Name: Protein WISDOM: A Workbench für In silico De novo Aufbau von Biomolekülen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Erfahren Sie Protein WISDOM für rechnergestütztes De-novo-Proteindesign. Dieses Online-Tool ermöglicht Forschern die Entwicklung monomerer Proteine mit verbesserter Stabilität und Komplexen mit erhöhter Bindungsaffinität.

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CAF dankt der Unterstützung durch NSF, NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736) und der US-Umweltschutzbehörde EPA (R 832721-010). Ein Teil dieser Forschung wurde mit staatlicher Unterstützung durch das Verteidigungsministerium (Air Force Office of Scientific Research) ermöglicht. JS bedankt sich bei der Unterstützung durch die NIH (P50GM071508-06). Das MLBP bedankt sich dankbar für die Unterstützung durch ein National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. GAK bedankt sich für die Unterstützung durch ein Graduate Research Fellowship der National Science Foundation unter der Fördernummer DGE-1148900.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das De-novo-Proteindesign-Framework besteht aus zwei Phasen, einer Sequenzauswahlphase und einer Validierungsphase. Das Framework ist robust genug, um starre und flexible Designvorlagen zu verarbeiten, und kann auf das Design einzelner Proteine oder komplexer Proteine angewendet werden. Das Framework wurde erfolgreich auf zahlreiche Proteinsysteme mit Anwendungen auf Dutzende von Krankheiten angewendet. Eine Reihe der Designs wurde experimentell validiert und liefert die wirksamsten Inhibitoren oder Agonisten ei...

De-novo-Proteindesign ist die Identifizierung von Proteinsequenzen, die eine gewünschte Tertiärstruktur mit verbesserten Eigenschaften oder Funktionen ergeben. Da die native Faltung eines Proteins die Konformation ist, die am Minimum der freien Energie liegt, sucht das De-novo-Proteindesign nach Sequenzen, die ein Minimum an freier Energie in der Zielfaltung aufweisen. Dieses Problem wurde erstmals von Drexler1 und Pabo2 beschrieben und als "inverses Faltungsproblem" bezeichnet. Im Gegensatz zum Proteinfaltungsproblem, bei dem eine Sequenz nur eine gefaltete Strukturlösung ergeben kann, weist das De-novo-Proteindesignproblem jedoch eine Entartung auf. Viele verschiedene Aminosäuresequenzen können die gleiche Tertiärstruktur und -funktion ergeben.
Während das Proteindesign traditionell experimentell durch rationales Design und gerichtete Evolution durchgeführt wurde, wurden in jüngerer Zeit computergestützte Methoden eingesetzt, um den begrenzten Suchraum experimenteller Methoden zu überwinden. Es wurde eine Vielzahl von Berechnungsmethoden verwendet, darunter deterministische Methoden, stochastische Methoden und probabilistische Methoden. 3,4 Frühe Berechnungsmethoden verwendeten Fixed-Backbone-Vorlagen, um das Problem leichter zu lösen. 5-7 Mit dem Aufkommen schnellerer Prozessoren, Hochleistungsrechnen und effizienterer Algorithmen wurde die Backbone-Flexibilität durch die Verwendung eines Ensembles von Fixed-Backbone-Templates8-14 oder durch die Einbeziehung echter Backbone-Flexibilität durch Ausdrücken der Template in Form von Bereichen von Atom-zu-Atom-Abständen und Flächenwinkeln integriert. 15,16 kg
Dieser Artikel beschreibt detailliert Protein WISDOM, ein Online-Tool, das der akademischen Gemeinschaft zur Verfügung gestellt wurde, um unser computergestütztes de novo Proteindesign-Framework zu nutzen. Dieser Rahmen wurde auf das Design zahlreicher Proteine für therapeutische Anwendungen angewendet, die auf Krankheiten wie HIV, Krebs, Komplementkrankheiten und andere Autoimmunerkrankungen abzielen. Viele der vorhergesagten Peptide wurden experimentell validiert, was die Leistungsfähigkeit der Methode demonstriert. Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung der verschiedenen Proteine, die entworfen wurden, einschließlich der Größe des Proteins oder Peptids, der Anzahl der Vorhersagen und der experimentellen Validierung.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein-Design</td>
			<td>Proteinlänge</td>
			<td># der rechnerischen Vorhersagen</td>
			<td># der experimentellen Validierungen</td>
			<td>Referenz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vollständiges Sequenzdesign von humanem Beta-Defensin-2</td>
			<td>Nr. 41</td>
			<td>340</td>
			<td> </td>
			<td>(17)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compstatin-Inhibitoren von humanem C3</td>
			<td>13</td>
			<td>28</td>
			<td>3/3</td>
			<td>(18, 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compstatin-Analoga, die an C3c bei Ratten binden</td>
			<td>13</td>
			<td>5</td>
			<td> </td>
			<td>(20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compstatin-Analoga mit Di-Serin-Erweiterung</td>
			<td>Nr. 15</td>
			<td>8</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilisierende Struktur des Compstatin-Analogons W4A9</td>
			<td>13</td>
			<td>18</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C3a-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten</td>
			<td>77</td>
			<td>20</td>
			<td>4/7</td>
			<td>(21)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C5a-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten</td>
			<td>74</td>
			<td>61</td>
			<td>Nr. 2/61</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 gp14-Hemmer</td>
			<td>12</td>
			<td>6</td>
			<td>4/5</td>
			<td>(22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 gp120-Hemmer</td>
			<td>9</td>
			<td>14</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bak-Inhibitoren von Bcl-x L und Bcl-2</td>
			<td>16-18</td> Uhr
			<td>10</td>
			<td>5/5</td>
			<td>(23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitoren von ERK2</td>
			<td>11</td>
			<td>25</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitoren von EZH2</td>
			<td>21</td>
			<td>17</td>
			<td>10/10</td>
			<td>(24)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitoren von LSD1 und LSD2</td>
			<td>16</td>
			<td>Nr. 41</td>
			<td>17/20</td> Uhr
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitoren von HLA-DR1</td>
			<td>13</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
			<td>(25)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitoren von PNP</td>
			<td>5</td>
			<td>13</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. Zusammenfassung der entworfenen Proteine und Peptide unter Verwendung des de novo Protein Design Frameworks. Die # der rechnerischen Vorhersagen wird als die Anzahl der günstigen Vorhersagen dargestellt (d. h. Faltungsspezifitäten oberhalb eines bestimmten Cutoffs oder approximative Bindungsaffinitäten, die größer als die native Sequenz sind). Die # der experimentellen Validierungen ergibt zwei Zahlen: Die erste ist die Anzahl der Vorhersagen, die experimentell validiert wurden, während die zweite die Gesamtzahl der Vorhersagen ist, die experimentell getestet wurden.
Das Design von human-beta-defensin-2 (hβD-2) wurde durchgeführt, um die antimikrobielle Eigenschaft des Peptids zu verbessern. 17 Für dieses Design haben wir zwei Fälle berücksichtigt: 1) bis zu 10 Mutationen entlang von hβD-2 und 2) vollständiges Sequenzdesign aller hβD-2-Restpositionen mit Ausnahme der Cysteine (8, 15, 20, 30, 37 und 38). Bei der Konstruktion wurden drei verschiedene Designvorlagen und drei verschiedene Sequenzauswahlmodelle verwendet. Ein hohes Maß an Ähnlichkeit bei den Mutationen wurde sowohl für das 10-Mutations-Design als auch für das vollständige Sequenzdesign zwischen dem gewichteten Durchschnitts- und dem Distanz-Bin-Modell beobachtet. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass eine große Anzahl von Sequenzen günstigere berechnete Faltungsspezifitätswerte aufwies als die native Sequenz.
Komplementsystem-Inhibitoren (von C3, C3a und C5a) wurden entwickelt, um eine Reihe von Immunkrankheiten wie Schlaganfall, Herzinfarkt, Alzheimer, Asthma, rheumatoide Arthritis, Abstoßung von Xenotransplantationen, Atemwegserkrankungen bei Erwachsenen, Psoriasis und Morbus Crohn zu bekämpfen. Drei Compstatin-Inhibitoren von C3c, die durch das Proteindesign-Framework vorhergesagt wurden, sowie drei rational gestaltete Sequenzen wurden experimentell validiert, um bessere Bindemittel als das native Compstatin zu sein. 18,19 kg
Weitere Studien untersuchten den Aktivitätsverlust von Compstatin gegen Nicht-Primaten C3c und entwarfen eine Reihe von Kandidaten für Ratten- und Maus-C3c-Inhibitoren. Es wurde gezeigt, dass fünf Sequenzen günstigere Assoziations-freie Energien mit Ratten-C3c aufweisen als die W4A9-Compstatin-Mutante, von der bekannt ist, dass sie C3c hemmt. Dies ist auf eine neue Salzbrückenbildung durch Arg1 zurückzuführen. 20 Acht Sequenzen mit einer N-terminalen Verlängerung wurden als bessere Bindemittel vorhergesagt als W4A9 mit einer di-Serin-Erweiterung. Schließlich wurde vorhergesagt, dass 18 Compstatinsequenzen die gebundene Konformation von W4A9 stabilisieren würden, was starke Kandidaten für C3c-Inhibitoren von Primaten und Nicht-Primaten darstellt.
Zusätzlich zu den C3c-Inhibitoren wurden C3a- und C5a-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten basierend auf den Strukturen von C3a und C5a entwickelt. Sieben vom Modell vorhergesagte C3a-Sequenzen wurden experimentell getestet. Zwei der Sequenzen waren potente Agonisten, während zwei andere partielle Agonisten waren. 21 Die beiden potenten Agonisten zeigten eine 58-fache Verbesserung gegenüber einem zuvor entdeckten "Superagonisten". Das Design von C5a-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten lieferte einen Satz von 61 Sequenzen. Alle Sequenzen wurden synthetisiert und zwei von ihnen erwiesen sich als neuartige C5a-Agonisten.
Fusionshemmer von HIV-1, dem Virus, das AIDS verursacht, wurden entwickelt, um zu verhindern, dass HIV-1 Zellen infiziert. Das erste Design zielte auf gp41 ab, ein Hüllglykoprotein von HIV-1. Das Proteindesign-Framework sagte sechs Sequenzen voraus, die bessere Bindemittel waren als die native Sequenz. Vier dieser vorhergesagten Sequenzen wurden experimentell validiert, um HIV-1 zu hemmen, wobei die beste Sequenz einen ICvon 50 von nur 29 μM aufwies. Diese Sequenz zeigte eine 3- bis 15-fache Verbesserung gegenüber der nativen Sequenz und hatte keinen Aktivitätsverlust gegen einen Enfuvirtid-resistenten Virusstamm. 22 Das zweite Design zielte auf gp120 ab, ein weiteres Hüllglykoprotein von HIV-1. Es wurde vorhergesagt, dass vierzehn Sequenzen Bindemittel von gp120 sind und zusätzliche potenzielle Fusionsinhibitoren von HIV-1 liefern.
Zahlreiche Proteine, die mit Krebs in Verbindung gebracht werden, boten vielversprechende Ziele für Krebstherapeutika. Bcl-2 und Bcl-xL sind anti-apoptotische Proteine, die den Zelltod verhindern. Inhibitoren dieser beiden Proteine wurden entwickelt, um den Zelltod in Krebszellen zu induzieren. Es wurde vorhergesagt, dass zehn Sequenzen bessere Bindemittel sind als die nativen, und diese Ergebnisse deckten frühere experimentelle und Mutagenese-Ergebnisse zusammen. 23 Ein weiteres Zielprotein, ERK2, ist an Signaltransduktionskaskaden beteiligt, was es zu einem vielversprechenden Ziel für antiproliferative Krebstherapien macht. Fünfundzwanzig Sequenzen wurden als Inhibitoren von ERK2 vorhergesagt.
Histon-Methyltransferasen und -Demethylasen kontrollieren dynamisch die Histon-Methylierung, die mit vielen Krebsarten in Verbindung gebracht wurde, einschließlich Prostata, Brust, Lymphom, Myelom, Blase, Dickdarm, Haut, Leber, Gebärmutterschleimhaut, Lunge und Magen. Das De-novo-Proteindesign-Framework identifizierte 17 Inhibitoren von EZH2 (einer Lysin-Methyltransferase) und von den zehn experimentell getesteten Inhibitoren wurde festgestellt, dass alle EZH2 hemmen. 24 Das potenteste Peptid hatte einen IC50 von etwa 13 μM, war bei erhöhten Enzymkonzentrationen gleich wirksam und konkurrierte nicht mit dem Cofaktor. Diese Peptide waren die ersten Inhibitoren von EZH2. 53 Inhibitoren von LSD1 (einer Demethylase) wurden durch das Framework vorhergesagt, und von den 20 experimentell getesteten waren 17 Inhibitoren von LSD1 und 18 Inhibitoren von LSD2. Die besten Inhibitoren wiesen IC50-Werte unter 1 μM auf und waren damit die wirksamsten peptidischen Inhibitoren, die bisher entdeckt wurden.
Die letzten beiden Proteinsysteme lieferten Angriffspunkte für die Behandlung verschiedener Autoimmunerkrankungen wie Zöliakie, Diabetes mellitus Typ 1, systemischer Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, Churg-Strauss-Syndrom, Hashimoto-Thyreoiditis, Morbus Basedow, idiopathische thrombozytopenische Purpura, rheumatoide Arthritis und Allergien. Keiner dieser potenziellen Inhibitoren wurde experimentell validiert, jedoch sagte das Framework sechs Sequenzen voraus, die an HLA-DR1 binden, und 13 Sequenzen, die an PNP binden.
Tabelle 2 fasst experimentell validierte Inhibitoren und Agonisten zusammen, die mit dem de novo Protein Design Framework vorhergesagt wurden. Die Metrik der approximativen Bindungsaffinität wurde verwendet, um neun der Sequenzen vorherzusagen (Inhibitoren von humanem C3c, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 und LSD2), während die Metrik der Faltungsspezifität verwendet wurde, um vier der Sequenzen (Agonisten/Antagonisten von C3aR) zu identifizieren. Diese Peptide unterstreichen den Erfolg des De-novo-Proteindesign-Frameworks, insbesondere die hinzugefügte Metrik der approximativen Bindungsaffinität. Das Framework ist äußerst vielseitig einsetzbar. Sechs verschiedene Proteine, die mit fünfundzwanzig verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, wurden erfolgreich entworfen und experimentell validiert.
<table border="1" cellpadding="1" cellspacing="1" height="147" width="856">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>IC50</td>
			<td>EC50</td>
			<td>Protein-Ziel</td>
			<td>Anwendbare Krankheiten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ027</td>
			<td>0,94 μM</td>
			<td> </td>
			<td>menschliches C3c</td>
			<td colspan="1" rowspan="7">Schlaganfall, Herzinfarkt, Alzheimer, Asthma, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, Multiple Sklerose, Schuppenflechte, Diabetes Typ I, Morbus Crohn, Pankreatitis und Mukoviszidose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ086</td>
			<td>1,98 μM</td>
			<td> </td>
			<td>menschliches C3c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ059</td>
			<td>4,73 μM</td>
			<td> </td>
			<td>menschliches C3c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ110-4</td>
			<td> </td>
			<td>15,2 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ060-4</td>
			<td> </td>
			<td>36,4 nM</td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artikel-Nr.: SQ007-5</td>
			<td>15,4 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artikel-Nr.: SQ002-5</td>
			<td>26,1 nM</td>
			<td> </td>
			<td>C3aR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ435</td>
			<td>29 - 253 μM</td>
			<td> </td>
			<td>HIV-1 gp41</td>
			<td>AIDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ037</td>
			<td>13,57 μM</td>
			<td> </td>
			<td>EZH2</td>
			<td colspan="1" rowspan="5">Prostata-, Brust-, Lymphom-, Myelom-, Blasen-, Dickdarm-, Haut-, Leber-, Gebärmutterschleimhaut-, Lungen- und Magenkrebs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ011-1</td>
			<td>0,521 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ016-1</td>
			<td>0,249 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ026-1</td>
			<td>2,51 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SQ015-1</td>
			<td>1,332 μM</td>
			<td> </td>
			<td>LSD2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2. Computergestützt vorhergesagte und experimentell validierte Peptide, die auf verschiedene Krankheiten abzielen.

protein wisdom: a workbench für<em&gt; in silico</em&gt;<em&gt; de novo</em&gt; aufbau von biomolekülen

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

Das Ziel der de novo-Protein-Design ist es, die Aminosäure-Sequenzen, die in eine gewünschte 3-dimensionale Struktur mit Verbesserungen in spezifischen Eigenschaften, wie Bindungsaffinität, Agonisten oder Antagonisten Verhalten oder Stabilität gegenüber der nativen Sequenz zu falten finden. Protein-Design liegt in der Mitte der aktuellen Fortschritte Drug Design und Entdeckung. Nicht nur, dass Protein-Design liefern Vorhersagen für potenziell nützliche drug targets, aber es verbessert auch unser Verständnis der Proteinfaltung Prozess-und Protein-Protein-Interaktionen. Experimentelle Methoden wie die gerichtete Evolution haben Erfolg in Protein-Design gezeigt. Allerdings sind solche Verfahren durch den begrenzten Raum-Sequenz, die tractably gesucht werden kann begrenzt. Im Gegensatz dazu erlauben Computational Design-Strategien für das Screening von einer viel größeren Menge von Sequenzen, die eine breite Vielfalt von Eigenschaften und Funktionalität. Wir haben eine Reihe von Computer-de novo Protein-Design entwickelte methods fähig Bewältigung mehrere wichtige Bereiche der Protein-Design. Dazu gehören die Gestaltung von monomeren Proteinen für erhöhte Stabilität und Komplexe für erhöhte Bindungsaffinität. Um diese Methoden für eine breitere Verbreitung verwenden wir präsentieren Protein WISDOM ( <a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a> ), ein Werkzeug, das automatisierte Verfahren bietet für eine Vielzahl von Protein-Design-Probleme. Strukturelle Vorlagen eingereicht werden, um den Design-Prozess zu initialisieren. Die erste Stufe der Konstruktion ist eine Optimierung Sequenz Auswahlstufe, die auf die Verbesserung der Stabilität durch Minimierung der potentiellen Energie in dem Sequenzraum soll. Ausgewählte Sequenzen werden dann durch einen Falz Spezifität Stufe und einer Bindungsaffinität Stufe laufen. Ein Rang geordnete Liste der Sequenzen für jeden Schritt des Verfahrens, mit entsprechenden vorbestimmten Strukturen, bietet dem Benutzer eine umfassende quantitative Bewertung der Konstruktion. Hier bieten wir Ihnen die Details of jedes Design-Methode, sowie einige bemerkenswerte experimentelle Erfolge durch den Einsatz der Methoden erreicht.

De Novo-Design von Entry-Inhibitoren für HIV-1
Der in Protein WISDOM implementierte de novo-Design-Rahmen wurde für die Entwicklung von Inhibitoren-Peptiden für mehrere wichtige therapeutische Systeme verwendet (Tabelle 1 und 2). Ein bemerkenswertes System ist die Entwicklung von Peptiden zur Hemmung des Eintrags von HIV-1 in den Wirtszellrezeptor CD4, das hier als repräsentatives System dient, um die praktische Anwendung der Protein-WISDOM-Oberfläche zu demonst...

Wir haben computergestützte de novo Proteindesignmethoden entwickelt, die in der Lage sind, mehrere wichtige Bereiche des Proteindesigns anzugehen. Um diese Methoden zu verbreiten, stellen wir Protein WISDOM vor, ein Online-Tool für Proteindesign (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Ausgehend von einem strukturellen Template kann das Design von monomeren Proteinen für erhöhte Stabilität und Komplexen für eine erhöhte Bindungsaffinität durchgeführt werden.

Protein WISDOM: A Workbench für<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Aufbau von Biomolekülen

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Proteine oder Peptide mit verbesserter Faltung, Bindung oder funktionalen Eigenschaften zu entwerfen. Dies wird erreicht, indem die Protein- oder Komplexstruktur hochgeladen und Mutations- und biologische Restriktionen definiert werden. Als zweiter Schritt wird eine Sequenzselektions-Optimierung durchgeführt, die eine große Anzahl möglicher Protein- oder Peptidsequenzen mit verbesserter Stabilität und Wechselwirkungseigenschaften generiert. Als Nächstes falten.Spezifität und/oder approximative Bindungsaffinitätsberechnungen werden an der entworfenen Sequenz durchgeführt, um die entworfenen Proteine oder Peptide hinsichtlich der gewünschten verbesserten Eigenschaften zu validieren. Es werden Ergebnisse erzielt, die verbesserte Eigenschaften der entworfenen Sequenzen auf der Grundlage der computergestützten Analyse der durch das Verfahren erzeugten Strukturen zeigen. Dieses Protokoll wurde im Labor von Professor Chris Doles, einem Flötisten an der Princeton University, entwickelt.Dieses allgemeine rechnergestützte De-novo-Protein-Design-Protokoll ist in der Lage, mehrere wichtige Bereiche des Protein-Designs anzugehen. D

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