sie die adenovirale Transduktion zur Genexpression in naiven CD4 T-Zellen vor der Treg-Differenzierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung früher molekularer Ereignisse ohne Beeinträchtigung der Zellviabilität.

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Die Autoren möchten Lirui Du für den Bau des pCAGAdDU Vektor und Oliver Gorka für die Bereitstellung der Fixierung Protokoll danken.

1. Klonierung eines Gens von Interesse in einem Eintrag Vector <ol><li> Klonen Sie das Gen von Interesse in einem Eintrag Vektor. PCR-Amplifikation des Gens von Blunt-End-Ligation in einem Topoisomerase-gekoppelten Vektor (zB pENTR / D-TOPO) oder Restriktionsenzym-vermittelte Klonierung kann für dieses Verfahren verwendet werden, gefolgt. </li></ol> 2. Die Übertragung des Gens von Interesse in der pCAGAdDu Destination Vektor <ol><li> Übertragen Sie das Gen von Interesse aus dem Eintrag in das Ziel-Vektor Vektor durch LR Rekombination (zB Gateway-LR Clonase II Enzyme Mix). Dadurch wird der adenoviralen Expressionsvektors (Abbildung 1). </li><li> Linearisieren 10 ug des adenoviralen Expressionsvektors in einem Pacl Restriktionsverdau, die DNA auszufällen und resuspendieren in Wasser bei einer Konzentration von 3 g pro 100 ul. Linearisierung befreit die viralen invertierten Repeats (ITR), die für die Replikation und Einkapselung des v erforderlich sindIRAL DNA in Viruspartikel. </li></ol> 3. Die Erzeugung des Primary Viruslysat <ol><li> Seed 1 x 10 5 HEK293A Zellen in 2 ml Zellkulturmedium (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) in ein Well einer 6-Well-Platte und Inkubation der Zellen für 6 - 14 Stunden bei 37 ° C in einer 10% CO 2-Inkubator, damit sie halten. Die Zellen sollten dann bei ca. 50% Konfluenz werden. </li><li> Lipofection: Transfer 6 ul jetPEI Reagenz in 94 ul 50 uM NaCl, kurz vortexen. In der gemischten Lösung zu 100 ul linearisierten Adenovirus-Vektor unter Vortexen und Inkubation dieses Transfektionsgemisch für 15 - 30 min bei Raumtemperatur. </li></ol> Führen Sie alle folgenden Schritte unter den entsprechenden Bedingungen für Biosicherheit Adenovirus-Infektion! <ol start="3"><li> Abgeben der Lösung auf dem HEK293A Zelle enthaltende Vertiefung zugetropft und Inkubation der Zellen bei 37 ° C und 10% CO 2. Bei Verwendung eines Fluoreszenz-Marker bewerten transfektion Effizienz visuell nach 12 - 36 Stunden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop. 0,5 ml frisches Medium alle 3 Tage. </li><li> Überprüfen Sie jede 2 - 3 Tage mit einer leichten oder Fluoreszenzmikroskop für zytopathische Effekte (CPE), die Bereiche mit vergrößerten und abgerundeten Zellen, die zu lösen beginnen. Dies deutet auf eine effiziente Virus Generation. Beim Auftreten von breiteren Zonen der CPE (Abbildung 3), dauert es 24 bis 72 Stunden, bis alle Zellen infiziert sind. </li><li> Wenn alle Zellen zeigen Anzeichen von CPE, aber bevor eine allgemeine Ablösung von Zellen auftritt, lösen die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und Transfer Zellen mit Überstand (SN, 3 - 5 ml) in ein 15 ml Röhrchen Polystyrol. </li><li> Einfrieren der Zellen in der SN auf Trockeneis für 15 - 20 min und auftauen sie schnell bei 37 ° C anschließend zum Bruch der Zellen. Wiederholen Sie diesen Frost-und Tauwetter-Zyklus (F / TC) zwei weitere Male. Halten Sie die primäre Viruslysat auf Eis für die Nutzung innerhalb eines Tages oder frieren Sie sie bei -80 ° C für die langfristige Lagerung. Jede zusätzliche F/ TC wird die Virustiter um 30 reduzieren - 50%. </li></ol> 4. Virus Amplification <ol><li> Seed und wachsen HEK293A Zellen 90% Konfluenz auf 14 cm Gewebekulturschale. </li><li> Infect die Zellen mit der Hälfte der primären Virus-Lysat (1,5 - 2,5 ml) und Inkubation der Zellen für mindestens 36 Stunden. Nahezu alle Zellen sollten dann infiziert werden können, was durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden. Für die Re-Verstärkung eines bereits verstärkt (dh mehr konzentriert) Virus Lager, infizieren HEK293A bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 50 (siehe 6.3). </li><li> Die Zellen sollten geerntet werden, wenn sie alle CPE zeigen aber vor Ablösung werden. Mit effizienten Virus-Produktion wird dieser Zustand innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion erreicht. (Falls es dauert bis zu einer Woche, sollten eine weitere Runde der Verstärkung durch die Erhöhung der Menge von Adenovirus Lager für die Infektion in 4.2 beschrieben wird.) </li><li> Lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und Transfer Zellen und SN auf eine 50 ml Tube Polystyrol. Spin Zellen nach unten bei 300 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die SN und das Pellet in einem geeigneten Volumen an Medium oder SN (ca. 1 ml). </li><li> Führen Sie 3 F / TC, um die Zellen und Zentrifuge bei 800 g für 15 min bei 4 ° C stören Nehmen Sie den SN, dass die Viruspartikel enthält (dh die konzentrierte Viruslysat) und Aliquot der Viruslysat es bei -80 ° C lagern </li></ol> 5. Virus Titer Bestimmung <ol><li> Seed 10 5 A549 Zellen pro Well in 5 Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen in 1 ml Medium und lassen Zellen 6 h ​​lang anhaften. </li><li> Verwenden Sie 1 ul konzentrierter Adenovirus (auf Eis aufgetaut), um eine serielle Verdünnung in Medium (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) durchführen und mit 10 ul pro Well. Eine Vertiefung, um die infizierten Gating in der Durchflusszytometrie einzustellen. </li><li> Nach 36 Stunden, nehmen Sie den SN, waschen mit PBS lösen und Zellen (zB durch Trypsinisierung). Für Biohazard Vorsichtsmaßnahmen, ist es empfehlenswert, c behebenEllen in 100 ul 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei Raumtemperatur und Waschen mit PBS einmal. </li><li> Führen Sie eine FACS Analyse der Infektion Marker Ausdruck. Plot &#39;ul Viruslysat angewendet &quot;gegen die absolute Zahl der infizierten Zellen (Abbildung 4). Bestimmen Sie den linearen Bereich der Infektion und die Berechnung der Titer pro ml unverdünnt Virus aus der Standard-Kurve über den linearen Bereich mit x = 1.000 ul. </li></ol> 6. T-Zell-Infektion <ol><li> Isolieren naive / ruhenden CD4 T-Zellen aus DO11.10 tg; CARΔ1 tg Mäusen mit MACS (Naive CD4 + T-Zell-Isolation Kit II) oder FACS-Sortierung (CD4 + CD25-CD62L + CD44-). </li><li> Für kleine Experimente, Pipette eine angemessene Lautstärke Viruslysat eine MOI von 50 in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden erreichen. </li><li> Fügen Sie bis zu 4 x 10 5 T-Zellen in einem abschließenden Infektion Volumen von 50 ul in T-Zell-Medium (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM WesentlicheVitamin, 1x L-Glutamin, 1:250.000 Mercaptoethanol, 10 mM HEPES). Beispiel: Einer MOI von 50 wird verwendet, um 3 x 10 5 T-Zellen zu infizieren; das virale Titer ist 3 x 10 9 ml -1 Virus volume = MOI x T Zellzahl / virale Titer = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0,005 ml </li></ol> Hinweis: für die Infektion von größeren Zellzahlen, Scale-up mit einer MOI von 50 in einer Infektion Volumen von 165 ul pro 10 6 naiven T-Zellen in einem Polystyrol-Röhrchen mit losen cup (bis tp 3 ml pro Röhrchen). <ol start="4"><li> Inkubieren Zellen für 90 min bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Spin down Zellen bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur ausziehen SN, in 200 ul PBS resuspendieren. Zentrifuge wieder ausziehen SN. </li></ol> (Optional: die Zellen wieder gewaschen werden, um das Virus effizienter zu entfernen) <ol start="6"><li> Die Zellenin 200 ul T-Zell-Medium ohne stimulierenden Antikörpern und ohne IL-2 oder anderen Zytokinen und ruhen sie für 40 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Inkubator, um die Expression des Gens von Interesse vor der Aktivierung zu ermöglichen. </li></ol> 7. T-Zell-Aktivierung und Polarisation <ol><li> Pipette ein Volumen von anti-CD3-und anti-CD28-gekoppelten Kügelchen, die die Anzahl der Zellen (z. B. 4 x 10 5) gleich in eine kleine Tasse Reagenz, fügen Sie die 10-fache Volumen PBS und legte sie auf einem Magneten für 2 min . Nehmen Sie den Überstand und resuspendieren die Perlen in 200 ul polarisierende Medium (Tregs: T-Zell-Medium + 1 ng / ml TGF, 100 U / ml IL-2). </li></ol> Hinweis: Die Zellen können auch unter Verwendung aktiviert Zellkulturschalen mit anti-CD28 und anti-CD3-Antikörper beschichtet werden, oder in einem DO11.10 T-Zell-Rezeptor-spezifische Weise unter Verwendung von bestrahlten BALB / c-Splenozyten mit Ovalbumin 323-339 Peptidantigen gepulst. <ol start="2"><li> Centrifuge die ausgeruht Zellen wie zuvor, nehmen Sie den SN und Zellen in 200 ul polarisierende Medium mit anti-CD3-und anti-CD28-Antikörper-gekoppelten Kügelchen. Inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C in einer 5% CO 2-Inkubator ohne Medium. </li></ol> 8. T-Zell-Fixierung und Färbung für die Durchflusszytometrie <ol><li> Waschen der Zellen: Spin down Zellen bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur ausziehen SN, in 200 ul PBS resuspendieren. Zentrifuge wieder ausziehen SN. Führen Sie alle folgenden Waschschritte entsprechend. </li><li> Die Zellen in 100 ul feststellbar tot Zellfärbung Lösung und Inkubation für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Zellen resuspendieren in 100 ul PBS, fügen Sie 100 ul 4% Paraformaldehyd in PBS, Inkubation 15 min bei RT. </li><li> Waschen der Zellen resuspendieren sie in 200 ul eiskaltem 70% Methanol in PBS und Inkubation für 30 min auf Eis. </li></ol> Hinweis: Die Zellen können von nun an ohne biohazard vorsorglich behandelt werden!<ol start="5"><li> Bereiten Sie 60 ul Master-Mix aus 60 ul PBS + 10 ug / ml Fc-Block (anti-FCR3 unspezifische Bindung zu blockieren). Waschen der Zellen resuspendieren sie in 40 ul PBS + Anti-FCR3 und Inkubation 15 min bei RT. </li><li> In 20 ul PBS + Anti-FCR3 mit 1 ug PE-gekoppelten anti-Foxp3 Antikörper, gut mischen und bei 4 ° C inkubieren über Nacht. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS und analysieren Zellen auf einem Durchflusszytometer. </li></ol>

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Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.

Virus Generierung und Titration Für eine optimale Transfektion Ergebnisse scheinen die Qualität und Menge der linearisierte Vektor wichtigste. Konnten wir nicht beobachten negative Auswirkungen auf die primären Lysat Produktion von einer anfänglichen Überwucherung der Kultur seit der Infektion schnell gehen wird, sobald effiziente Virus-Produktion auftritt. Virus kann jedoch die Produktion um HEK293A Zellen durch lange Einsätze, die die Effizienz verringern betroffen sein. Einige offene Leserah...

Tregs sind entscheidend für die Immuntoleranz zu halten und überschießenden Immunreaktionen dämpfen. Tregs unterdrücken Zuschauer T-Zell-Aktivierung. Folglich führt Ablation von Tregs zu tödlichen Autoimmunität und Selbstzerstörung durch aktivierte T-Zellen 1 angetrieben. Tregs im Thymus entwickeln während negative Selektion von CD4-positiven einzigen Vorstufen, aber sie können auch in der Peripherie zu unterscheiden von naiven CD4 + T-Zellen bei niedriger Dosis Antigen-Stimulation mit suboptimalen Kostimulation 1,2. Thymic Tregs scheinen Gewebe Autoimmunität gegen Selbst-Antigene zu unterdrücken, während peripheren Tregs bei der Bereitstellung von Toleranz im Darm oder der Lunge in Verbindung gebracht haben. Diese induzierten Tregs potently verhindern T-Zell-Aktivierung nach Anerkennung ausländischer Antigene in der Schleimhaut, einschließlich Umwelt-Antigenen aus Nahrung und Luft, symbiotischer Bakterien, Allergene und 3,4. Darüber hinaus sind Tregs entscheidend für mütterliche Toleranz gegenüber fetalen Peptide 5 zu etablieren und vormontiertEntlüftung graft-versus-host disease 6. Zur gleichen Zeit, Tregs vermitteln auch unerwünschte Effekte durch Dämpfung Immunüberwachung von Tumorzellen 7,8. Das Erkennungsmerkmal der Tregs ist der Ausdruck der Teilmenge-Angabe Transkriptionsfaktor Foxp3, eine Gabel-Kopf-domain-containing Transkriptionsfaktor, der notwendig und ausreichend verleihen Treg-Funktion ist 9,10. Einige Signalwege, die Foxp3-Expression zu induzieren können, sind bekannt. Allerdings sind die molekularen Prozesse, die steuern, regulieren, modulieren oder Treg Differenzierung in Antwort auf T-Zell-Rezeptor auslöst weniger gut verstanden. Tregs sehr effektiv in vitro durch die Stimulierung der naiven CD4 T-Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28-Antikörper in Gegenwart von TGF-2 und IL 11 ausgelöst werden. Da die Schwellenländer Tregs in vivo, die Manipulation von Molekülen, die Treg Differenzierung zu fördern sind funktional trägt enormes Potential für zukünftige therapies z. B. die Behandlung von Asthma, Morbus Crohn, und Transplantation 11,12. Umgekehrt kann therapeutische Modulation von Molekülen an Treg Differenzierung blockieren bieten Nutzen in Zukunft Ansätze der kombinierten Behandlung von Tumorpatienten. In vitro Differenzierung Assays sind für die Beschreibung der molekularen Veränderungen, die mit T-Zell-Untergruppe Differenzierung verbunden sind maßgeblich. Im Moment, experimentelle Versuche, Suche oder Bildschirm für die Gen-Produkte, die Kontroll-T-Zell-Differenzierung durch die Tatsache, dass die häufigsten Methoden der ektopische Genexpression in naiven T-Zellen nicht behindert werden. So sind zum Beispiel die Elektroporation und die retrovirale Transduktion nur wirksam in aktivierten T-Zellen. Im Gegensatz zu den ursprünglichen Erwartungen lentiviralen Transduktion, die in der Regel wirksam in ruhenden Zellen ist, erfordert vor Aktivierung naiver T-Zellen durch Zytokine 13. Ferner kann die Übertragung von cDNA oder mRNA bei der Elektroporationbeinhaltet Depolarisation der Zellmembran, die sich verleiht Eigenschaften der T-Zell-Aktivierung und sogar mobilisieren Ca 2 +-Signalisierung und aktivieren NFAT Proteinen (unveröffentlichte Beobachtung und ref. 14). Auch für retrovirale Transduktion haben die naiven T-Zellen für 18 aktiviert werden - 40 Stunden. Während dieser Zeit erfolgt die Auswertung der Kernmembran im Verlauf der Zellteilung ermöglicht und für die nachfolgende genomische Integration des retroviralen Vektors 15. Diese Methoden sind daher nicht in der Lage, um die frühe molekulare Regulation der ersten Begegnung mit T-Zell-Antigen, das die entscheidende Phase der Helfer-T-Zell-Differenzierung ist anzugehen. Adenovirus-Transduktion ist bekannt, ektopische transienten Genexpression in einer Reihe von humanen Zelltypen, die den menschlichen Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR) zum Ausdruck zu verleihen. Es geht ohne Anforderung für Zell-Aktivierung oder Zellzyklus-Progression. Die Oberflächenexpression von CAR ist von wesentlicher Bedeutung für eine effiziente Bindung und Internalisierung Virus, und transgene Expression der verkürzten Version CARΔ1 unter einem T-Zell-spezifischen Promotors wurde festgestellt, dass Mäusethymozyten und T-Zellen anfällig für Adenovirusinfektion 16 machen. Wichtig ist, dass das Transgen nicht ändern Thymozyten Entwicklung oder in vitro Differenzierung von naiven CD4-T-Zellen in verschiedene Untergruppen (Daten nicht gezeigt; ref 17.). Adenovirus-vermittelte Transduktion von T-Zellen wurde zuvor zur Überexpression 17,18 verwendet und Knock-down-Ansätze 19,20. Die transgenen T-Zellen können aus kommerziell erhältlichen DO11.10 tg gereinigt werden; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. und 17 ref.). Wichtig ist, ermöglicht adenoviralen Transduktion hohe Expression eines Gens von Interesse in naive T-Zellen zu induzieren, ohne offensichtliche Anzeichen der Aktivierung. Die T-Zellen bleiben naive (CD44 niedrig, CD62L hoch) und Ruhe-(CD25 -, CD69 -) nach infectiauf und kann aktiviert und in Treg ähnlich nicht infizierten Zellen unterschieden werden. Herstellung von rekombinanten Adenoviren nach Transfektion von Zellen mit adenoviralen HEK293A Plasmide (Abbildung 1) erreicht werden. Diese Plasmide enthalten in der Regel den menschlichen Adenovirus Typ 5-Genom mit E1 und E3 Gene gelöscht rekombinanten Adenoviren replikationsinkompetent 21 machen. HEK293A Zellen ergänzen Replikationsdefizienz, wie sie durch stabile Integration geschert Adenovirus 22 verewigt haben. Seit Adenovirusvektoren groß (~ 40 kb) und damit nicht gut für traditionelle Restriktionsenzym-vermittelte Klonierung geeignet sind, beschäftigten wir das Gateway-System. Das Gen von Interesse wird zunächst in einem kleineren Eingangsvektor, aus dem sie leicht in das adenovirale Zielvektor über Lambda Rekombination (LR) 23 übertragen werden können kloniert. Wir konstruierten die pCAGAdDu Vektordurch die Kombination der CAG-Promotor (Huhn Actin-Promotor und CMV-Enhancer) mit einer Expressionskassette, enthaltend LR flankieren die prokaryotische ccdB Selektionsmarker 24. Diese Expressionskassette ist mit einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES-Element), die Co-Expression der eukaryontischen Infektionsmarker enhanced green fluorescent protein (eGFP), die zu einer Sequenz, die die Rinder-Wachstumshormon-poly (A)-Signal fusioniert ist ermöglicht fusioniert. Wir haben die CAG cis-regulatorische Sequenzen, da die prototypischen CMV-Promotor wurde als hoch-Aktivierung ab und sind daher ungünstig für die Genexpression in naive T-Zellen. Hier bieten wir ein Protokoll für die effiziente in vitro Treg Differenzierung und eine Methode, um naive CD4 T-Zellen ohne Aktivierung (Abbildung 2) transduzieren. Das Verfahren ermöglicht ektopische Genexpression oder niederzuschlagen vorhergehenden CD4 T-Zell-Differenzierung bei der naiven Zustand. Es ermöglicht die Prüfung der Wirkung einer overexpressed Gen von Interesse in der frühen Signalwege beim erstmaligen TCR Stimulation bis T-Zell-Untergruppe Engagement. Unsere Validierungsexperimente auch die Grundlage, um ähnliche Adenovirus Anwendung bei der Differenzierung von anderen T-Zell-Untergruppen wie Th1, Th2, Th9, Th17, Th22 oder Tfh Zellen zu etablieren.

<table><tbody><tr><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzymmix</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R057S</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus-Transfektion</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A Zelllinie</td><td>Invitrogen</td><td>R705-07</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>14 cm Gewebekulturschale</td><td>Nunc</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta; 1)1Jdgr</td><td>Taconic Farms</td><td>Modell Nr. 4285</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T-Zell-Isolationskit II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN Biotech</td><td>1502-P110704</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>NEAA 100x</td><td>Lonza</td><td>BE13-114E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Puffer Lösung (1 m)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>MEM Essentielle Vitaminmischung (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-607C</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Maus T-Aktivator CD3/CD28 für die Zellexpansion und -aktivierung</td><td>Invitrogen</td><td>114-56D</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Human TGF-beta 1</td><td>R& D Systems</td><td>240B</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (18 x 106IE)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L-23105</td><td></td></tr><tr><td>Maus BD Fc BlockT</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus/Ratte Foxp3 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4427975</tr><tr><td>LightCycler 480 Sonden Master</td> Roche <td>Applied Biosystems</td><td>04902343001</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transkriptionskit</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr></tbody></table>

adenovirale transduktion von naive cd4 t-zellen zu treg differenzierung studieren

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind unerlässlich, um Immuntoleranz auf Selbstbestimmung sowie auf bestimmte fremde Antigene zu präsentieren. Tregs kann von naiven CD4 + T-Zellen in vitro mit TCR-und Co-Stimulation in Gegenwart von TGF-und IL-2 erzeugt werden. Dies birgt ein enormes Potenzial für zukünftige Therapien, aber die Moleküle und Signalwege, die Kontrolle Differenzierung sind weitgehend unbekannt. Primären T-Zellen können durch ektopische Expression manipuliert werden, aber üblichen Verfahren nicht die wichtigste naive Zustand der T-Zelle vor dem primären Antigen-Erkennung anzusprechen. Hier bieten wir ein Protokoll zu ektopische Gene in naiven CD4 T-Zellen exprimieren in vitro vor Induktion Treg Differenzierung. Es gilt Transduktion mit der Replikation-Adenovirus und erklärt, seine Erzeugung und Produktion. Das Adenovirus kann bis große Einsätze (bis zu 7 kb) und kann mit Promotoren ausgestattet werden, um hohe und vorübergehende Überbel erreichenression in T-Zellen. Es wandelt effektiv naive T-Zellen der Maus, wenn sie eine transgene Coxsackie Adenovirus-Rezeptor (CAR) auszudrücken. Wichtig ist, dass nach der Infektion die T-Zellen bleiben naive (CD44 niedrig, CD62L hoch) und Ruhe-(CD25 -, CD69 -) und kann aktiviert und in Tregs differenziert werden ähnlich nicht-infizierten Zellen. Somit ermöglicht dieses Verfahren Manipulation von CD4 T-Zell-Differenzierung von Anfang an. Es sorgt dafür, dass ektopische Genexpression ist bereits in Kraft, wenn sie früh signalisiert Ereignisse des ersten TCR Stimulation induziert zelluläre Veränderungen, die schließlich in Treg Differenzierung führen.

Virus Produktion Zur Erzeugung hoher Virustiter, ist der Zeitpunkt der Zellernte HEK293A in primären Virusproduktion oder Virusamplifikation entscheidend. Repräsentative Fluoreszenz-und Phasenkontrast-Aufnahmen mit visuellen Zeichen der Virus-Produktion sind in Abbildung 3 dargestellt. Die CPE wurden 10 Tage nach der Transfektion von Zellen mit einem HEK293A Kontrolle pCAGAdDu Vektor ohne Insert beobachtet. CPE sind durch das Auftreten von Bereichen mit vergrößerten und Round-u...

Adenovirale Gentransfer in naiven CD4-T-Zellen mit transgenen Expression des Coxsackie Adenovirus-Rezeptor ermöglicht die molekulare Analyse von regulatorischen T-Zell-Differenzierung<em&gt; In vitro</em&gt;.

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf zur Herstellung infektiöser Adenoviruspartikel, die verwendet werden, um ein Gen von Interesse in naive T-Zellen einzuschleusen, die anschließend bei atopischer Expression des Transgens in regulatorische T-Zellen oder Tregs differenzieren. Zunächst wird das Gen von Interesse in den adenoviralen Zielvektor kloniert. Anschließend wird der Vektor in die Adenovirus-Produktionszelllinie HC 293 A übertragen, woraufhin infektiöse Adenoviruspartikel erzeugt werden.Die resultierenden Viren werden verwendet, um naive T-Zellen von Mäusen mit einem Adenovirusrezeptor-Transgen nach der Infektion zu infizieren. Anschließend werden die Zellen ruhiggestellt, um die Expression des Gens von Interesse sicherzustellen. In den naiven T-Zellen werden die T-Zellen unter polarisierenden Bedingungen aktiviert, um die Differenzierung in Tregs zu induzieren.Anschließend werden die Zellen fixiert und für die Durchflusszytometrie angefärbt. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die Expression des Differenzierungsmarkers für regulatorische T-Zellen, Fox P drei, sowie des Infektionsmarkers GFP zeigen, die beide durch das überexprimierte Gen der Interesse beeinflusst sein können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der retroviralen Gen-Transduktion besteht darin, dass sie die Überexpression eines Gens der Interesse in naiven T-Zellen ermöglicht.Dies führt zu einer hohen Überexpression, die zum Zeitpunkt der T-Zell-Aktivierung vorliegt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regulatorischen T-Zellen zu beantworten. Zum Beispiel bezüglich der posttranskriptionellen Genregulation, die der Entstehung der T-Rex-Zell-Identität zugrunde liegt.Beginnen Sie dieses Protokoll damit, das Gen der Interesse in einen Entry-Vektor zu klonen. Das mittels PCR amplifizierte Gen der Interesse wird blunt-end-ligiert in den mit Topoisomerase gekoppelten Vektor P enter D topo. Anschließend wird das Gen der Interesse durch LR-Rekombination in den P kakadu-Destinationsvektor übertragen.Es enthält die adenoviralen Gene und eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), gefolgt vom offenen Leserahmen von GFP, um einen adenoviralen Expressionsvektor mit einem Infektionsmarker zu erzeugen. Anschließend werden 10 Mikrogramm des adenoviralen Expressionsvektors linearisiert. In einer PAC1-Restriktionsverdauung wird die DNA danach präzipitiert und in Wasser auf eine Konzentration von drei Mikrogramm pro 100 Mikroliter resuspendiert.Die Linearisierung setzt die viralen invertierten Wiederholungen (ITR) frei, die für die Replikation und Verpackung der viralen DNA in Viruspartikel erforderlich sind. Alle folgenden Schritte müssen unter den entsprechenden Biosicherheitsbedingungen für eine Adenovirusinfektion durchgeführt werden. Um den linearisierten Vektor für die Cotransfektion vorzubereiten, überführen Sie sechs µL Jet-PEI-Reagenz in 94 µL Natriumchlorid mit einer Konzentration von 50 µM und wirbeln Sie das Gemisch um.Kurz gesagt: Unter Wirbeln die gemischte Lösung zu 100 Mikroliter linearisiertem Adenovirus-Vektor hinzufügen. Dieses Transfektionsgemisch 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach HEC 2 9 3 A-Zellen, die auf Sechs-Loch-Platten bis zu 50 % Konfluenz herangewachsen sind, aus dem Inkubator entnehmen.Fügen Sie die Lösung tropfenweise in die Vertiefungen mit HEC 2 9 3 A-Zellen hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 10 % Kohlendioxid. Geben Sie alle drei Tage 0,5 Milliliter frisches Medium zu und verwenden Sie die GFP-Expression als Infektionsmarker. Bewerten Sie die Transfektions-Effizienz alle zwei bis drei Tage visuell mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop und prüfen Sie auf zytopathische Effekte, die sich durch Bereiche mit vergrößerten und abgerundeten Zellen äußern, die sich ablösen.Dies deutet auf eine effiziente Virusproduktion hin. Sobald ausgedehntere Zonen zytopathischer Effekte erscheinen, sind innerhalb von 24 bis 72 Stunden alle Zellen infiziert. Wenn alle Zellen Anzeichen zytopathischer Effekte zeigen, jedoch bevor eine allgemeine Ablösung der Zellen eintritt, werden die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren geerntet und zusammen mit dem Überstand in ein 15-Milliliter-Polystyrolrohr überführt.Um die Zellen anschließend aufzubrechen, gefrieren Sie die Suspensionen 15 bis 20 Minuten auf Trockeneis ein und tauen Sie sie anschließend schnell bei 37 Grad Celsius wieder auf. Wiederholen Sie diesen Einfrier- und Auftauzyklus insgesamt noch zweimal. Die aufgebrochene Zellensuspension wird nun als primäres Virus-Lysat bezeichnet.Halten Sie alle Viruslysate auf Eis. Wenn sie innerhalb eines Tages für die Langzeitlagerung verwendet werden, frieren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius ein. Beachten Sie, dass zusätzliche Gefrier-Tau-Zyklen die Virus-Titer um 30 bis 50 % verringern. Um das primäre Viruslysat zu amplifizieren, infizieren Sie HC 293A-Zellen, die auf 15 Gewebekulturplatten eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, mit der Hälfte des primären Viruslysats und inkubieren Sie mindestens 36 Stunden lang.36 Stunden nach der Infektion die Infektion mittels Fluoreszenzmikroskopie überprüfen, nahezu alle Zellen sollten infiziert sein. Sobald alle Zellen zytopathische Effekte, aber noch keine Ablösung zeigen, die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren unter effizienter Virusproduktion gewinnen. Dieser Zustand wird innerhalb von 48 Stunden nach der Infektion erreicht; anschließend die Zellen und das Überstandmedium in einen 50 Milliliter fassenden Polystyrolgefäß überführen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Volumen Medium. Ein Milliliter sollte eine Titerkonzentration im Bereich von 10 hoch 10 pro Milliliter ergeben.Führen Sie drei Gefrier-Tau-Zyklen wie zuvor durch, um die Zellen zu lysieren. Anschließend zentrifugieren Sie 20 Minuten bei 900 ×g und vier Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren überführen Sie vorsichtig das Überstand, der nun als konzentriertes Virus-Lysat bezeichnet wird, in ein Kryoröhrchen.Stellen Sie Aliquote für mehrere Infektionen her und lagern Sie diese bei minus 80 Grad Celsius. Bestimmen Sie abschließend die Virus-Titer mittels FACS-Analyse der Expression von Infektionsmarkern in 5 4 9-Zellen. Gemäß den Anweisungen im beigefügten Dokument wird dieser Teil des Protokolls unter Verwendung naiver ruhender CD-vier-T-Zellen durchgeführt, die aus D-1110-transgenen Car-delta-eins-transgenen Mäusen für kleine Versuchsreihen isoliert wurden.Pipettieren Sie eine geeignete Menge viraler Lyssate, um eine MOI von 50 in einem Vertiefung einer 96-Loch-Rundbodenplatte zu erreichen. Geben Sie bis zu viermal 10 hoch 5 T-Zellen in einem endgültigen Infektionsvolumen von 50 Mikrolitern T-Zellen hinzu.Mittleres Medium. Dieser Aufbau ermöglicht parallele experimentelle Ansätze. Inkubieren Sie die Zellen 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem 5 % CO₂-Inkubator.Nach der Inkubation die Zellen bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit 300 G abzentrifugieren, nach der Zentrifugation resuspendieren, in 200 Mikroliter PBS aufnehmen, erneut zentrifugieren und den Überstand abpipettieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikroliter T-Zell-Medium ohne stimulierende Antikörper und ohne IL-2 oder andere Zytokine. Anschließend die Zellen 40 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem 5 %igen Kohlendioxid-Inkubator ruhen lassen, um die Expression des Gens von Interesse vor der Aktivierung zu ermöglichen. Um die T-Zellen zu aktivieren und zu polarisieren, pipettieren Sie Anti-CD3- und Anti-CD28-gekoppelte Perlen in einen kleinen Reagenzbehälter. Die Anzahl der Perlen sollte der Anzahl der Zellen entsprechen, dann das zehnfache Volumen an PBS hinzufügen und zwei Minuten lang auf einen Magneten stellen.Als Nächstes den Überstand abnehmen und resuspendieren. Die Perlen in 200 Mikrolitern polarisierendem Medium suspendieren, die ruhenden Zellen bei 300 ×g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren; nach der Zentrifugation den Überstand abnehmen und die Zellen in 200 Mikrolitern polarisierendem Medium mit Antikörper-gebundenen Perlen resuspendieren. 72 Stunden bei 37 °C in einem 5 % CO₂-Inkubator inkubieren, ohne das Medium zu wechseln. Das Protokoll für die Färbung und Fixierung wird hier kurz beschrieben.Zunächst werden die Zellen mit PBS gewaschen und mit einer fixierbaren Lösung zur Totzellen-Färbung inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt werden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert, wodurch nach der Fixierung keine Vorsichtsmaßnahmen gemäß Adenovirus-Biosicherheitsstufen mehr erforderlich sind. Danach werden die Zellen erneut gewaschen und mit Methanol permeabilisiert. Nach einem weiteren Waschschritt werden die Zellen mit Anti-FCR-Drei inkubiert, um unspezifische Bindungen zu blockieren.Schließlich werden die Zellen mit anti-FCR-drei- und mit PE gekoppelten anti-FoxP3-Antikörpern inkubiert. Es besteht die Gefahr, dass während der Fixierungs- und Färbeprozedur aufgrund der mehrfachen Waschschritte viele Zellen verloren gehen; um Verluste zu vermeiden, sollte das Überstand nach der Zentrifugation sorgfältig abgenommen werden, ohne den Zellpellet mit der Pipettenspitze zu stören. Nach der Färbung der Zellen diese zweimal in PBS waschen und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysieren.Ein 96-Loch-Reader im Durchflusszytometer ermöglicht die Infektion, Differenzierung, Fixierung und Färbung von T-Zellen in derselben 96-Loch-Platte, was einen effizienten Arbeitsablauf für parallele Analysen mehrerer Bedingungen bietet. Die Analyse kann jedoch auch in Standard-FACS-Röhrchen durchgeführt werden, um den Einfluss der Adenovirusinfektion auf die T-Zell-Vitalität und die Treg-Differenzierung zu untersuchen. Aus DO11.10 transgenen TCRδ1-transgenen Mäusen gereinigte naive T-Zellen wurden mit Kontrolladenovirus bei verschiedenen MOIs infiziert und unter Treg-polarisierenden Bedingungen aktiviert. Fixierte und gefärbte Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie auf die Expression des Infektionsmarkers analysiert. Die GFP-Inkorporation von toten Zellen und für das Differenzierungsmarker-FoxP3, wie hier gezeigt. Eine Erhöhung des MOI von eins auf 50 führt zu einem höheren Prozentsatz infizierter Zellen.Während weder die Vitalität noch die Treg-Differenzierung beeinträchtigt ist, um zu bestimmen, ob eine Adenovirusinfektion den Aktivierungsstatus von T-Zellen beeinflusst. Infizierte und nicht-infizierte Zellen wurden mittels FACS auf die Expression von Aktivierungs- und Ruhe-Markern analysiert, wie hier dargestellt. Die Expression dieser Marker war in infizierten und nicht-infizierten Zellen nicht unterscheidbar, wenn die Zellen anschließend unter Treg-polarisierenden Bedingungen aktiviert wurden.Die Hochregulation von Aktivierungsmarkern und die Herunterregulation von Markern für naive T-Zellen waren in infizierten und nicht infizierten Zellen insgesamt sehr ähnlich. Diese Daten zeigen, dass eine Infektion von T-Zellen im naiven Zustand die anschließende Aktivierung der T-Zellen nicht beeinträchtigt. Um das Ausmaß der Überexpression zu testen, das mit dem beschriebenen adenoviralen Transduktionsprotokoll erreicht wurde, wurden naive T-Zellen mit einem Mikro-RNA-155-kodierenden oder einem Kontroll-Adenovirus bei einem MOI von 50 infiziert. Die Zellen wurden entweder 40 Stunden ruhiggestellt, 40 Stunden aktiviert oder 40 Stunden ruhiggestellt und anschließend 40 Stunden aktiviert. Es wurde cDNA hergestellt, und die Expression von Mikro-RNA-155 wurde relativ zu snoRNA202 bestimmt.Die Überexpression von Mikro-RNA 1 55 in naiven T-Zellen, die 40 Stunden lang ruhten, entspricht mittels quantitativer PCR den endogenen Mikro-RNA-1-55-Expressionsniveaus. Nach 40 Stunden T-Zell-Aktivierung induziert die Aktivierung dieser Zellen weiterhin eine aktivitätsabhängige Hochregulierung von Mikro-RNA 1 55.Dies zeigt das hohe Maß an Überexpression in naiven T-Zellen durch Adenovirus zusätzlich zur endogenen Aktivierung induzierten mikro-RNA-Expression. Sobald die Methode beherrscht ist, können Klonierung, Virengenerierung und T-Zellinfektion innerhalb von vier Wochen abgeschlossen werden. Das Virus kann nach der Generierung langfristig gelagert oder innerhalb von drei Tagen erneut amplifiziert werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Experimente sorgfältig mit einem leeren Vektor zu kontrollieren und zunächst den Effekt der Adenovirusinfektion selbst auf den untersuchten Prozess zu bestimmen. Beachten Sie, dass die Adenovirusinfektion und die Überexpression vorübergehend sind und nur etwa fünf bis sieben Tage andauern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen...

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen regulatorische, Speicher und naive T-Zellen aus einem einzelnen menschlichen Blutspender. Polarisierten Tregs können dann auf andere Teilmengen in einer Vielzahl von genetischen und funktionelle Anwendungen mit genetische Homogenität, einschließlich einer Unterdrückung Assay auch hier detailliert verglichen werden.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

Mit Effektor-Funktionen deutlich von anderen T-Zell-Untergruppen, Th17-Zellen wurden zentral bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Diese in vitro-Differenzierung Th17-Protokoll bietet die Möglichkeit, festzustellen, ob naiven CD4 +-T-Lymphozyten in Th17-Zellen zu differenzieren und ihre Rolle in der Autoimmun-und Wirtsantwort weiter zu prüfen.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Naive CD4+ T-Zellen polarisieren in verschiedene Untergruppen, abhängig von der Umgebung zum Zeitpunkt der Aktivierung.  Die Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen zu verschiedenen Effektor-Untergruppen kann in vitro durch die Zugabe von T-Zell-Rezeptor-Stimuli und spezifischen Zytokinsignalen erreicht werden.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse des Phänotyps von regulatorischen T (Treg)-Zellen, die von naiven und chronischen lymphozytären Choriomeningitis-Virus-infizierten Mäusen isoliert wurden. Darüber hinaus stellen wir einen Prozess zur Verfügung, um die suppressive Aktivität derT-reg-Zellen zu bewerten.

Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Viele experimentelle Systeme wurden die Mechanismen regulieren T-Zell-Entwicklung und Funktion in einer Immunantwort zu verstehen, verwendet. Hier ist ein genetischer Ansatz retrovirale Transduktion unter Verwendung beschrieben, die wirtschaftlich ist, Zeit effizient, und vor allem sehr informativ bei der Identifizierung von Regulationswege.

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Dieses Protokoll beschreibt die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen regulatorischen T - Zellen induziert (iTregs) von naiven CD4 + T - Zellen in vitro. Verschiedene Protokolle für FOXP3 Induktions ermöglichen die Untersuchung spezifischer iTreg Phänotypen mit jeweiligen Protokollen erhalten.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt die Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in vitro. Konkret kann in Kombination mit einem auf Multiparameter-Durchflusszytometrie basierenden Ansatz mit dieser Differenzierungsmethode eine Reinheit von 90 % pathogener Th17-Zellen aus naiven CD4+ T-Zellen gewonnen werden.

In vitro Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen in pathogene Th17-Zellen in der Maus

Die aktuelle Studie zeigt Protokolle zur Bewertung der frühen Schicksalsbindung von virusspezifischenT-FH-Zellen und zur Manipulation der Genexpression in diesen Zellen.

Zugang zur frühen Differenzierung der virusspezifischen follikulären Helferzelle CD4+ T-Zellen in akuten LCMV-infizierten Mäusen

Wir stellen ein Protokoll für die retrovirale Transduktion von Guide-RNA in primäre T-Zellen von Cas9-transgenen Mäusen vor, das eine effiziente Alternative für die Geneditierung bei der Untersuchung der Th17-Differenzierung darstellt.

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

Erfahren Sie die adenovirale Transduktion zur Genexpression in naiven CD4 T-Zellen vor der Treg-Differenzierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung früher molekularer Ereignisse ohne Beeinträchtigung der Zellviabilität.

Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren

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