Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung

Dieser Beitrag stellt eine komplette Methode für die Vorbereitung und die Erhaltung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine sehr stabile und reproduzierbare Langzeitpotenzierung in akuten Hippocampus-Schnitten aufzeichnen zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn der Maus extrahiert und der Hippocampus in kaltem A-Liquor unter dem Mikroskop seziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, quer verlaufende Hippocampus-Scheiben mit einem Gewebehäcksler zu schneiden.

Als nächstes wird die Scheibe in die Grenzflächenaufzeichnungskammer gelegt, die mit sauerstoffhaltiger künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit durchblutet wird. Der letzte Schritt besteht darin, die Elektroden zu platzieren und die synaptische Aktivität in der CA-Region des Hippocampus aufzuzeichnen. Letztendlich wird ein Protokoll der hochfrequenten Stimulation verwendet, um die Induktion einer sehr stabilen Langzeitpotenzierung zu zeigen.

Durch diese Methode kann ein Einblick in den Mechanismus gegeben werden, der der synaptischen Plastizität zugrunde liegt. Es kann auch auf andere Systeme wie Tiermodelle des neurodegenerativen oder Nervensystems oder auf Immunerkrankungen angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da alle Manipulationen großes Geschick und viel Übung erfordern.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie den Perfusionskreislauf mindestens 20 Minuten lang mit destilliertem Wasser spülen. Schalten Sie dann die Heizungsanlagen ein. Starte den Carbogen blubbernd in der Runde.

Der Carbogen wird durch Luftdurchlässe in das Wasserbad unterhalb der Aufnahmekammer gefördert. Als nächstes kontrollieren Sie die Durchflussmenge im Wasserbad mit einem Durchflussmesser Anschließend entleeren Sie den Kreislauf und füllen ihn mit gefiltertem A CSF-Klopf, um die Blasen zu entfernen. Platzieren Sie dann den Ring, der die Scheibe stützt, in der Haltekammer.

Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen aus dem Kreislauf. Stellen Sie dann mit der Schraube der Saugnadel den A-Liquorwert in der Aufnahmekammer ein, die Drehzahl der Einlasspumpe wird auf ein Milliliter pro Minute und die Auslasspumpe auf fünf Milliliter pro Minute eingestellt. Bereiten Sie vor der Dissektion alle chirurgischen Instrumente vor.

Um das Gehirn einer geopferten Maus zu entfernen. Halten Sie seinen Kopf mit Zeigefinger und Daumen fest und machen Sie mit der Präparierschere einen Schnitt in der Mitte der Oberseite des Kopfes, beginnend am Rand der Guillotine, schneiden Sie und verlaufen Sie bis zum Stirnbein. Schneiden Sie als Nächstes durch den Hautmuskel auf jeder Seite des Kopfes, um die Schädelplatten vollständig freizulegen.

Entfernen Sie dann die Muskeln an der verwöhnten Seite des Kopfes. Anschließend den Schläfenmuskel auf jeder Seite entlang der Schläfenplatte durchtrennen. Schneide dann die Frontplatten in der Mitte quer ein.

Machen Sie nun einen kleinen Schnitt am Hinterhauptbein zwischen den beiden Platten. Schneiden Sie an jeder Seite an der verhätschelten Basis der Hinterhauptplatten ein. Schneiden Sie dann mit der Federschere entlang der sagittalen Naht.

Entfernen Sie zum Schluss den Schädel, indem Sie die Hälften mit einer Pinzette voneinander weg spreizen. Nun mit dem Skalpell kurz vor dem Kleinhirn und kurz nach dem Riechkolben schneiden, dann quer das entnommene Gehirn mit kaltem A CSF in die Präparierschale überführen. Sobald das Gehirn in der Präparierschale zum Vorschein kommt, trennen Sie die beiden Hemisphären mit einem Skalpell, das in der Mitte unter einem binokularen Operationsmikroskop eingeführt wird, und spreizen Sie vorsichtig die Struktur einer Hemisphäre, um den lateralen Ventrikel freizulegen.

Entfernen Sie den Hirnstamm und das Kopftuch, indem Sie einen Spatel auf die frontale Rinde und den anderen Spatel auf das Kopftuch legen. Achten Sie darauf, den Hippocampus nicht mit dem Spatel zu berühren und ihn während des Gewebeschnitts nicht zu dehnen. Trennen Sie danach den Fornix.

Schieben Sie dann den Hippocampus vorsichtig aus der Hirnrinde, indem Sie einen Spatel in die Herzkammer einführen. Wenn der Hippocampus extrahiert ist, entfernen Sie überschüssiges kortikales Gewebe und verbleibende Blutgefäße mit einer Weidepipette aus Kunststoff. Übertragen Sie den Hippocampus in einem Löffel mit seiner Alvi-Oberfläche nach oben auf die Plattform des Zerkleinerers.

Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer handelsüblichen Weidepipette aus Kunststoff aus dem Löffel. Kippen Sie danach den Löffel senkrecht nach oben und berühren Sie fast das Filterpapier auf dem Zerkleinerer. Lassen Sie den Hippocampus fallen, indem Sie das Filterpapier schnell berühren.

Ziehe dann den Löffel heraus. Richten Sie als Nächstes den Hippocampus aus und schneiden Sie ihn in Scheiben. Quer auf 400 Mikrometer mit dem Zerkleinerer.

Führen Sie den Vorgang so schnell wie möglich durch. Anschließend entfernst du das Filterpapier mit den Hippocampus-Scheiben und wickelst es um den Metallzylinder, um die Scheiben etwas zu verteilen. Befreien Sie dann die Scheiben mit Sprays von A CSF mit einer handelsüblichen Pastoralpipette aus Kunststoff und sammeln Sie sie in einer mit Kälte gefüllten Petrischale.

Ein Liquor. Übertragen Sie die ausgewählte Schicht mit einer Standard-Plastikpipette in die Aufnahmekammer. Lassen Sie die Scheibe sich in der Aufnahmekammer bei 28 Grad Celsius von dem Präpariertrauma erholen.

Wenn der Slice sinkt, senken Sie den A-CSF-Pegel auf den Slice-Pegel ab, und erhöhen Sie den A-CSF-Pegel erneut, um den Slice schweben zu lassen. Richten Sie danach die Scheibe an der Position aus, die die Positionierung der Elektroden in der CA One-Region erleichtern würde. Hören Sie auf, den A-CSF-Pegel zu senken, wenn er sich an der Schnittstelle befindet.

Der Meniskus des Mediums um die Scheibe ist ein Hinweis auf einen ausreichenden Gehalt an A-Liquor. Das Netz muss mit Medien gesättigt, aber nicht vollständig untergetaucht sein. Halten Sie dann die Kammer mit Filterpapier über dem perforierten Deckel abgedeckt.

Lassen Sie die Scheibe vor der Aufnahme mindestens eine Stunde und 30 Minuten bei 28 Grad Celsius ruhen. Hier ist ein Sketch, der zwei unabhängige synaptische Eingaben als eins und S zwei für dieselbe neuronale Population zeigt. Der eine Signalweg S wurde zur Induktion von LTP verwendet, während der zweite Signalweg als Kontrolle fungierte.

Dies sind die Proben-F-E-P-S-P-Spuren, die kurz vor der LTP-Induktion aufgezeichnet wurden, wie durch die roten Spuren und eine Stunde nach der LDP-Induktion, gekennzeichnet durch die blauen Spuren. Hier sind die F-EPSPs von einer vollkommen gesunden Scheibe, und hier sind die F-EPSPs von einer Scheibe, die ein hohes Maß an Erregbarkeit aufweist, wenn die Scheiben nicht vollkommen gesund sind. Es werden synaptische Reaktionen der Polys beobachtet und die Steigungspotenzierung von F-E-P-S-P wird reduziert.

Hier ist ein Vergleich der Zeitverläufe der F-E-P-S-P-Steigung nach LTP, die durch einen einzelnen Zug hochfrequenter Stimulation induziert wurden, der in den Jahren 2005, 2010 und 2011 in unserem Labor aufgezeichnet wurde. Erste Experimente wurden im Jahr 2005 aufgezeichnet, angedeutet durch gefüllte Kreise. Nachfolgende Aufnahmen, die durch gefüllte Quadrate angezeigt wurden, profitierten von einem verbesserten Präparierverfahren.

Die aktuellen Ergebnisse ergeben sich aus der Optimierung der Grenzflächenoxygenierung und der Temperaturregelung sowie der Elektrodenstandardisierung, die durch offene Kreise angezeigt wird. Hier zeigen wir, dass eine Erhöhung des Sauerstoffflusses im Wasserbad unter der Aufzeichnungskammer von 0,15 auf 0,25 Liter pro Minute, wie durch die blaue Kurve angezeigt, eine Verringerung der F-E-P-S-P-Steigung um 20 % bewirkt und die Temperatur von 28 auf 29 Grad Celsius erhöht. Wie angedeutet, induziert die grüne Kurve eine Erhöhung der Steigung F-E-P-S-P um mehr als 50 %.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jeder Schritt entscheidend ist und Fehler im Protokoll zu unterschiedlichen Ergebnissen führen können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine sehr stabile Langzeitpotenzierung erzielen können. Aufzeichnung in akuten Hippocampusschnitten.