Bau Microdrive Arrays für chronische Neural Recordings in Awake benimmt Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Mikroantrieb zu bauen, der für Gehirnaufzeichnungen bei Mäusen verwendet werden kann, während sie sich frei in einer Experimentierkammer bewegen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Bündel von vier Mikroelektroden zu einem Teig präpariert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Basis des Mikroantriebs zu konstruieren und die Antriebskomponenten zu montieren.

Als nächstes werden die Tetros an den Antrieb angehängt und mit goldenen Stiften verbunden. Der letzte Schritt besteht darin, die Spitze des Tetros zu vergolden, um ihre Impedanz zu senken und eine hohe Signal-Rausch-Aufnahme zu gewährleisten. Letztendlich werden chronische Micro-Drive-Arrays verwendet, um die neuronale Aktivität von Neuronenpopulationen sowie von einzelnen Neuronen bei wach verhaltenden Tieren aufzuzeichnen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine relativ kostengünstige und leichte Wellenlösung für chronische Gehirnaufzeichnungen bei Mäusen und anderen kleinen Säugetieren bietet. Diese Technologie kann Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften lösen, z. B. wie Neuronen Informationen während der Ausführung von Verhaltensaufgaben kodieren. Wir verwenden diese Technik regelmäßig, um von Neuronen aus dem dorsalen Hippocampus und Ulu aufzunehmen, aber wir haben sie auch verwendet, um tiefere Strukturen wie die Amygdala ins Visier zu nehmen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Konstruktion und der Montageteil schwer zu erlernen sind und Sie es auch mit sehr kleinen und empfindlichen Teilen zu tun haben, um mit der Herstellung von Tetro zu beginnen. Schneiden Sie für den Hippocampus 30 Zentimeter isolierten Platin-Iridium-Kerndraht mit einem Durchmesser von 12,5 Mikrometern ab und falten Sie den Draht zweimal, um vier parallele Drähte mit einer Länge von je 7,5 Zentimetern zu bilden. Befestigen Sie als Nächstes einen gummibeschichteten Clip in der Nähe der Unterseite des drapierten Drahtes und befestigen Sie ihn an dem motorisierten Tetro-Spinner, wobei Sie darauf achten, dass der Draht straff, aber nicht zu straff ist oder das Gewicht trägt, was dazu führt, dass er bricht.

Während des Schleudervorgangs ziehen Sie den Tero mit 80 Umdrehungen im Uhrzeigersinn auf, gefolgt von 20 Umdrehungen gegen den Uhrzeigersinn, um die Spannung zu lösen. Die endgültige Anzahl der Umdrehungen pro Drahtlänge sollte acht Umdrehungen pro Mikrometer betragen. Stellen Sie als Nächstes die Heißluftpistole auf 400 Grad Celsius ein und verwenden Sie sie, um die Drähte miteinander zu verschmelzen.

Lassen Sie die Heißluftpistole fünf Sekunden lang über die Drähte auf und ab laufen und halten Sie sie dabei immer etwa zwei Zentimeter vom Draht entfernt. Um die VG-Bondbeschichtung auf den Drähten vorsichtig zu schmelzen, schneiden Sie die Oberseite des Teros in vier separate Drähte und lösen Sie dann das untere Ende vom Clip. Legen Sie den fertigen Tero zur Aufbewahrung in eine staubfreie Aufbewahrungsbox, bis das Laufwerk fertiggestellt ist.

Konstruieren Sie zunächst die Basis für das Mikrolaufwerk, indem Sie ein 20 Millimeter großes, quadratisches Stück Plexiglasacryl mit einer Dicke von fünf Millimetern in eine Form schleifen, die es der Maus ermöglicht, sich nach der Implantation auf dem Kopf frei mit dem Laufwerk zu bewegen. Als nächstes löten Sie zwei 3,3 x 6,3 Millimeter große Messingführungen senkrecht aneinander. Die vertikale Messingführung hält die Antriebsschraube und die Elektroden, während das horizontale Stück in die Acrylbasis eingeklebt wird.

Beginnen Sie dann mit der Montage des Antriebs selbst, indem Sie eine Einfüllkopf-Brustschraube durch die Oberseite der Führung in einen Delrin-Kunststoffblock führen. Schrauben Sie eine Sechskantbrust erst dann auf die Schraube, wenn die Mutter fast die Unterseite der Führung berührt. Ziehen Sie es jedoch nicht vollständig fest.

Schmelzen Sie stattdessen eine kleine Menge Lot, um die Mutter und die Schraube zu verbinden. Achten Sie aber darauf, dass Sie nichts an die Anleitung löten. Durch Drehen der Schraube sollte der Delrinblock im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn vertikal entlang des Gewindes bewegt werden.

Sobald der Antrieb zusammengebaut ist, gehen Sie zurück zur Acrylbasis und schneiden Sie einen drei Millimeter breiten Schlitz aus, wo sich der Elektrodenantrieb befinden wird. Führen Sie dann die horizontale BH-Führung durch den Schlitz und befestigen Sie das Stück dann mit Sano ACRL-Kleber an der Basis. Platzieren Sie als Nächstes eine elektronische Schnittstellenplatine auf dem Sockel und markieren Sie die Positionen der beiden Schraubenlöcher mit einem 1,5-Millimeter-Bohrer, indem Sie vorsichtig Löcher in die Markierungen für Schrauben bohren, die die EIB oben auf dem Sockel halten.

Gewinde dann zwei Brustschrauben in die Löcher ein. Schneiden Sie mit einer Mikro-Präparierschere vier sieben Millimeter lange Stücke Polyamidschlauch ab. Richten Sie diese nebeneinander auf einem Stück gefaltetem Laborband aus und tragen Sie sano ACRL auf, um sie miteinander zu verbinden.

Lassen Sie genügend Zeit, damit die Verbindungsrohre vollständig getrocknet sind. Tupfen Sie anschließend vorsichtig eine kleine Menge Cyanacrylat auf die Delrin-Fläche. Lege dann die vier Fugenrohre auf den Kleber.

Lassen Sie auch hier genügend Zeit, bis der Kleber vollständig ausgehärtet ist, bevor Sie versuchen, das Laufwerk zu bewegen. Prüfen Sie, ob die Polyamidrohre sicher befestigt sind und dass sich die gesamte Baugruppe reibungslos bewegt, ohne die Führung zu berühren oder auf Widerstand zu stoßen. Bereiten Sie als Nächstes die Erdungsschraube vor und verbinden Sie das Erdungskabel mit dem EIB, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben.

Verbinden Sie Tetros und/oder einzelne Elektroden mit der EIB, indem Sie die Drähte zuerst durch das Polyamidrohr führen, so dass sie mindestens zwei Millimeter über das Rohrende hinausragen. Tragen Sie dann einen kleinen Tropfen Cyanacrylat auf, befestigen Sie den Draht an der Tube und verhindern Sie jede Bewegung des Drahtes. Verbinden Sie als Nächstes die losen Enden des Tero oder anderer Drähte mit einem Goldstift mit einem EIB-Kanalloch

Schneiden Sie zum Schluss überschüssigen Draht mit einer feinen Schere ab. Hier sind Beispiele für andere Antriebskonfigurationen, die so konstruiert werden können, dass sie auf verschiedene Gehirnregionen abzielen. Um umgekehrt zu beginnen, fahren Sie die Baugruppe.

Schneiden Sie den Polyamidschlauch auf 10 Millimeter ab und führen Sie ihn durch das kleinste Loch an einem Tetro-Träger, bis er 0,5 Millimeter über das Ende hinausragt. Setzen Sie dann das Polyamidrohr mit Epoxidharz auf und wiederholen Sie diese Schritte für die drei anderen Rohre und Träger. Nachdem das Epoxidharz vollständig ausgehärtet ist.

Führen Sie jedes Polyamidrohr durch eines der vier Löcher an der Versa-Antriebsbasis. Schiebe dann einen Insektenstift durch das äußere Loch. Dadurch wird der Tetro-Träger in der Linie gehalten und dient als Schiene, auf der der Träger reisen kann.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für die drei anderen Träger. Nehmen Sie dann eine Kappe und richten Sie sie mit den vier Insektenstiften so aus, dass die Kappe den Boden bedeckt und die Tero-Träger in der Kappe sitzen. Fädeln Sie eine ein Millimeter mal fünf Millimeter große Maschinenschraube durch das entsprechende Loch in der Kappe und in den tero Träger.

Wiederholen Sie dies für die anderen drei Schrauben. Drehen Sie alle Schrauben im Uhrzeigersinn, bis sich die Tetro-Träger in ihrer oberen Position befinden und die Polyamidrohre durch die Kappenöffnung sichtbar sind. Schneiden Sie den Schlauch mit einer feinen Mikropräparierschere knapp unterhalb des Bodens so ab, dass alle vier Polyamidschläuche die gleiche Länge haben.

Anschließend fädeln Sie den Tetros mit einem Präpariermikroskop vorsichtig durch die Polyamidröhrchen und fixieren sie mit einem kleinen Tropfen Anoat. Schneiden Sie dann die Tetros so ab, dass sie nur 2,0 Millimeter über die Rohre hinausragen. Bevor Sie die tero Drähte an die Goldhülsen anschließen.

Verbinden Sie zuerst die Erdungskabel mit der Kappe. Führen Sie als Nächstes alle losen Tero-Drähte durch die entsprechenden Buchsenlöcher an der Kappe und installieren Sie die Kappe, indem Sie die Löcher für die Insektenstifte ausrichten und die Passung an der Basis festdrücken. Schneiden Sie abschließend überschüssigen Draht ab, der oben aus der Kappe herausragt.

Drehen Sie zuerst die Mikroantriebsschrauben gegen den Uhrzeigersinn in ihre niedrigste Position. Montieren Sie dann den Mikroantrieb sicher an einer Klemme, die das Absenken der Elektrodenspitzen in die Vergoldungslösung ermöglicht. Füllen Sie einen Delrin-Turm mit CCO-Goldlösung und den anderen Turm mit destilliertem Wasser und senken Sie die Elektrodenspitzen in die Goldlösung ab.

Öffnen Sie anschließend das Nano Z-Programm und klicken Sie auf DC-Galvanik. Stellen Sie den Modus so ein, dass die Impedanzen angepasst werden: der Beschichtungsstrom auf minus 1,0 Mikroampere und der Zielwert auf 350 Kiloohm bei 1004 Hertz. Stellen Sie dann ein, dass es fünfmal in Fünf-Sekunden-Intervallen ausgeführt wird, mit einer Pause von zwei Sekunden zwischen jedem Lauf.

Sobald das Programm eingerichtet ist, klicken Sie auf Auto Plate, das Programm liest zuerst die Impedanz jedes Kanals. Wenden Sie dann den angegebenen Strom an diesen Kanal an, testen Sie die Impedanz erneut und wenden Sie bei Bedarf Strom an, bis die Zielimpedanz oder ein niedrigerer Wert erreicht ist. Wenn die Impedanz unter 100 Kiloohm fällt, kehren Sie die Strompolarität auf positive 1,0 Mikroampere um, um überschüssige Goldpartikel zu entfernen, und wiederholen Sie dann die Galvanisierung. Typische Endimpedanzwerte bei einem Bündel von vier 12,5-Mikrometer-Drähten liegen zwischen 150 und 325 Kiloohm.

Sobald alle Kanäle auf einen akzeptablen Impedanzpegel beschichtet sind, schließen Sie das Nano Z-Programm und trennen Sie das Gerät. Heben Sie dann die Elektroden aus der Beschichtungslösung und senken Sie die Spitzen in den Delrin-Turm mit destilliertem Wasser, um überschüssige Goldpartikel abzuspülen Repräsentative neuronale Aufzeichnungen mit dem Mikrolaufwerk zur Messung lokaler Feldpotentiale von der Maus. Hier sind dorsale Ulu zu sehen.

Die vier Kanäle, die in Teil A gezeigt werden, sind ein Beispiel für ein schlecht geerdetes Signal, das zu gesättigten Werten und extrem verrauschten Signalen führt. Die vier Kanäle, die in Teil B gezeigt werden, sind jedoch ein gutes Beispiel für ein gut geerdetes Signal mit deutlich sichtbaren Netzwerkschwingungen im Theta-Bereich von vier bis 12 Hertz. Links ist ein Beispiel für eine schlechte Tero-Aufnahme.

Da die vier Elektrodendrähte im Wesentlichen identische Spike-Wellenformen registriert haben, wurden für jeden Kanal des Teros über tausend einzelne Spike-Wellenformen übereinander gelegt. Dieses Muster war wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die Drähte während des Isolationsschmelzschritts der Tero-Herstellung miteinander verschmolzen wurden, wodurch das Drahtbündel effektiv als eine einzige Aufzeichnungselektrode fungierte. Auf der rechten Seite ist ein Beispiel für eine gute Tetro-Aufnahme, die überlagerte Spike-Wellenformen von einer vermeintlichen Einheit mit unterschiedlichen Amplituden über die vier Tede-Drähte zeigt.

Diese Art von Spike-Aufzeichnungsmuster ermöglicht eine verbesserte Einheitenunterscheidung beim nachfolgenden Offline-Clustering und -Separation. Nachdem Sie diesen Mikrotauchgang konstruiert haben, ist es wichtig, jeden Ihrer Elektrodenkanäle zu testen und sicherzustellen, dass er sich in einem angemessenen Impedanzbereich befindet, bevor Sie zur Implantation übergehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie sich wohl fühlen, wenn Sie Teros und Mikroelektrodenantriebe für die chronische Implantation in die Maus bauen.

Viel Glück beim Bau Ihrer Laufwerke und viel Spaß bei Ihren Experimenten.