Protokolle für die Beurteilung der Radiofrequenz-Wechselwirkungen mit Gold-Nanopartikel und biologische Systeme für die Nicht-invasive Krebstherapie Hyperthermie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Heizeigenschaften von Goldnanopartikeln in einem 13,56 Megahertz hochfrequenten elektrischen Feld in vitro und in vivo zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Heizrate von konzentrierten Goldnanopartikeln und deren Puffer in einem Quarzvet bewertet wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, In-vitro-Toxizitätsstudien von Goldnanopartikeln mit kultivierten Krebszellen durchzuführen.

Der dritte Schritt besteht darin, In-vivo-Studien von Goldnanopartikeln in einem Eileiterkrebsmodell durchzuführen. Letztendlich können die Ergebnisse zeigen, ob das untersuchte Nanopartikel ein wirksames Mittel für die HF-vermittelte Hyperthermie sein könnte, indem die Nanopartikel in Suspension, in vitro und in vivo analysiert werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Nanopartikel-vermittelten nicht-invasiven Radiofrequenz-Hypothermie zu beantworten, wie z.B. ist die Erwärmung durch die Partikel selbst und kann sie für therapeutische Zwecke eingesetzt werden?

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es nicht viele gut etablierte Protokolle für die Durchführung dieser Art von Experimenten gibt. Das Verfahren wird von Cisneros, einem Forschungsassistenten, Stuart Core, einem Postdoktoranden, und Leila Green, einer weiteren Postdoktorandin, demonstriert. Beginnen Sie als Beispiel mit einer kommerziell erhältlichen 500-Milliliter-Flasche mit Goldnanopartikeln mit einem Durchmesser von fünf Nanometern.

Nehmen Sie etwa 125 Milliliter der Stammgold-Nanopartikellösung und teilen Sie sie auf sechs 50-Kilodalton-Zentrifugenfilterrohre auf, zentrifugieren Sie die Nanopartikel bei 3000 U/min für zwei Minuten und fünf Sekunden. Entfernen Sie den Überstand, d. h. den gefilterten Puffer, und füllen Sie jeden Filter nach. Mit mehr Stammlösung.

Fahren Sie mit der Zentrifusion fort, entfernen Sie den Puffer und laden Sie die Röhrchen neu, bis die gesamte Nanopartikellösung filtriert ist. Ersetzen Sie nach der letzten Zugabe den gefilterten Puffer durch ein ähnliches Volumen deionisiertes Wasser und wiederholen Sie den Vorgang etwa acht weitere Male, nachdem Sie die gefilterte Pufferprobe in das RF-Gerät geladen haben. Erstellen Sie mit der Infrarotkamera-Software Boxen über dem QVE, um das Heizprofil zu erfassen Nach acht Wäschen nähern sich die Heizdaten des fünf Nanometer großen Gold-Nanopartikel-Filtrats denen von deionisiertem Wasser an.

Die UV-Vis-Analyse kann auch zur Überwachung der Schadstoffaufnahme verwendet werden. Zinnen. Hier ist ein sauberes Spektrum zu sehen. Sobald die Pufferverunreinigungen vollständig entfernt sind, suspendieren wir die Nanopartikel in 0,5 Millilitern deionisiertem Wasser in den Filterrohren, die die Nanopartikel aus dem Filter entfernen.

Kombinieren Sie dann alle sechs Suspensionen in einer 15-Milliliter-Tube. Analysieren Sie nun die Probe mit UV-VIS und Zetapotenzial, um Stabilitätsdaten zu erhalten. Verwenden Sie I-C-P-O-E-S und/oder ICP-Massenspektrometrie, um die Nanopartikelkonzentration zu bestimmen.

Die REM- und/oder TEM-Analyse kann auch verwendet werden, um morphologische Daten unter Verwendung eines Kansas RF-Systems oder Lastableitungen, einer 1,3-Milliliter-Spritze Quarzvete, zu erhalten und das elektrische HF-Feld auf etwa 90 Kilovolt pro Meter in der Luft einzustellen, wo sich das Q vete befinden würde. Bei einer Standard-Kochsalzprobe mit 0,9 % Natriumchlorid würde das elektrische Feld auf etwa 1,1 Kilovolt pro Meter reduziert werden. Dies sind die ungefähren Bedingungen, die verwendet werden, um Vergleiche zwischen verschiedenen HF-Systemen zu ermöglichen.

Laden Sie nun einen sauberen Quarz mit 1,3 Millilitern gereinigter Goldnanopartikelsuspension in einer Konzentration von 1000 Milligramm pro Liter. Setzen Sie die Probe für einen Zeitraum von 120 Sekunden oder bis die Probe 70 Grad Celsius erreicht, dem HF-Feld aus. Eine übermäßige Bewitterung kann zu Lichtbögen oder schnellem Sieden führen.

Erfassen Sie die Wärmebilddaten sowie Kontrollbereiche mit einer IR-Kamera und der dazugehörigen Software. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal an derselben Probe. Filtrieren Sie nun die Probe durch einen weiteren 50-Kilodalton-Zentrifugenfilter, um die Goldnanopartikel aus dem Wasserpuffer zu extrahieren.

Machen Sie dann den Puffer allein wieder für das HF-Feld verfügbar. Auch hier bestimmt die dreifache Differenz der hrs zwischen dem Goldnanopartikel-Kolloid und dem Filtrat die HR aufgrund der Gold-Nanopartikel selbst. Zum Schluss suspendieren wir die restlichen Gold-Nanopartikel aus dem Filter in 1,3 Millilitern Wasser für weitere Experimente.

Diese In-vitro-Studien können auf jede Art von Krebszelltyp angewendet werden, der 2D-Monoschichten bildet. In diesem Beispiel werden vom humanen hepatozellulären Karzinom abgeleitete Hep drei B-Zellen von etwa 50.000 Zellen verwendet. In drei Vertiefungen einer 12-Well-Platte mit einem Milliliter Wachstum.

Das Medium setzt das Laden der Zellen fort, bis drei Platten für Nanopartikelstudien gefüllt sind und drei Platten als Kontrollen gefüllt sind. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37,5 Grad Celsius. Am nächsten Tag werden 0,1 Milliliter einer Goldnanopartikellösung mit einer Kapazität von 1000 Milligramm pro Liter in jede Vertiefung der drei Nanopartikelplatten zu den Kontrollplatten eingeführt.

Bei 0,1 Milliliter Wasser in jede Platte alle Platten weitere 24 Stunden lang gut inkubieren. Nach weiteren 24 Stunden aspirieren Sie das Zellmedium und waschen die Zellen mit PBS, um alle oberflächengebundenen Goldnanopartikel zu entfernen. Tauschen Sie dann die Zellmedien aus.

Die Zellen sind nun bereit für die HF-Belichtung. Platzieren Sie jedes 12-Well-Zellpaket in das HF-Feld und warten Sie, bis die Zellen auf 31 Grad Celsius abgekühlt sind. Nach dem leichten Abkühlen die Zellen 3,5 Minuten lang rf aussetzen.

Die Endtemperatur des Zellmediums beträgt etwa 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Zellen in einen Inkubator und warten Sie 24 Stunden, bevor Sie sie analysieren. Wenn die Zellen fertig sind, aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter 25%MTT-Reagenz im Medium.

Lassen Sie die Zellen dann weitere vier Stunden inkubieren. Ersetzen Sie als Nächstes das MTT-Medium durch zwei Milliliter DMSO. Legen Sie die Zellplatten für 10 Minuten auf eine Tischwippe, damit das DMSO die MTT-Reagenzien auflösen kann.

Zum Schluss pipettieren Sie 100 Mikroliter Proben aus jeder Vertiefung auf eine 96-Well-Platte und lesen die Platte optisch bei 570 Nanometern ab. Diese In-vivo-Studien können auf jede Art von Krebs angewendet werden, die in einem orthotopen oder ektopischen Spiegelungsmodell solide Tumoren bilden. In diesem Beispiel werden Hep drei B-Leberkrebszellen mit BPC-Nacktmäusen verwendet.

Beginnen Sie mit etwa 100.000 Trypsin-Zellen und stellen Sie eine Lösung von 2 Millionen Zellen pro 25 Mikroliter her. Geben Sie eine gleiche Menge eiskaltes Matri-Gel in die Zellsuspension und mischen Sie es durch wiederholtes Aspirieren in einer Pipette gründlich. Injizieren Sie nun die gemischte Suspension an der gewünschten Position auf dem Rücken jedes Tieres.

Nach einigen Wochen sind die Tumore zu diesem Zeitpunkt einen halben bis einen Zentimeter rund, beginnen mit der HF-Behandlung und betäuben die Mäuse mit der Lösung von Ketamin und Xylazin durch IP-Injektion und halten sie warm. Injizieren Sie dann die Goldnanopartikel direkt in die Hälfte der Tumore mit einer Ein-cm³-Spritze und einer 27- oder 30-Gauge-Nadel. Verwenden Sie einen chirurgischen Tupfer, um Blut aufzunehmen, und wischen Sie die Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer ab.

Injizieren Sie zur Kontrolle nur PBS in die andere Hälfte der Tumoren. Behandeln Sie nun die Hälfte der Mäuse in jeder Gruppe. Montieren Sie die Maus am Empfangskopf des HF-Generators und schützen Sie unbehandelte Bereiche mit Kupferband, einschließlich Augen, Ohren und Zehen.

Der wichtigste Teil dieses Experiments ist die richtige Erdung Ihrer Mäuse. Ohne ordnungsgemäße Erdung kann der Ladungsaufbau bei den Tieren zu thermischen oder elektrodermalen Verletzungen führen. Dies kann leicht verhindert werden.

Positionieren Sie den Tumor mindestens einen Zentimeter weiter vom Transmissionskopf entfernt als die Breite der gewünschten Behandlungsstelle. Positionieren Sie nun die IR-Wärmebildkamera so, dass der Tumor und der Behandlungsbereich sichtbar sind. Schalten Sie die RF für fünf Minuten ein und zeichnen Sie die resultierende Temperaturkurve auf.

Wenn die Hautoberflächentemperatur über 42 Grad Celsius steigt, beenden Sie die Behandlung sofort nach der HF-Exposition. Lassen Sie die Mäuse sich in einer warmen Kammer erholen, bis sie wieder bei Bewusstsein sind. Wiederholen Sie die Behandlungen drei Wochen lang zweimal pro Woche.

Dann werden die Mäuse 48 Stunden nach der letzten HF-Exposition eingeschläfert und die Tumore verarbeitet. Die HF-Erwärmung der gereinigten Goldnanopartikel wurde durch die Differenz in Stunden zwischen ihnen und der deionisierten Wasserpufferlösung bestimmt. Die Ergebnisse waren sowohl für Fünf-Nanometer- als auch für 10-Nanometer-Nanopartikel wie erwartet.

Die gereinigten Goldnanopartikel, die in das humane hepatozelluläre Karzinom integriert wurden, leiteten Hep-Drei-B-Zellen ab. Wenn solche Zellen einem HF-Feld ausgesetzt werden, werden sie in der Regel weniger lebensfähig als solche, die ohne internalisierte Nanopartikel HF ausgesetzt sind. Abbildung drei zeigt ein idealisiertes Szenario, in dem die verwendeten Goldnanopartikel an sich eine begrenzte Toxizität aufweisen, aber hervorragende HF-induzierte zytotoxische Eigenschaften aufweisen. Konsultieren Sie die Literatur für einen umfassenden Überblick über die bisherigen In-vitro-Ergebnisse mit verschiedenen Arten von Nanomaterialien.

Hep drei B.Leber-Krebszellen wurden verwendet, um Tumore auf dem Rücken von Babsi-Nacktmäusen zu erzeugen. Diesen Tumoren wurden PBS-suspendierte Goldnanopartikel injiziert, gefolgt von einer HF-Exposition. Die Analyse nach der Behandlung durch Thomas zeigte, dass die Behandlung das Tumorwachstum kontrollierte und die Tumormasse verringerte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Nanopartikel für den Einsatz bei HF-vermittelter Hypothermie beurteilen können, indem Sie ihre auf HF reagierenden Eigenschaften und Lösungen in vitro und in vivo bestimmen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit elektrischen HF-Feldern extrem gefährlich sein kann. Berühren oder greifen Sie niemals in ein aktives elektrisches Feld.

Nehmen Sie Messungen des elektrischen Feldes vor und verwenden Sie gegebenenfalls eine geeignete Abschirmung wie einen Faradayschen Käfig. Im Allgemeinen sollten Sie Ihre Exposition gegenüber anhaltend starken elektrischen Feldern immer minimieren.