Name: Eine modifizierte Heterotope Schweine Hind Gliedmaßen-Transplantation Modell für Translationale Vaskularisierte Composite-Allotransplantation (VCA) Forschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Erfahren Sie ein modifiziertes heterotopes Schweine-Hinterbein-Transplantationsmodell mit vaskularisiertem Knochenmark für VCA-Forschung. Diese Methode ermöglicht die direkte visuelle Überwachung des Transplantats und minimiert die Notwendigkeit chronischer Immunsuppression.

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Wir möchten uns bei den folgenden Personen für ihren Beitrag zu diesem Projekt zu bestätigen: Kakali Sarkar, PhD, Joani Christensen, BS, Kate Buretta, BS, Nance Yuan, BS, William Lehao, MD, Johanna Grahammer, Georg Furtmüller, MD, Erin Rada MD, Mohammed Al-Rakan MD, Karim Sarhane MD, Saami Khalifian, BS, Mao Qi, MD, und Angelo Leto Barone MD, VCA-Labor, Abteilung für Plastische und Rekonstruktive Chirurgie, Johns Hopkins University School of Medicine, Janis Taube, MD, Mark Fischer, MD, Abteilung für Dermatologie und Pathologie der Johns Hopkins University School of Medicine, Sue Eller, Minimal Invasive Chirurgie Training Center der Johns Hopkins University School of Medicine und Cheng-Hung Lin, Chang Gung MD Memorial Hospital, Linkou, Taiwan. Fördermittelgeber: Armed Forces Institute of Regenerative Medicine (DoD W81XWH-08-2 bis 0032)

In diesem Video-Veröffentlichung wurden alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit einer von der Johns Hopkins University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen Tier-Protokoll durchgeführt. 1. Die präoperative Planung <ol><li> Wir nutzen MHC definierten Inzucht MGH Miniaturschweinen (15-20 kg) in unserem translationale Studien für Gliedmaßen Allotransplantationen wobei eines männlichen Spenders bietet Gliedmaßen für zwei weibliche Empfänger (Abbildung 1). Vor der Operation, Spender-und Empfängertieren werden gründlichen klinischen Beurteilung durch einen Tierarzt. </li><li> Um Anästhesie und Ischämie zu minimieren, Spender und Empfänger Verfahren werden gleichzeitig auf drei OP-Tische in einem großen Tier gewidmet Operationssaal durchgeführt. Teamwork und Koordination zwischen OP-Teams sowie dem Veterinärpersonal sind entscheidend für den Gesamterfolg dieses Verfahrens. Der Operationsplan wird mit dem Tier Team in einer formellen Sitzung 1 diskutiert-2 Wochen vor dem Tag der Operation. </li><li> Eine getunnelte zentrale Venenkatheter (7 Fr Doppellumen-Katheter Hickman) in einer externen oder internen Halsschlagader jedes Empfängertieres vor der Transplantation für Immunsuppressivum Füllstandsüberwachung und die intravenöse Verabreichung von Immunsuppressiva und / oder immunmodulatorische Medikamente platziert. Diese Katheter werden unter direkter Sicht durch eine venöse Cut-down-Technik gesetzt und getunnelt posterior auf der dorsalen Hals und hoch zu verlassen mit Monofilament nicht resorbierbaren Nahtmaterial und Klebstoff Bandage Wrap um den Hals befestigt. </li><li> Halten Sie Tiere NPO (keine feste Nahrung, sondern dürfen Wasser ad lib) mindestens 12 Stunden vor der Operation. </li><li> Am Tag der Operation, ruhigere Tiere mit Ketamin 20 mg / kg Xylazin und 2 mg / kg IM. </li><li> Legen Sie ein entsprechend dimensioniertes Endotrachealtubus und verbinden Sie es mit dem Anästhesiegerät und Ventilator (gehalten auf Isofluran 0,5-3%) </li><li> Legen Sie eine intravenöse Katheter in einer Ohrrandvene und verwaltenbezogen 0,9% Kochsalzlösung während des gesamten Verfahrens. </li><li> Verwalten vorbeugende Analgesie (Buprenorphin 0,02 mg / kg IV). </li><li> Verwalten prophylaktische Antibiotika (Cefazolin 20-25 mg / kg IV) vor dem ersten Schnitt auf Spender und Empfänger Tieren. </li><li> Verwenden steriler Technik in allen Verfahren, die beiden Empfängern und Gebern. Dies schließt die Verwendung von Autoklaven behandelt oder sterilisiert Instrumente, Masken, Kopfhauben, sterile OP-Kittel und sterile Handschuhe. Rasieren Sie den Bereich des Einschnitts mit einer Schneidemaschine und desinfizieren mit Betadine Wechsel Lösung und Alkohol. </li></ol> Die intraoperative Monitoring: <ol><li> Nach der Einleitung und Intubation Aufrechterhaltung einer Narkose mit einem Inhalationsgemisch 0,5-3% Isofluran in Sauerstoff. </li><li> Überwachung der Herzfrequenz, Pulsoximetrie, EKG, endexspiratorischen CO 2 und rektale Temperatur kontinuierlich und notieren alle 15 min. </li><li> Verhindern Sie mit einer Hypothermie Bair Hugger warmen Umluftdecke. </li></ol><ol><li> Legen Sie das Spendertier in Rückenlage auf dem Operationstisch drapieren und steril. </li><li> Verwenden Sie in der Nähe von Infrarot-Laser-Angiographie Locher Gefäße anteromedialen Haut identifizieren. Inject Indocyaningrün bei ca. 0,06 mg / kg in 2-5 ml normaler Kochsalzlösung durch periphere Gefäßzugang verdünnt. Etwa 10 Sekunden später, führen 30 sec-2 min von Nah-Infrarot-Aufnahmen. Verwenden Sie das Video von den Aufnahmen zu Locher identifizieren. Basierend auf Perforatoren Markieren eines Bereichs der Haut (ca. 100 cm 2) für die Überwachung. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um eine Leistenhautschnitt in der Kontinuität mit Markierungen für die Haut Paddel (Abbildung 2) zu machen. </li><li> Identifizieren Oberschenkelgefäße und isolieren sie distal der Ebene der suprageniculate Filialen und proximal zu der Ebene des Leistenbandes. </li><li> Präparieren Sie die Haut-und Unterhautgewebe, während preserving die Fläche der Schaufelhaut. Nähen Sie die Ränder der Haut darunter liegenden Muskeln zu Kontraktion während Klappe Ernte zu vermeiden. </li><li> Führen Sie eine Osteotomie knapp über dem Tarsus mit einer Säbelsäge (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA). </li><li> Teilen Sie die Muskeln in der proximalen Oberschenkel mit Elektrokauter. </li><li> Teilen Sie die Oberschenkelknochen in der Mitte der Welle Verlassen einer osteomyocutanene Klappe auf einem Gefäßstiel. Die Klappe enthält die Haut Paddel, zugrunde liegende Oberschenkel-Muskulatur, Kniegelenk, distale Femur und Tibia, die intakt vaskularisierten Knochenmark mit seiner einzigartigen immunologischen Funktionen beinhaltet. </li><li> Verwenden Knochenwachs zur Blutstillung in den Markräumen zu erreichen. Glatte Knochenkanten mit ronjeurs in Vorbereitung für den Empfänger. </li><li> Halten Sie das Transplantat durchströmt auf seinem Gefäßstiel bis Oberschenkelgefäße des Empfängers werden hergestellt (Abbildung 3). </li><li> Sobald der Empfänger Präparation abgeschlossen ist, abzubinden der Spenderoberschenkelgefäße proximalen wie möglich einnd ziehen das Transplantat mit Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat (HTK, Custodiol, Newtown PA) vor der Transplantation. HINWEIS: Der Spender Schenkel auf der kontralateralen Seite des Empfängers, dh dem linken Schenkel Spender für die rechte Seite des Empfängers und dem rechten Schenkel Spender für die linke Seite des Empfängers) transplantiert. </li><li> Euthanize das Spenderschwein unmittelbar nach der Ernte der zweite Hinterbein unter Verwendung von 100 mg / kg IV Natriumpentobarbital. Der Tod wird durch die Veterinärpersonal pro etablierten Protokoll bestätigt. </li></ol> 4. Empfänger Verfahren (Hind Gliedmaßen Allotransplantation) <ol><li> Starten Sie den Empfänger Einleitung und Intubation sofort nach der ersten Geberschnitt die Vorbereitung des Empfängers Schiffe zu ermöglichen, während der Spender Gliedmaßen geerntet wird. Dadurch werden unnötige Wartezeiten und reduziert die Gesamtzeit für die Anästhesie Spender und Empfänger. </li><li> Positionieren Sie das Tier in Rückenlage mit einer Drehung von 30 ° auf der Bedienseite zu allow Exposition der dorsolateralen Seite. </li><li> Machen Sie einen Leistenschnitt und setzen die Oberschenkelgefäße, isolieren sie distal der Ebene der suprageniculate Filialen und proximal zu der Ebene des Leistenbandes. </li><li> Erstellen Sie eine subkutane Tasche von der Leiste bis dorsolateralen Bauchwand für das Transplantat Einsatz (Abbildung 4). </li><li> Ligation der Spenderbehälter und spülen Sie das Transplantat mit HTK. </li><li> Führen Sie das Transplantat Einsatz invertiert: Haben die Haut Paddel gegen dorsolateralen zu einfach Immunmonitoring in einer stehenden Position und die abgeschnittenen Enden der Oberschenkelgefäße gegen kaudal, um End-to-End-Gefäßanastomosen ohne Spannung auf den Schiffen erlauben (ermöglichen Abbildung 5). </li><li> Wenn vorhanden, verwenden Sie einen Gefäßkopplungsvorrichtung (Synovis, St. Paul MN) für venöse Anastomosen (Größe 2,5 bis 3,5 ist geeignet für 10-20 kg Tiere). Diese Ischämie Zeit signifikant reduziert im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren. </li><li> Führen arteriellen anastomoses mit einem herkömmlichen Nahttechnik mit 9-0 Faden (Synovis, St. Paul MN) </li><li> Nach Gefäßdurchgängigkeit bestätigt ist, sichern das Transplantat an Ort und Stelle mit 3-0 PDS-Nähte (Abbildung 5). Die Muskeln des Transplantats an der Bauchmuskulatur vernäht. Die Pfropf Muskeln nicht auf die Empfänger Oberschenkelmuskulatur vernäht, da es schädlich sein, wenn das Tier bewegt sich um den Käfig. Werden </li><li> Exteriorisieren die Haut Paddel auf der dorsolateralen Seite für die Immunüberwachung (Abbildung 6) und nähen es mit der benachbarten Haut mit 3-0 Vicryl subkutanen Nähten und 4-0 Monofilament resorbierbaren Hautnähte unterbrochen. </li><li> Schließen Sie die Haut in der Leistengegend Schichten mit 3-0 Vicryl subkutanen Nähten und 4-0 Monofilament resorbierbaren Hautnähte unterbrochen. </li><li> Legen Sie ein 50-100 mcg / h Fentanyl-Pflaster für die postoperative Analgesie. </li><li> Nach der Hintergliedmaße Allograft Transplantation, bringen Sie das Tier in das Stift einmal wach und Atem bequem auf seine eigenen.</li>
</ol>

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<li>Ustüner, E. T., Majzob, R. K., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swine+composite+tissue+allotransplant+model+for+preclinical+hand+transplant+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies.</a> Microsurgery. 20, 400-406 (2000).</li>
<li>Ustüner, E. T., Zdichavsky, M., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+composite+tissue+allograft+survival+in+a+porcine+model+with+cyclosporine%2Fmycophenolate+mofetil+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term composite tissue allograft survival in a porcine model with cyclosporine/mycophenolate mofetil therapy.</a> Transplantation. 661, 581-587 (1998).</li>
<li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation%3A+a+translational+trial+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Historisch gesehen, enthalten die heterotope Transplantation Hinterbein Protokoll Exteriorisation einer Haut Paddel auf der ventralen Bauchwand und die Behälter wurden in einem Ende-an-Seite-Weise anastomosiert (Hettiarachty 2004). Jedoch im modifizierten Verfahren eine invertierte Klappe Insetting-und End-zu-End-Anastomosen bringen die Haut Paddel seitlich weiter und erleichtert die Immunüberwachung in einer stehenden Position des Tieres damit. Die Identifizierung des Nervus Arterie und die Zonen maximaler Perfusion mi...

Vaskularisierte Composite-Allotransplantation (VCA), wie zB Hand-und Gesichtstransplantationen sind jetzt eine klinische Realität mit zahlreichen Hand-und Gesichtstransplantationen weltweit 12 durchgeführt. Trotz der Tatsache, dass die frühen und Zwischenergebnisse günstige und sehr ermutigend 2 sind, die Anforderung von chronischen Immunsuppression multi weiterhin seine weitverbreitete klinische Anwendung zu begrenzen. Die Fortschritte in Mausmodellen der VCA einschließlich Super-und mikrochirurgischen Anastomosen nonsuture Manschette Techniken 13, 3 haben den Weg zu einem besseren Verständnis der Alloimmune Antworten in VCA gepflastert. Myriaden von immunmodulatorischen Protokollen für klinische Anwendungen auf der Grundlage unserer besseren Verständnis der Immunmechanismen in VCA vorgeschlagen worden, aber sie müssen in einem Großtiermodell, die vernünftigerweise voraus ihrer Leistung in den Menschen 7 wäre validiert. Basierend auf physiologische und immunologische Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Schwein Organsysteme <sup&gt; 6, kann die Schweine VCA-Modelle betrachtet werden zuverlässige und kostengünstige Alternativen zu Eckzahn 9 und nichtmenschlichen Primatenmodelle ein. Dieser Artikel bietet einen detaillierten Überblick über die Methodik in unserem MHC definierten Schweine heterotope Hinterbein Transplantationsmodell, das als Grundlage für unsere aktuellen und zukünftigen immunmodulatorische Strategien zur Induktion von Immuntoleranz VCA und damit Verbreiterung der klinische Anwendung dient. Wir nutzen die gut charakterisierten Inzucht Schweine, die speziell für den Einsatz in der Transplantations-Forschung 11 gezüchtet, um Homozygotie an der Schweine Leukozyten-Antigen Locus. Wir erheben eine gefäß osteomyocutanene Klappe basierend auf Oberschenkelgefäße. Die Klappe enthält intakt vaskularisierten Knochenmark im distalen Femur und der proximalen Tibia. Anteromedialen Oberschenkelhaut wird auch in dem Transplantat enthalten und ist mit dem dorsolateralen Aspekt der Empfängertier für die Immunüberwachung des am meisten immunogene Komponente o exteriorisiertf der VCA. Dorsolateralen Positionierung erleichtert die klinische Untersuchung im Stehen und Sitzen Positionen und hält die Haut Allograft auch relativ sauber. Ustener et al. Eingeführt einer der ersten Großtiermodelle in Translations VCA durch die Transplantation von Radial forelimb osteomyocutanene Klappen in outbred Bauernhof Schweine 15. Die Gruppe verwendet dieses Modell, um das erste Mal, dass die akute Abstoßung der VCA, die die hoch immunogen Hautkomponente enthalten könnte verzögert und mit einem klinisch relevanten Strategie behandelt werden, ohne nennensdrogenspezifische Komplikationen und Nebenwirkungen zu zeigen. Die in dieser Studie positive Ergebnisse später baute einen grundlegenden Schritt in der Entwicklung medikamentöser Menschen rekonstruktive Transplantation. Obwohl diese frühen Schwein VCA Modelle waren für die Entwicklung von Protokollen zur Ablehnung von Haut, Muskeln, Knochen, Nerven und Gefäße sie spezialisierte Strukturen wie Gelenk cartilag fehlte verhindern gut geeignete und synovialen Membranen der Gelenke. Spätere Bemühungen wurden mit der medialen Ziffer des Tieres, das in voller Länge Guss Platzierung notwendig, um zu verhindern Transplantat dislodgement 14 fokussiert. Obwohl geeignet, Ablehnung aller Hauptkomponenten von Gliedmaßen-Transplantation zu untersuchen, eine der wichtigsten Einschränkungen dieses Modell war nach der Transplantation ambulanten Schwierigkeiten aufgrund Platzierung gegossen. So heterotope Schweineschenkel Allotransplantationen Modelle, bestehend aus dem Schienbein, Wadenbein, Kniegelenk, distale Femur umgebenden Muskeln und Haut ein Paddel, wurden geschaffen, um vor allem immunologische Aspekte der VCA studieren, während es dem Tier, sich frei mit minimalen postoperativ ambulate morbidit 8 . Die Entwicklung von gut charakterisierten SLA definierten Inzucht-Schweine durch die Pionierarbeit von Dr. David H. Sachs führte zu einer neuen Ära der translationalen Forschung VCA. Mit Hilfe eines heterotopen Hinterbein Transplantationsmodell in einer Moll-Antigen-Mismatch-Einstellung, Mathes et al. zeigten 10 unbestimmte Überleben des Muskel-Skelett-Komponenten mit einer kurzen Verlauf der Cyclosporin-Behandlung. Die Hautkomponente Überleben war jedoch nur im Vergleich zu Kontrollen ohne Behandlung verlängert. Der Verlust der Hautkomponente des Transplantats auf einem isolierten und hoch kräftigem Immunantwort, insbesondere der Epidermis zurückzuführen. Ebenso voll mit nicht übereinstimm Schweine mit T-Zell-Depletion, einem kurzen Kurs von Cyclosporin und Zytokin mobilisiert Spender periphere mononukleare Blutzellen induzierte Toleranz nur auf Muskel-Skelett-Komponenten und die Hautkomponente noch abgelehnt 5. Dieses Phänomen, genannt &quot;Split-Toleranz&quot;, brachte einen Paradigmenwechsel in der Forschung VCA mit einem größeren Fokus auf die hoch immunogen Haut-Komponente, die ein integraler Bestandteil der Mehrheit der rekonstruktiven Transplantationen bis heute durchgeführt wird. In diesem modifizierten Modell verwenden wir Ende-zu-Ende-Anastomose von ligating der Empfänger Femoralarterie und Drehen kranial (Abbildung 1). Dies reduziert nicht nur Ischämie Zeit, indem sie die Verwendung eines herkömmlichen Kupplungsvorrichtung, sondern vermindert auch die Wahrscheinlichkeit von Anastomosen Versagen. Es wurden keine ischämische Ereignisse nach Ligation der A. femoralis in unserem Empfänger darauf hinweist, dass Sicherheiten Verkehr war ausreichend, um Durchblutung auf die native Bein stellen beobachtet. Zusätzlich wird in diesem modifizierten Verfahren wird der ausgelagerten Hautkomponente auf der Basis der zugrundeliegenden Perforator Gefäße mobilisiert und seitlich (Fig. 1) im Gegensatz zu einer ventralen Leistenposition in dem traditionellen Modell 10 positioniert. Dies ermöglicht eine einfache Visualisierung des Transplantats für die Immunüberwachung im Stehen oder Sitzen des Tieres. Daher ist eine zuverlässige und reproduzierbare Großtiermodell wichtig, Toleranzinduktion Strategien gegen die Hautkomponente von VCA zu untersuchen und zu entwickeln, um neue noninvasive Immunüberwachungsstrategien für eine bessere Vorhersage des Transplantatüberleben.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>HTK</td><td>Custodial</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Electric Pen</td><td>Drive Synthes, Westchester PA</td><td>05.001.011</td><td>Säbelsäge</td></tr><tr><td>Gefäßkopplungsgerät</td><td>Synovis, Newtown PA</td><td>21003B</td><td></td></tr></tbody></table>

eine modifizierte heterotope schweine hind gliedmaßen-transplantation modell für translationale vaskularisierte composite-allotransplantation (vca) forschung

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

Vaskularisierte Composite-Allotransplantation (VCA), wie zB Hand-und Gesichtstransplantationen stellen eine praktikable Behandlungsoption für komplexe Muskel-Skelett-Trauma und Gewebeverlust verheerend. Trotz günstiger und sehr ermutigend frühen und mittleren funktionellen Ergebnisse, die Ablehnung des hoch immunogen Hautkomponente eines VCA und mögliche nachteilige Auswirkungen der chronischen Multi-Drug-Immunsuppression weiterhin eine breite klinische Anwendung der VCA zu behindern. Daher Forschung in diesem Roman Feld muss auf translationale Studien, einzigartige immunologische Merkmale der VCA zu konzentrieren und neue immunmodulatorische Strategien zur Immunmodulation und Toleranzinduktion folgenden VCA, ohne die Notwendigkeit für langfristige Immunsuppression zu entwickeln. Dieser Artikel beschreibt eine zuverlässige und reproduzierbare translationale Großtiermodell der VCA, die aus einem osteomyocutanene Klappe in einer MHC-definiert Schweine heterotope Hinterbein Allotransplantationen besteht. BrieFly, ist ein gut vaskularisiert Haut Paddel in anteromedialen Oberschenkelbereich mit Nah-Infrarot-Laser-Angiographie identifiziert. Die zugrunde liegenden Muskeln, Kniegelenk, distale Femur und Tibia sind auf einer Oberschenkelgefäßstiel geerntet. Dies kann als Allograft sowohl ein VCA und eine gefäßKnochenMarkTransplantation mit seiner einzigartigen Immun privilegierte Funktionen werden. Das Transplantat wird mit einer subkutanen Bauchtasche im Empfängertier mit einer Hautkomponente zu der dorsolateralen Region für die Immunüberwachung exteriorisiert transplantiert. Drei Operationsteams arbeiten gleichzeitig an einem gut koordinierten Art und Weise auf die Anästhesie und Ischämie Zeiten zu reduzieren und dadurch die Verbesserung der Effizienz dieses Modells und die Verringerung der potenzielle Störfaktoren in Versuchsprotokollen. Dieses Modell dient als Grundlage für zukünftige therapeutische Strategien zur Reduzierung und möglicherweise die Notwendigkeit für chronische Multi-Drug-Immunsuppression bei VCA soll.

Vierundzwanzig SLA definierten Schweinehinterbein heterotope Transplantationen wurden unter Verwendung unserer modifizierte Technik mit einer mittleren Ischämiezeit von 78 min (Bereich: 62-94 min). Graft Einsatz und dorsolateralen Haut Paddel Positionierung wurden ohne Schwierigkeiten in allen Tieren erreicht. Nah-Infrarot-Laser-Angiographie zeigte eine hervorragende Transplantatdurchblutung in allen Empfängern. Die ersten zwölf Anastomosen wurden mit herkömmlichen Nahttechniken, während die letzten zwölf Anastomosen wu...

Vaskularisierte Verbund Allotransplantations (VCA) haben eine klinische Realität werden. Allerdings ist eine breite klinische Anwendung des VCA durch chronische Multi-Drug-Immunsuppression begrenzt. Die Autoren stellen eine zuverlässige und reproduzierbare Großtiermodell, um neue immunmodulatorische Strategien, die Minimierung oder Beseitigung potenziell die Notwendigkeit der Immunsuppression in VCA übersetzen kann.

Eine modifizierte Heterotope Schweine Hind Gliedmaßen-Transplantation Modell für Translationale Vaskularisierte Composite-Allotransplantation (VCA) Forschung

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein zuverlässiges und reproduzierbares translational großes Tiermodell für die Transplantation von Hintergliedmaßen mit intaktem, vaskularisiertem Knochenmark zu etablieren, um die immunologischen Ergebnisse klinisch relevanter immunmodulatorischer Protokolle zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein osteomyokutanes Transplantat gewonnen wird, um die einzigartigen immunologischen Eigenschaften der Hautkomponente der vaskularisierten komplexen Allo-Transplantation oder VCA zusammen mit dem vaskularisierten Knochenmark zu untersuchen. Anschließend wird das Allograft in eine subkutane Tasche der Bauchwand transplantiert, wodurch ein technisch machbares Modell entsteht, das die Fortbewegung des Empfängers nicht beeinträchtigt.Dann wird die Hautkomponente an die dorsolaterale Bauchwand extrahiert, um das Transplantat durch direkte visuelle Inspektion des stehenden Tieres überwachen zu können. Die Ergebnisse zeigen, dass dies ein zuverlässiges und reproduzierbares Modell zur Untersuchung klinisch relevanter immunmodulatorischer Protokolle unter Verwendung zellbasierter Therapien und biologischer Wirkstoffe darstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Modellen wie den Modellen der Vaskularisierten Zellverbundtransplantate (VCA) bei Hunden und nichtmenschlichen Primaten liegt in den geringeren Kosten, dem niedrigsten Risiko einer zoonotischen Infektion sowie der Verfügbarkeit von SLA-definierten Spender- und Empfängerstämmen.Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet der rekonstruktiven Transplantation klären, insbesondere hinsichtlich der einzigartigen immunprivilegierten Eigenschaft des vaskularisierten Knochenmarks, und der Weg für die Entwicklung eines klinisch relevanten immunmodulatorischen Protokolls, das die Immunosuppression minimiert, wird geebnet. Die Idee für dieses Transplantatmodell, mit dem wir die Immunogenität verschiedener Komponenten eines allogenen Gliedmaßens testeten und vor fast zwei Jahrzehnten das Phänomen der geteilten Toleranz nachwiesen, entwickelten wir zunächst selbst. Vor der Entnahme des allogenen Gliedmaßens wird das Spendschwein sediert und an einen Beatmungsapparat angeschlossen, um während des gesamten Eingriffs Isofluran, Fluor und Sauerstoff zuzuführen.Nachdem der Operationsbereich rasiert, gewaschen und desinfiziert wurde, bringen Sie das SpenderTier in Rückenlage auf dem Operationstisch in Position und bedecken es mit einem sterilen Tuch. Anschließend identifizieren Sie mithilfe der Nahinfrarot-Laser-Angiographie Perforatoren zur intermediären Haut. Danach injizieren Sie Indocyaningrün in Kochsalzlösung über einen peripheren vaskulären Zugang.Ungefähr 10 Sekunden später 30 Sekunden bis zwei Minuten lang Nahinfrarotaufnahmen durchführen. Anschließend, basierend auf den identifizierten Perforanten, einen Bereich der Haut für eine Hautlappenplombe markieren, der später zur Immunüberwachung verwendet wird. Nach Überprüfung der Narkosetiefe des Tieres anhand des Augenlid- und Zehenquetschreflexes mit einem Skalpell einen Hautschnitt in der Leiste entlang der Markierungen für einen Hautlappen durchführen und die Haut sowie das Unterhautgewebe dissezieren, wobei der Hautbereich erhalten bleibt.Nähen Sie die Hautränder an die darunterliegenden Muskeln, um eine Kontraktion während der Lappenentnahme zu vermeiden. Identifizieren Sie anschließend die Gefäße der A. femoralis und isolieren Sie diese proximal bis zur Höhe des Ligamentum inguinale. Ligieren Sie die Seitenäste distal bis zur Höhe des Hautpaddels, um eine optimale Länge von vier Zentimetern zu erhalten, und führen Sie mit einer Stichsäge einen Osteotomieschnitt knapp oberhalb des Sprunggelenks durch.Verwenden Sie anschließend die Elektrokauterisierung, um die Muskeln im proximalen Oberschenkel zu durchtrennen. Durchtrennen Sie den Femur des Spenders auf Höhe des mittleren Schaftabschnitts, wobei ein osteomyokutanes Lappen an einem vaskulären Hautlappen verbleibt. Der Lappen enthält den Hautlappen, die darunterliegenden Oberschenkelmuskeln, das distale Femur und das Kniegelenk, die obere Tibia und somit ein intaktes, vaskularisiertes Knochenmark.Mit seinen einzigartigen immunologischen Eigenschaften muss das Spendertransplantat bis zur Bereitschaft der femoralen Gefäße des Empfängers über seinen vaskulären Stiel perfundiert bleiben. Unmittelbar nach Initiierung des Spendereingriffs muss das Empfängerschwein an einen Beatmungsapparat angeschlossen und die Anästhesie mit Isofluran wie am Spenderschwein demonstriert eingeleitet werden. Ein Katheter zur Gabe von Kochsalzlösung wird eingelegt, und vorbeugend Buprenorphin sowie prophylaktische Antibiotika werden verabreicht.Bringen Sie das Tier in Rückenlage mit guter Exposition der dorsolateralen Fläche und überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie. Anschließend führen Sie einen Leisten-Schnitt durch, um die femoralen Gefäße freizulegen, und isolieren diese drei bis vier Zentimeter distal und proximal zur Leistenbandebene. Erstellen Sie dann eine subkutane Tasche von der Leiste bis zur dorsolateralen Bauchwand für die Einlage des Transplantats.Jetzt die Gefäße des Spenders ligieren und das Transplantatgewebe mit Histidin-, Tryptophan-Ketoglutarat- oder HTK-Lösung spülen. Falls dies die endgültige Entnahme vom Spender ist, das Tier unverzüglich gemäß dem Tierschutzprotokoll euthanasieren, um die Transplantatinsertion durchzuführen. Positionieren Sie es umgekehrt, sodass das femorale Schnittende nach unten weist, um eine Anastomose ohne Zugbelastung der Gefäße unter Verwendung eines vaskulären Kupplungsgeräts zu ermöglichen.Falls verfügbar, stellen Sie eine venöse Anastomose her. Das Gerät wird die Ischämiezeit erheblich verkürzen. Anschließend führen Sie unter Verwendung von 8-0-Nähten und einer konventionellen Nahttechnik eine arterielle Anastomose durch, nachdem die Gefäßpatenz bestätigt wurde.Verwenden Sie drei OPDS-Nähte, um das Transplantat zu fixieren, indem Sie die Transplantatmuskulatur an die Bauchwandmuskulatur des Empfängers annähen, um eine Immunüberwachung zu ermöglichen. Führen Sie die Hautlappen auf der dorsolateralen Seite nach außen. Nähen Sie anschließend die tiefen Gewebeschichten mit drei Vicryl-Nähten und befestigen Sie das Gewebe mit vier monofilen, resorbierbaren Einzelhautnähten an der Haut des Empfängers.Schließen Sie die Leistenhaut abschließend lagengerecht mit drei Vicryl-Unterhautnähten (Größe 4-0) und anschließend mit vier Einzelknopfnähten aus monofiler, resorbierbarer Nahtmaterial (Größe 4-0) an der Hautoberfläche. Zur postoperativen Schmerztherapie bringen Sie ein Fentanylpflaster mit 50 Mikrogramm pro Stunde am Tier an, sobald es wach ist und selbstständig und komfortabel atmet.Bringen Sie das Tier in seinen Stall zurück und lassen Sie es nach Belieben fressen und trinken. Beobachten Sie das Tier in den ersten 24 Stunden alle vier Stunden auf Anzeichen von Schmerzen oder Belastung und danach zweimal täglich. Es wurden 19 MHC-definierte heterotopische Hintergliedmaßen-Transplantationen bei Schweinen mit unserer modifizierten Technik durchgeführt.Diese Transplantationen wurden durchgeführt, um therapeutische Strategien zur Induktion von Immuntoleranz in der VCA zu entwickeln. Dieses Modell wurde erfolgreich bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien zur Immuntoleranz in der VCA mit langfristiger Abstoßungsfreigabe genutzt; Kontrollgruppen zeigten eine beschleunigte Transplantatabstoßung nach Beendigung der konventionellen Immunsuppression. Sobald die Technik beherrscht ist, kann der Eingriff in ein bis zwei Stunden pro Spenderextremität und zwei bis drei Stunden pro Empfängerprozedur durchgeführt werden, sofern er korrekt ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die kontralaterale Extremität des Spenders in die Bauchwandtasche des Empfängers transplantiert wird, wobei die rechte Extremität in die linke Leiste und umgekehrt transplantiert wird, nachdem sie entwickelt wurde.Diese Technik ebnete den Weg dafür, dass Forscher auf dem Gebiet der rekonstruktiven Transplantation neuartige immunmodulatorische Protokolle erforschen können, die den Bedarf an lebenslanger Immunosuppression minimieren und somit das Risiko-Nutzen-Verhältnis dieser innovativen Therapieform verbessern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis für die technischen Aspekte einer heterotopen Hintergliedmaßen-Transplantation mit intaktem, vaskularisiertem Knochenmark besitzen. Dieses zuverlässige und reproduzierbare Modell der Gliedmaßentransplantation wird den Weg für die Entwicklung neuartiger immunmodulatorischer Protokolle ebnen, die die Notwendigkeit einer chronischen Mehrfachmedikation mit Immunosuppressiva minimieren und potenziell ganz überflüssig machen.

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Eine modifizierte Heterotope Schweine Hind Gliedmaßen-Transplantation Modell für Translationale Vaskularisierte Composite-Allotransplantation (VCA) Forschung (Video) | JoVE Journal

Eine modifizierte Heterotope Schweine Hind Gliedmaßen-Transplantation Modell für Translationale Vaskularisierte Composite-Allotransplantation (VCA) Forschung

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