Name: Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Lernen Sie die optimierte Präparation akuter Hippocampus-Slices von Mäusen für stabile Langzeit-Potenzierungs-Erfassungen über acht Stunden. Diese Methode erreicht eine Erfolgsrate von 95 Prozent und ermöglicht reproduzierbare elektrophysiologische Studien zur synaptischen Plastizität.

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Wir danken Bernard Foucart für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der belgischen Fonds für wissenschaftliche Forschung (FRS-FNRS) und von der Königin Elisabeth Fonds für medizinische Forschung unterstützt. Agnès Villers ist Research Fellow an der belgischen Fonds für wissenschaftliche Forschung.

Alle tierischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Tieren in der Forschung und mit der Zustimmung der lokalen Ethikkommission durchgeführt. 1. Herstellung künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit Die gleichen Medien verwendet wird, zu sezieren, geschnitten und perfundieren Scheiben (1 ml / min) während der Ruhezeit und der elektrophysiologischen Ableitungen. Diese Medien werden von 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4 und 10 mM D-Glucose. <ol><li> Wägen Sie die verschiedenen Komponenten für 2 L von ACSF außer MgSO 4, das bereits in Lösung (1 M). Mit einem Standard-Lösung ermöglicht es, sicher sein, die genaue Konzentration der Mg 2 +, weil MgSO 4 in Pulver ist stark hygroskopisch. Ca 2 +: Mg 2 +-Verhältnis stark beeinflusst LTP Induktion und Aufrechterhaltung14 und damit die Proportionen müssen immer beachtet werden. </li><li> Setzen Sie alle Komponenten außer CaCl 2 in einem Glas Messzylinder und bringen bis 2 L mit destilliertem H 2 O. </li><li> Kräftig rühren. Wenn alles gelöst ist, fügen carbogen durch ein Aquarium Bubbler und Schlauch an den Tank (95% O 2, 5% CO 2). Warten Sie ein paar Minuten, und fügen Calciumchlorid bei pH 7.4 wird durch die Wirkung von Bicarbonat-Puffer fixiert. </li><li> Halten Sie 600 ml in einem gekühlten rechteckigen Glasschale und abkühlen auf 4 ° C mit Eis rund um den Teller. Diese Medien werden für Hippocampus Präparation verwendet werden. </li><li> Filtern Sie die verbleibenden 1.400 ml und halten in einem Erlenmeyerkolben. </li></ol> 2. Vorbereitung der elektrophysiologischen Rig und das Gehirn Scheibe Recording Kammer Die Perfusion Schaltung von 2 Schlauchpumpen, eine Pumpen frische Flüssigkeit aus einem Reservetank und das andere Pumpen verwendet Fluid von t gemachter Aufnahme Kammer zu einer bin. Frische Fluid einem hausgemachten Perfusion System, wo es wieder mit Sauerstoff erwärmt und vor dem Erreichen der Schnittstelle Aufnahme Kammer durch die Schwerkraft (Abbildung 1A) aufgenommen. Die Schnittstelle Aufnahme Kammer wurde von FST (Fine Science Tools, Vancouver, Kanada, 1B) ausgelegt. Gewebeschnitte Gewebeeinlagen Netzfilter an einem abnehmbaren Ring und kann auch kontinuierlich unter Bedingungen Schnittstelle werden durch Höhenverstellung der Saug-und Nadel gehalten wurde. Eine hausgemachte Kunststoffrohr an seinem Ende und perforierte seitlich (0,5 mm) blockiert wird dem Saugnadel auf Pegelfestigkeit in der Kammer zu erhöhen befestigt. Die Aufnahme Kopf über einem Wasserbad mit einer Gasdispersion Stein, pflegen eine feuchte Umgebung, indem feuchte Luft durch Ablenkung Häfen in der Schreibkopf (bis wasserspreitende verringern) hilft montiert. Bath und mittlere Temperatur werden durch kontinuierliches Variieren der Höhe des Gleichstroms th gesteuertgrobe Ein Silikonkautschuk eingebettet Heizelement im Wasserbad. Thermistoren im Wasserbad und die Aufnahme Brunnen ermöglichen Temperatur in der Kammer zu setzen und werden genau überwacht an diesen Stätten. Die Heizung der Kammer wird durch ein globales Heizungsanlage Steuern der Temperatur der gesamten Anlage abgeschlossen. Die Software, die von Forschern an der University of Edinburgh (entwickelt <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) überwacht und gleicht die Temperatur der Luft Sauerstoff, das Gehirn Scheibe, die Elektroden und die restlichen rig eine stabile Umgebung für Langzeit-Aufzeichnungen (1C) . Die Temperatur für Maus Hippocampus verwendet ist 28 ° C. <ol><li> Spülen Sie alle Perfusionskreislauf mit destilliertem H 2 O für mindestens 20 min und starten Sie die Heizungsanlagen. </li><li> Starten Sie den carbogen sprudelnden in der Schaltung. Carbogen kommt in den hausgemachten Perfusion Rohre durch filter Kerzen und im Wasserbad unter der Aufnahme Kammer. Die Strömungsgeschwindigkeit im Wasserbad wird durch einen Durchflussmesser gesteuert wird. Ist der Durchfluss ist zu langsam, konnte Gewebe werden hypoxischen. Umgekehrt, wenn die Strömung zu hoch ist, kann das Gas nicht ausreichend erwärmt und befeuchtet, was zu Trocknen des Gewebes. Hohe Gasdurchflussrate könnte auch die Chance erhöhen, Wasser Sprühen über das Gewebe aus dem Wasserbad unten führt zu osmotischen Schock. Dies kann durch Hinzufügen von Bits feinmaschiges (100 um) am Ausgang der Auslenkung Anschlüsse verhindert werden. </li><li> Kreislauf entleeren und füllen Sie mit gefiltertem ACSF. </li><li> Setzen Sie den Ring, der die Scheibe in der Abstehkammer unterstützen wird. Ein gewebtes Netz Filter mit Maschenweite im Bereich von 500 bis 750 um gedehnt und an dem Ring mit zwei Teil-Harz-Komponenten-Kleber. Das gewebte Netz Filter besteht aus 87% Polyamid und 13% Elasthan (Höschen 15 den) gemacht. Kleber sorgfältig angewendet werden, um die Bildung von Reliefs an der Oberfläche des rin vermeideng. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen aus dem Kreislauf. </li><li> Stellen Sie den Pegel ACSF in der Aufnahme Kammer mit der Schraube des Saugnadel. Die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpen auf 1 ml / min für die Zulaufpumpe und 5 ml / min für die Ablaufpumpe eingestellt. </li></ol> Der Perfusionsdruck wird auf einem starren rüttelfest Tisch gelegt und von einem Faraday-Käfig. 3. Vorbereitung der Präparation Gebiet Chirurgische Instrumente: ein Skalpell mit einem # 11 Klinge, kleine Standard Präparierscheren, Feder Schere, gebogenen Pinzette, zwei Heidemann Spatel und ein Löffel. Zusätzliches Material: eine Guillotine, eine Unterlage, eine McIlwain Gewebe Chopper mit einer Rasierklinge, Filterpapier, ein Glas Pasteurpipette mit einem Gummi-Sauger, Pipetten 2 Kunststoff-Pasteur von denen einer mit einem breiten Mund, eine Petrischale, einem metallischen Zylinder 7 mm Durchmesser (2A). <ol><li&gt; In dem Sezieren Schüssel mit kaltem ACSF (hergestellt in Schritt 1) ​​gefüllt, tauchen ein gekühltes Glas Deckel aus einer Färbung Gericht, in Filterpapier gewickelt. Entfernen Sie vorsichtig Luftblasen und Sauerstoff die ACSF durch ein Aquarium Bubbler (Abbildung 2A). </li><li> Legen Sie Instrumente in der Reihenfolge der Verwendung. In drei Lagen Filterpapier auf das Gewebe Chopper Platte und einer neuen Rasierklinge mit destilliertem Wasser und Ether (2B) gereinigt. Die Rasierklinge muss waagerecht sein, wenn sie das Papier berührt. Auflagedruck auf den halben Maximalwert und Geschwindigkeit auf etwa ein Drittel des maximalen Wert eingestellt. </li><li> Aufmerksam überprüfen, ob alles bereit ist (Instrumente, Temperatur ...), weil Sie nicht haben, Zeit danach. </li><li> Bitten Sie jemanden, der Dissektion mit einer Pasteurpipette mit kaltem ACSF gefüllt sprühen. </li><li> Anesthetize die Maus mit Nembutal IP (100 mg / kg) vor Enthauptung. Halothananästhesie können ebenfalls verwendet werden. Wir haben beide Methoden verglichen und obtainiert gleichen Ergebnisse. Enthauptung muss unter Vollnarkose durchgeführt werden, aber Genickbruch können ebenfalls verwendet werden. Allerdings Genickbruch braucht eine sehr gute Übung, um das Leiden der Tiere zu vermeiden. </li><li> Präparieren Sie auf der Unterlage so schnell wie möglich unter kaltem ACSF kontinuierlichen Dusche. </li></ol> 4. Gehirn Removal <ol><li> Halten Sie immer noch den Kopf mit dem Zeigefinger und dem Daumen einer Hand auf die Schnauze, einen Einschnitt mit den Präparierscheren entlang der Mitte der Oberseite des Kopfes beginnend am Rand der Guillotine und läuft rostral zum Stirnbein . </li><li> Durchtrennen Hautmuskel auf jeder Seite des Kopfes vollständig aussetzen Schädel Platten und entfernen Sie die Muskeln an der kaudalen Seite des Kopfes. </li><li> Mit den Präparierscheren, schneiden Sie den M. temporalis auf jeder Seite, entlang der temporalis Platte, dann schneiden Sie die frontalen Platten in der Mitte, quer. Dann machen Sie einen kleinen Schnitt am Hinterhauptbein, zwischen den beiden plAtes. </li><li> Für jede Seite, am kaudalen Basis der okzipitalen Platten geschnitten. </li><li> Schneiden Sie entlang der Sagittalnaht mit Feder Schere. </li><li> Mit Pinzette, entfernen Sie die Schädel Hälften, indem sie diese voneinander entfernt. </li><li> Mit dem Skalpell geschnitten quer kurz nach dem Riechkolben und kurz bevor das Kleinhirn dann stürzen die extrahierte Gehirn in das Sezieren Schüssel mit kaltem ACSF. </li></ol> 5. Hippocampal Dissection <ol><li> Sobald das Gehirn im Sezieren Gericht eingetaucht ist, trennen die beiden Hemisphären voneinander mit einem Skalpell in der Mitte eingesetzt. </li><li> Die Präparation des Hippocampus mit Spatulae unter Sichtkontrolle durch ein Fernglas Operationsmikroskop (X25, 2A) durchgeführt. Auf der einen Hemisphäre, sorgfältig verteilt, die Strukturen, um die lateralen Ventrikel zu sehen. Entfernen Sie den Hirnstamm und Zwischenhirn. Dies wird durch die Anwendung der Spatulae auf dem frontalen Kortex auf der einen Seite und auf der Zwischenhirn auf das getananderen Seite. Achten Sie darauf, nicht zu berühren den Hippocampus mit dem Spatel und nicht strecken sie während Gewebe Schnitte. </li><li> Trenne die Fornix dann vorsichtig den Hippocampus aus dem Kortex (wegrollen), indem Sie einen Spachtel in die Herzkammer. </li><li> Wenn der Hippocampus extrahiert wird, entfernen überschüssiges Gewebe und Kortex verbleibenden Blutgefäße. </li></ol> 6. Schneiden der Scheiben <ol><li> Mit einem breiten Mund Kunststoff Pasteurpipette übertragen den Hippocampus in einem Löffel mit seinen alvear Oberfläche nach oben (konvexe Seite). </li><li> Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Standard-Kunststoff-Pasteurpipette. </li><li> Tipp den Löffel senkrecht fast berühren das Filterpapier des Choppers (2B) und Drop-off den Hippocampus vom Löffel, durch schnelles Berühren des Filterpapier bewegen Sie dann wieder den Löffel. </li><li> Richten Sie den Hippocampus und schneiden Sie es quer bis 400 um mit dem Chopper (siehe Abbildung 2C für Ausrichtung des HippocampusEiter gegenüber der Rasierklinge). Gesetz so schnell wie möglich. </li><li> Entfernen Sie das Filterpapier mit den in Scheiben geschnittenen Hippocampus und wickeln Sie es um den Metallzylinder zu verbreiten die Scheiben ein wenig. Dann geben sie die Scheiben mit Sprays von ACSF mit einem Standard-Kunststoff-Pasteurpipette und sammeln sie in einer Petrischale mit kaltem ACSF gefüllt. </li></ol> 7. Inkubation von Slices im Interface <ol><li> Wählen Scheiben mit einem Standard-Kunststoff-Pasteurpipette und schnell legen Sie sie in der Aufnahme Kammer. Scheiben von der Dissektion Trauma direkt in der Aufnahme Kammer erholen, in der Schnittstelle bei 28 ° C </li><li> Die Scheibe wird höchstwahrscheinlich Waschbecken. Senken Sie den Füllstand, die Slice-Level zu erreichen, und dann heben Sie es, um es zu schweben. </li><li> Drehen Sie die Scheibe in der richtigen Position, während das Absenken. Slices sind immer in der gleichen Weise, um die Positionierung der Elektroden (2 anregenden und eine Aufnahme-Elektroden) in der CA1-Region zu erleichtern orientiert. </li><li> Stoppen Sie, wenndie Flüssigkeit ist in-Schnittstelle. A &quot;Meniskus&quot; der Medien auf der Scheibe ist, das einen ausreichenden Grad von Medien. Die Netto-Filter muss mit Medien gesättigt, aber nicht vollständig untergetaucht. </li><li> Halten Sie die Kammer mit Filterpapier über den perforierten Deckel platziert abgedeckt. </li><li> Lassen Sie die Scheibe Rest für mindestens 1,5 h bei 28 ° C. </li></ol> 8. Aufnahme der synaptischen Antworten <ol><li> Aufnahme-Elektrode: Glaskapillaren gezogen werden, um eine Spitze von 2-5 MOhm Widerstand zu erhalten, wenn sie mit ACSF gefüllt. Ein kleines Stück Filterpapier wird auf der Spitze der Elektrode angeordnet und Knochenwachs wird an dem Ende, um Kondensation zu verringern aufgebracht. Stimulierenden Elektroden: Platin-Iridium-Cluster bipolaren Elektroden mit einer 12,5 Mikrometer Durchmesser von FHC (USA) erworben. Mit der richtigen Pflege kann jede Elektrode mindestens 30 mal (Abbildung 1B) verwendet werden. </li><li> Positionieren Sie die Elektroden in das Stratum radiatum der CA1-Region, gesäumt alle Elektrodenbis (3A). Elektroden 75 bis 150 um unter der Oberfläche der Scheibe mit Narishige Mikromanipulatoren abgesenkt. Die beiden stimulierenden Elektroden gesetzt werden, um zwei unterschiedliche Bündel von Schaffer Kollateralen stimulieren. Wenn die Elektroden auf die Scheibe abgesenkt werden Filterpapier sorgfältig rundum, um die Kammer zu schließen platziert. </li><li> Zweiphasige Stimulation (0,08 ms Pulsdauer pro Halbwelle) wird bei konstanter Spannung mit einem Grass-Stimulator verbunden SIU-V Isolierung Einheiten durchgeführt. Maximal Reaktion durch Erhöhung Reizstärke von 2 V bis maximal 12 V Feld EPSPs 1000 mal mit einer WPI ISO-Verstärker 80 verstärkt und gefiltert bei 10 Hz und 10 kHz überprüft. Das Signal wird dann an einen PC durch ein National Instrument A / D-Wandler gesendet. Stimulation, Datenerfassung und Analyse werden unter Verwendung des WinLTP Programm ( <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). Feld EPSPs bei 40% der maximalen Amplitude erhalten in einem Eingangs-out aufgezeichnetKurve setzen. Für jede Scheibe, werden die fEPSP Pisten gegen die mittlere Steigung über die 30 min vor LTP Induktion normalisiert. </li><li> LTP durch Anlegen einer einzigen Folge von Stimulationsimpulsen (100 Hz) auf Prüfkraft auf einen Weg, während die zweite Bahn dient als Kontrolle ausgelöst. </li></ol> 9. Reinigung des Setup <ol><li> Spülen all die Schaltung mit einer 3% igen Lösung von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) für mindestens 10 min, dann abtropfen. Die Schaltung wird sorgfältig mit destilliertem Wasser werden vor Beginn eines jeden Versuchs gespült. Die Verwendung von H 2 O 2 ist nicht zwingend erforderlich, da andere Labore nur destilliertes Wasser verwenden für die Reinigung, aber wir haben die Ablagerung von dunklen Rückstände im Schlauchsystem bemerkt, wenn nur mit Wasser. </li><li> Ersetzen Wasser im Wasserbad unter der Aufnahme Kammer. </li><li> Bath die stimulierenden Elektroden Tipps in Alkohol für 5 min. </li></ol>

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<li>Izquierdo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+the+mechanisms+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and the mechanisms of memory.</a> Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben in unserem Labor ein Protokoll aus der Kombination von Methoden entwickelt und eingesetzt von anderen Laboratorien mit einem großen Know-how in LTP Aufnahmen 11,17 entwickelt. Dieses Protokoll wird zur adulten Maus Hippocampus angepasst und kann bei Tieren jeden Alters und jeder Genotyp Hintergrund verwendet werden. Es ermöglicht auch die Analyse von LTP in transgenen Mäusen Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit 18,19. Die Verwend...

Heutzutage gibt es nur begrenzte Verständnis davon, wie komplex Erinnerungen gespeichert und abgerufen am neuronalen Schaltkreis-Niveau. Allerdings ist eine einheitliche Hypothese von Speicher verfügbar und breit akzeptiert: Erinnerungen werden als Änderungen in der Stärke der synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen im zentralen Nervensystem gespeichert. Auf seiner eigenen, hat die Forschung auf die synaptische Plastizität im Wesentlichen aus zwei bahnbrechende Entdeckungen profitiert. (1) In ein bahnbrechendes Experiment, Bliss und Lomo 1, mit dem intakten narkotisierten Kaninchen, festgestellt, dass die Lieferung von einer kurzen Hochfrequenz-(1 sec, 100 Hz) Stimulation des perforant Pfad des Hippocampus eine dauerhafte (mehrere verursacht Stunden) erhöhen in den zugehörigen synaptischen Verbindungen. Dieses faszinierende Phänomen wurde &quot;Langzeit-Potenzierung&quot; oder LTP von Douglas und Goddard als in 1975 2. (2) später, wurde festgestellt, dass ein ähnliches Phänomen in Gehirnscheiben ausgelöst werden konnte (0,4 mm) künstlich aufrechterhalten in vitro lebendig </em&gt;. Die am häufigsten untersuchten LTP wurde in vitro durch die Bereitstellung einer oder mehrerer tetani, um ein Bündel von Axonen (die sogenannten Schaffer-Kollateralen) bei der Aufnahme das resultierende Feld erregenden synaptischen Potential in den Pyramidenzellen der sogenannten CA1-Region hervorgerufen beobachtet. Die Mechanismen der LTP Induktion weitgehend aufgedeckt worden. Grundsätzlich aktiviert ein Ca 2 +-Einstrom durch den NMDA-Rezeptoren Enzyme mit zwei Folgen: eine Phosphorylierung von AMPA-Rezeptoren (die steigert so deren Effizienz) und eine Aufnahme von zusätzlichen AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran 3. Im Gegensatz dazu sind die Mechanismen der Erhaltungsphase der LTP weitgehend unbekannt, vor allem weil es experimentell sehr viel schwieriger, eine Scheibe gesund für viele Stunden als für 30 bis 60 min zu halten ist. Viele Studien haben zum Verständnis der Mechanismen LTP und interessante Theorien gewidmet haben über die Jahre 4-11 ausgearbeitet. Aber unbis jetzt, haben die genauen molekularen Mechanismen der stabilen Anstieg der synaptischen Stärke nicht geklärt. Dies kann zum Teil auf die Schwierigkeit mit vorherigen Messungen in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Techniken zur Herstellung reproduzieren und die Aufrechterhaltung des Hippocampus. In ihrer Methodik Papier betonte Sajikumar et al. 12 die Bedeutung von experimentellen Bedingungen für die Herstellung von Ratte Hippocampus und der Aufnahme stabil LTP. In diesem Video stellen wir Ihnen alle Optimierungsschritte in unserem Labor im Laufe der Jahre entwickelt, um der Lage sein, eine sehr stabile LTP in Maus Hippocampus aufzeichnen. Diese Optimierung wurde von Protokollen entwickelt und erfolgreich eingesetzt von anderen Laboratorien, die LTP-Mechanismen Studie an Mäusen und Ratten 13 11 vorgenommen. Es ermöglicht erfahrenen Forscher zu induzieren und aufzeichnen eine sehr lang anhaltende LTP in erwachsenen Mäusen mit einer hohen Erfolgsquote. Die physiological Grundlage der induzierten LTP wurde sorgfältig geprüft und nachgewiesen 14. In dieser Methodik Papier zeigen wir, dass alle Änderungen der experimentellen Bedingungen, wie Temperatur oder Sauerstoffsättigung kann eine tief greifende Auswirkungen auf die LTP Wartung haben während der Dissektion Verfahren stark verändern können Scheiben Erregbarkeit. Es muss auch betont werden, dass die präzise Steuerung all dieser Parameter eine Ausbildung von mehreren Monaten für unerfahrene Studenten benötigt werden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz/Material</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 </td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 1M</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>63126</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide (Belgien)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren</td><td>WPI, Inc. (UK)</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>Stimulierende Elektroden</td><td>FHC (USA)</td><td>CE2B30</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Instrumente</td><td>FST (Deutschland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier 84 g/m2</td><td>Sartorius</td><td>FT-3-105-110</td><td></td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Lycra</td><td>15 den</td><td></td></tr><tr><td>Glue</td><td>UHU</td><td>plus endfest300<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>WPI, Inc. (UK)</td><td>ISO-80</td><td></td></tr><tr><td>Schnittstelle Aufnahmekammer</td><td>FST (Deutschland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpen</td><td>Gilson (USA)</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Universität Edinburgh</td><td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Gewebezerkleinerer</td><td>McLlwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimulatoren</td><td>Grass (USA)</td><td>S88X + SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>Programmanalyse</td><td>WinLTP</td><td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren</td><td>Narishige</td><td>MM-3 und MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Operationsmikroskop</td><td>Leica Microsystem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A/D-Wandler</td><td>National Instruments</td><td>NIPCI-6229 M-Serie</td><td></td></tr></tbody></table>

verbesserte zubereitung und konservierung von hippocampus maus slices für eine sehr stabile und reproduzierbare erfassung der langzeit-potenzierung

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Langzeitpotenzierung (LTP) ist eine Art der synaptischen Plastizität durch eine Erhöhung der synaptischen Stärke aus und vermutlich in Gedächtniscodierung einbezogen werden. LTP ausgelöst in der CA1-Region des akuten Schnitten des Hippocampus ist eingehend untersucht worden. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Erhaltungsphase für dieses Phänomen sind noch weitgehend unverstanden. Dies könnte teilweise auf den verschiedenen experimentellen Bedingungen durch verschiedene Laboratorien. Tatsächlich ist der Erhaltungsphase der LTP stark von äußeren Parametern wie Sauerstoffversorgung, Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Es hängt auch von internen Parametern wie Orientierung der Schnittebene und Scheibe Lebensfähigkeit nach der Sektion. Die Optimierung all dieser Parameter ermöglicht die Induktion einer sehr reproduzierbar und sehr stabile Langzeit-Potenzierung. Diese Methode bietet die Möglichkeit, weiter zu erforschen die molekularen Mechanismen in der stabilen Anstieg beteiligtder synaptischen Stärke in Hippocampus. Es unterstreicht auch die Bedeutung der experimentellen Bedingungen in in vitro Untersuchung der neurophysiologischen Phänomene.

Diese Methode wurde verwendet, um die Eigenschaften von langlebigen Langzeit-Potenzierung im Hippocampus von akuten Erwachsenen C57BL/6J-Mäusen (JANVIER SAS, Frankreich) 14 induziert analysieren. Überraschenderweise hat die Verbesserung der experimentellen Bedingungen zu einer neuen Sichtweise auf LTP geführt. Wir zeigten, dass lang anhaltende Erhöhung der synaptischen Stärke nicht verlangen, die Synthese neuer Proteine. Hier zeigen wir, dass LTP Induktion auf Scheiben Lebensfähig...

Dieser Beitrag stellt eine komplette Methode für die Vorbereitung und die Erhaltung<em&gt; In vitro</em&gt; Akuten Schnitten des Hippocampus von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufnahme von sehr stabilen langlebigen Langzeit-Potenzierung (LTP) für mehr als 8 Stunden mit einer Erfolgsquote von 95%.

Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, sehr stabile und reproduzierbare Langzeit-Potentierungen in akuten Hippocampus-Schnitten aufzeichnen zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst das Mausgehirn entnommen und der Hippocampus unter dem Mikroskop in kalter aCSF disseziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, transversale Hippocampus-Schnitte mit einem Gewebeschneider anzufertigen.Anschließend wird der Schnitt in die Interface-Aufnahmekammer gegeben, die mit oxygenierter künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit perfundiert wird. Im letzten Schritt werden die Elektroden platziert und die synaptische Aktivität in der CA1-Region des Hippocampus aufgezeichnet. Abschließend wird ein Hochfrequenzstimulationsprotokoll angewendet, um die Induktion einer sehr stabilen langzeitigen Potenzierung nachzuweisen.Mithilfe dieser Methode können Erkenntnisse über die Mechanismen gewonnen werden, die der synaptischen Plastizität zugrunde liegen. Sie kann außerdem auf andere Systeme angewandt werden, wie beispielsweise Tiermodelle neurodegenerativer Erkrankungen oder des Nervensystems, oder auf immunologische Erkrankungen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da alle Handgriffe große Geschicklichkeit und viel Übung erfordern.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Perfusionsanlage mindestens 20 Minuten lang mit destilliertem Wasser spülen. Schalten Sie dann die Heizsysteme ein. Starten Sie das Durchbläsen des Carbogens in der Anlage.Das Carbogen wird über Luftdiffusoren in das Wasserbad unter der Aufnahmekammer geleitet. Anschließend regeln Sie die Durchflussrate im Wasserbad mithilfe eines Durchflussmessers. Danach entleeren Sie die Schaltung und füllen sie mit filtriertem aCSF, um die Bläschen zu entfernen. Danach platzieren Sie den Ring, der die Schnitte in der Haltekammer stützt.Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen aus dem Kreislauf. Danach stellen Sie den A-CSF-Spiegel in der Ableitungskammer mit der Schraube der Saugnadel ein; die Geschwindigkeit der Einlasspumpe wird auf einen Milliliter pro Minute eingestellt und die Auslasspumpe auf fünf Milliliter pro Minute. Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, bereiten Sie alle chirurgischen Instrumente vor.Um das Gehirn einer geopferten Maus zu entnehmen. Halten Sie den Kopf mit Zeigefinger und Daumen fest und führen Sie mit der Präzisionsschere einen Schnitt entlang der Mitte der Schädeldecke aus, beginnend am Rand der Gulaschschere und bis zum Stirnbein verlaufend. Schneiden Sie anschließend die Hautmuskulatur an jeder Seite des Kopfes durch, um die Schädelplatten vollständig freizulegen.Entfernen Sie anschließend die Muskeln an der Schädelseite des Kopfes. Schneiden Sie danach den Musculus temporalis beidseits entlang der Schläfenplatte. Dann schneiden Sie die Stirnplatten in der Mitte quer durch.Nun führen Sie einen kleinen Schnitt am Hinterhauptsbein zwischen den beiden Platten durch. Schneiden Sie an der Basis der Hinterhauptsplatten auf jeder Seite entlang. Danach schneiden Sie mit der Feder-Schere entlang der Sagittalfuge.Entfernen Sie abschließend den Schädel, indem Sie die Hälften mit einer Pinzette voneinander wegspreizen. Schneiden Sie nun mit dem Skalpell unmittelbar vor dem Kleinhirn und unmittelbar hinter der Riechwurzel quer durch und übertragen das entnommene Gehirn in die Präparierschale mit kaltem ACSF. Sobald das Gehirn in der Präparierschale liegt, trennen Sie die beiden Hemisphären unter einem binokularen Operationsmikroskop voneinander, indem Sie mit dem Skalpell in der Mitte einsetzen, und spreizen Sie vorsichtig die Struktur einer Hemisphäre auseinander, um das Seitenventrikel freizulegen.Entfernen Sie das Hirnstamm- und Zephalon-Gewebe, indem Sie ein Spatel auf die frontale Großhirnrinde und ein weiteres Spatel auf das Zephalon legen. Achten Sie darauf, das Hippocampus-Gewebe mit dem Spatel nicht zu berühren und es während des Schneidens nicht zu dehnen. Danach durchtrennen Sie das Fornix.Drücken Sie dann vorsichtig den Hippocampus aus der Hirnrinde heraus, indem Sie ein Spatel in das Ventrikel einführen. Sobald der Hippocampus entfernt ist, entfernen Sie überschüssiges kortikales Gewebe und verbliebene Blutgefäße mit einer Pasteurpipette aus Plastik mit breiter Öffnung. Überführen Sie den Hippocampus mit der Alvea-Seite nach oben in eine Zange und legen Sie ihn auf die Plattform des Schneidegeräts.Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit vom Löffel mit einer standardmäßigen Plastik-Pasteurpipette. Danach halten Sie den Löffel vertikal und bringen ihn fast bis an das Filterpapier auf dem Zerkleinerer. Lassen Sie den Hippocampus abfallen, indem Sie das Filterpapier kurz berühren.Danach den Löffel zurückziehen. Anschließend orientieren Sie das Hippocampus und schneiden es transversal in 400-Mikrometer-Scheiben mit dem Schneidegerät.Führen Sie den Vorgang so schnell wie möglich durch. Entfernen Sie anschließend das Filterpapier mit den hippokampalen Schnitten und wickeln Sie es um den metallischen Zylinder, um die Schnitte etwas zu verteilen. Lösen Sie dann die Schnitte mit Sprühstößen von ACSF unter Verwendung einer standardmäßigen Plastikpipette und sammeln Sie sie in einer mit kaltem Puffer gefüllten Petrischale.Ein CSF. Überführen Sie die ausgewählte Schnittebene mit einer standardmäßigen Plastik-Pasteurpipette in die Ableitungskammer. Lassen Sie die Schnittebene in der Aufzeichnungsoberflächenkammer bei 28 Grad Celsius von dem Schnitttrauma erholen.Wenn das Schnittpräparat tiefer absinkt als das ACSF-Niveau auf der Höhe des Präparats, erhöhen Sie das ACSF-Niveau erneut, sodass das Präparat schwimmt. Danach richten Sie das Präparat in die Position aus, die die Platzierung der Elektroden im CA1-Bereich erleichtert. Beenden Sie das Absenken des ACSF-Niveaus, sobald es an der Grenzfläche angekommen ist.Der Meniskus des Mediums um den Schnitt herum deutet auf ein ausreichendes Niveau an ZNS-Liquor hin. Das Netz muss mit Medium gesättigt, aber nicht vollständig untergetaucht sein. Anschließend sollte die Kammer mit Filterpapieren über dem perforierten Deckel bedeckt gehalten werden.Lassen Sie den Schnitt mindestens eine Stunde und 30 Minuten bei 28 Grad Celsius ruhen, bevor die Aufnahme erfolgt. Hier ist eine Skizze, die zwei unabhängige synaptische Eingänge als S eins und S zwei zu derselben neuronalen Population zeigt. Der S-eins-Weg wurde verwendet, um LTP auszulösen, während der S-zwei-Weg als Kontrolle diente.Dies sind die Beispiel-F-E-P-S-P-Spuren, die kurz vor der LTP-Induktion aufgezeichnet wurden (rote Spuren) und eine Stunde nach der LDP-Induktion (blaue Spuren). Hier sind die F-EPSPs aus einem vollkommen gesunden Schnitt und hier die F-EPSPs aus einem Schnitt mit hohem Erregbarkeitsniveau, wenn die Schnitte nicht vollkommen gesund sind. Polysynaptische Antworten werden beobachtet, und die Steigungspotenzierung der F-E-P-S-P ist vermindert.Hier ist ein Vergleich der Zeitverläufe der F-E-P-S-P-Steigung nach LTP, hervorgerufen durch eine einzelne Hochfrequenzstimulationsreihe, die in unserem Labor 2005, 2010 und 2011 aufgezeichnet wurden. Die ersten Experimente wurden 2005 durchgefürt und sind durch ausgefüllte Kreise gekennzeichnet. Spätere Aufzeichnungen, gekennzeichnet durch ausgefüllte Quadrate, profitierten von einem verbesserten Dissektionsverfahren.Die aktuellen Ergebnisse ergeben sich aus der Optimierung der Sauerstoffversorgung an der Grenzfläche und der Temperaturregelung sowie aus der Elektrodenstandardisierung, wie durch offene Kreise angegeben. Hier zeigen wir, dass eine Erhöhung der Sauerstoffdurchflussrate im Wasserbad unterhalb der Ableitungskammer von 0,15 auf 0,25 Liter pro Minute, wie durch die blaue Kurve angegeben, eine Abnahme der F-E-P-S-P-Steigung um 20 % bei einer Temperaturerhöhung von 28 auf 29 Grad Celsius bewirkt. Wie angegeben, führt die grüne Kurve zu einer Erhöhung der F-E-P-S-P-Steigung um mehr als 50 %.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass jeder Schritt entscheidend ist und Fehler im Protokoll zu unterschiedlichen Ergebnissen führen können. Nach dem Anschauen dieses Videos werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine sehr stabile langanhaltende Potenzierung erhält. Ableitung in akuten hippocampalen Schnitten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Herstellung von Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für die Untersuchung der synaptischen Veränderungen mit Gehirn Altern und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit.

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

Dieser Videoartikel beschreibt experimentelle Verfahren zur Untersuchung der Langzeitplastizität und ihrer assoziativen Prozesse wie synaptisches Tagging, Capture und Cross-Tagging in den CA1-Pyramidenneuronen unter Verwendung von akuten Hippocampusschnitten von Nagetieren.

Untersuchung von Synaptic Tagging / Erfassung und Lang Capture mit akuten Schnitten des Hippocampus von Nagetiere

Dieses Protokoll veranschaulicht die Implementierung einer optimierten N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) schützende Wiederherstellungsmethode der Gehirn-Scheibe-Vorbereitung. Eine einziges Medium Formulierung wird verwendet, um Tiere jeden Alters und für verschiedenste experimentelle Anwendungen zuverlässig gesunde Gehirnscheiben einzuholen.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

Dieses Protokoll beschreibt die Stabilisierung der Sauerstoffgehalt in einem kleinen Volumen der recycelten Puffer und methodischen Aspekten der Aufnahme aktivitätsabhängige synaptische Plastizität in getauchten akute hippocampal Scheiben.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Wir verwendeten Aufnahme- und Stimulationselektroden in Längs-Hippocampus-Gehirnscheiben und längs positionierten Aufnahme- und Stimulationselektroden im dorsalen Hippocampus in vivo, um extrazelluläre postsynaptische Potenziale zu evozieren und langfristige synaptische Plastizität entlang des Längsinterlamellars CA1.

Untersuchung der langfristigen synaptischen Plastizität im Interlamellar Hippocampus CA1 durch elektrophysiologische Feldaufzeichnung

Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Transport und die Vorbereitung von resektiertem menschlichen Hippocampusgewebe mit dem ultimativen Ziel, lebenswichtige Hirnscheiben als präklinisches Bewertungsinstrument für potenzielle antiepileptikatische Substanzen zu verwenden.

Vorbereitung von akuten menschlichen Hippocampusscheiben für elektrophysiologische Aufnahmen

Dies ist ein Protokoll zur akuten Scheibenpräparation von erwachsenen und alternden Maus Hippocampi, die Vorteile der transkardialen Perfusion und Schneiden schneiden mit eiskalten NMDG-aCSF nutzt, um hypoxische Schäden am Gewebe zu reduzieren. Die resultierenden Scheiben bleiben über viele Stunden gesund und eignen sich für Langzeit-Patch-Clamp- und Field-Recordings.

Minimierung der Hypoxie in Hippocampal Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von horizontalen Hippocampus-entorhinalen Kortex-Scheiben (HEC) von Mäusen, die eine spontane scharfe Wellenwelligkeit saufen. Slices werden in einer vereinfachten Grenzraum-Haltekammer inkubiert und Aufnahmen werden unter getauchten Bedingungen mit schnell fließender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchgeführt, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes und die spontane Entstehung von Netzwerkaktivität zu fördern.

Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Lernen Sie die optimierte Präparation akuter Hippocampus-Slices von Mäusen für stabile Langzeit-Potenzierungs-Erfassungen über acht Stunden. Diese Methode erreicht eine Erfolgsrate von 95 Prozent und ermöglicht reproduzierbare elektrophysiologische Studien zur synaptischen Plastizität.

Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung (Video) | JoVE Journal

Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung

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