Name: Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Lernen Sie die Intravitalmikroskopie zur Analyse der Stammzell-Endothel-Interaktionen in der Mikrozirkulation des M. cremaster bei der Maus. Diese Methode ermöglicht die quantitative Erfassung der peripheren Stammzellmigration in vivo.

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Das gesamte Protokoll nach der Zellisolation dauert ca. 2 Stunden. 1. Mikrochirurgische Vorbereitung <ol><li> Führen Stammzellen isoliert von der Spender-Knochenmark-und Fluoreszenzmarkierung der isolierten Subpopulation nach standardisierten Protokollen 9,12 sodass die Zellen während der Zeit der Tieroperation durchgeführt ruhen. Für die Fluoreszenzmarkierung empfehlen wir CFDA (Carboxyfluoresceindiacetat succinimidylester). </li><li> Betäuben einer männlichen Maus mit einem Gewicht von 20-25 g mit Ketamin (75 mg / kg) und Xylazin (2,5 mg / kg). Während der chirurgischen Verfahren und Versuchsprotokolle sollten Anästhesie durch Ergänzungen erhalten werden (10% der anfänglichen Injektion ip) nach Bedarf (in der Regel alle 30-60 min). </li><li> Rasur sanft die Vorderseite des rechten Hodensack sowie den rechten Oberschenkel und Leiste. Sammeln Sie alle verlieren Haare mit einem angefeuchteten Wattestäbchen. Platzieren Sie die Maus Bauchseite nach oben auf einem Plexiglas-Sicht Bühne und fixieren Sie die Gebührt mit elastischem Tuch. Die Bühne ist maßgeschneidert, bestehend aus einer Grundplatte und einer zweiten Platte am kaudalen Rand der Grundplatte für die Erhebung beider Beine und Hodensack. Zeigen die Bühne auf einem Heizkissen auf Körpertemperatur bei 37 ° C zu halten Nach der Fixierung auf die Bühne, legen Sie das Tier unter einem Operationsmikroskop und die folgenden Arbeitsschritte unter Verwendung von 10 - bis 16-facher Vergrößerung. </li><li> Machen Sie den ersten Schnitt mit Haut Schere am rechten Oberschenkel, nur der vordere Oberschenkelgefäße vom Knie bis in die Leistengegend. </li><li> Identifizieren Sie die Oberschenkelarterie und folgen ihm proximal mobilisiert die Arterie von Weichgewebe umgeben. Identifizieren und schneiden Sie ein großer Ast auf den linken Hoden mit Thermokauter. Danach legen Sie einen Aufenthalt Naht oberflächlich am linken Hoden. Sanfte Traktion weiter proximal Mobilisierung der Oberschenkelarterie zu erleichtern. </li><li> Nach Abschluss des proximalen Mobilisierung, zu identifizieren und schneiden eine große Filiale läuft MEDIALLy am Oberschenkel von Thermokauter. Danach ligieren die Femoralarterie in den distalen Teil des rechten Oberschenkels. Sanfte Traktion auf der Ligatur wird Hilfe weitere Vorbereitung. </li><li> Drehen Sie nun die Aufmerksamkeit auf den proximalen Arteria femoralis wieder und legen Sie eine Naht um die Arterie so proximal wie möglich. Bereiten Sie einen Knoten, sondern binden Sie es nicht noch nach unten. Bewerben leichten Zug an der Naht, und erstellen Sie eine arterielle Knicken. </li><li> Nach der Gründung der Knicken einzuschneiden die Arterie vorsichtig mit einem microscissor. Achten Sie besonders darauf, die Vena femoralis beschädigen. </li><li> Legen Sie eine vorbereitete Mikrokatheter (Innendurchmesser 0,28 mm) über den Schnitt. Der Katheter muss entlüftet werden (0,9% Natriumchlorid, NaCl) und mit einer 1 ml Spritze vor Einsetzen verbunden. </li><li> Nach erfolgreicher Einführung des Katheters vorsichtig den Knicken zu lösen, um den Durchgang des Katheters zu erleichtern. Arterielle Blutfluss innerhalb des Katheters sofort sichtbar sein. Sanft voran der Katheter ein paar Millimeters über die bisherige Knicken. Danach binden Sie die vorbereitete Ligatur zur Fixierung des Katheters. </li><li> Spülen Sie vorsichtig den Katheter (0,9% NaCl) und saugen, um die korrekte Position zu bestätigen. Verwenden Sie ein Stück Klebeband, um weiter zu sichern, den Katheter in die Betriebsphase. </li><li> Nach ausreichender Fixierung, setzen Sie den Katheter beiseite für die folgenden Schritte zur Vorbereitung der Cremaster-Muskel. Bewerben regelmäßige Spülung und Aspiration des Katheters alle 5-10 min, um die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern. </li><li> Drehen Sie nun die Aufmerksamkeit auf die rechte Hodensack und einen Einschnitt durch Schneiden der Haut und Faszie über dem ventralen Aspekt der rechten Hodensack. Achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe mit allen Instrumenten berühren. </li><li> Erweitern der Einschnitt bis zur Leistenbeuge und kaudal zu dem distalen Ende des Hodensacks. </li><li> Sorgfältig separaten zugrunde liegenden weich und Bindegewebe über dem Cremaster Sack, ohne es zu berühren. Identifizieren Sie das distale Ende des Cremaster und legen hier einen Aufenthalt Naht an slightly verlängern die Muskeln. Resezieren jetzt noch weiche Gewebe unter der Muskel-Sack durch leichtes Ziehen die Muskeln kaudal und anterior. </li><li> Nach der vollständigen Trennung von Bindegewebe, öffnen Sie den Cremaster-Sack an einem Punkt auf der Schädel Rand mit einer Schere. Erweitern Sie den Schnitt von dieser Öffnung nach unten bis zum distalen Ende des Muskels. </li><li> Verschließen Sie den kleinen Schiff verbindet den Hoden und der Cremaster mit Thermokauter, danach schneiden Sie die verbleibenden Verbindungen zwischen Muskel und Hoden mit einer Schere. </li><li> Beiseite legen den Hoden, aus dem Bereich der Mikroskopie. </li><li> Die geöffnete Cremaster legt nun flach auf der Bühne. Legen Sie vier 6-0 Prolene Haltefäden an den Rändern des Gewebes und befestigen Sie sie mit elastischen Tuch um den Cremaster-Muskel-Gewebe ausbreiten. Von nun an ständig befeuchten das Gewebe mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) unter Verwendung einer 1 ml Spritze (Abbildung 1). </li><li> Jetzt erlauben die Vorbereitung zur Ruhe für 15 min. Danach spritzen0,05-0,1 ml 1% Rhodamin-Dextran über die linke Oberschenkelarterie zur Kontrastverstärkung des Mikrogefäßsystems. Falls Chemokine oder entzündungshemmende Mittel sind für den Einsatz geplant, sollten Sie jetzt topisch befeuchten den Muskel mit der jeweiligen Reagens unter Verwendung einer 1 ml Spritze. Im Falle eines Kontrollversuchs, weiterhin Befeuchten mit PBS. </li></ol> 2. Intravitalmikroskopie <ol><li> Halten Sie das für den Betrieb der Bühne fixiert Maus und bewegen sich unter einem Fluoreszenzmikroskop für Auflicht-Beleuchtung modifiziert und auf eine CCD (Charge-Coupled Device)-Videokamera verbunden. Achten Sie besonders darauf, den Oberschenkelarterienkatheter verrenken. </li><li> Führen Experimente mit einem Wasserimmersionsobjektiv. </li><li> Nach der Einstellung des Ziel für eine ausreichende Darstellung der Cremaster die Mikrozirkulation und vor der Zellinjektion, stochastisch definieren sechs postkapillären Venolen für die spätere Analyse der Unternehmensstammzellhaftung. </li><li> Verwalten Fluoreszenz-markierten Stammzellen,in 200 ul PBS gelöst, mit 0,4 × 10 6 Zellen pro Injektion, mit insgesamt fünf aufeinanderfolgenden Injektionen unter Verwendung des Oberschenkelarterienkatheter und einer 1 ml-Spritze. Die Zellprobe vor der ersten Injektion vorsichtig schütteln. </li><li> Rekord Stammzellen sofort rollt nach Zellinjektion, wobei die Definition &quot;Rollen&quot; als mehr als 50% Reduktion der Zellgeschwindigkeit entlang der endothelialen Auskleidung in Kombination mit typischen zellulären &quot;Stick and release&quot; Bewegungen. Führen Zählung der Roll Stammzellen und Stammzellen alle Gabe eines vordefinierten venulären Distanz während 1 min Beobachtungs nach jeder einzelnen Injektion. Die Menge der Stammzellwalzen als Prozentsatz aller Durch Zellen exprimiert. Zählen Sie nicht Zellen, die zufällig kurz Tethering Phänomene als Rollzellen. </li><li> Nach der letzten Injektion Zelle bestimmen die Anzahl der festhaftenden Stammzellen durch Zählen und drücken die Menge im Verhältnis zu der berechneten endothelialen Oberfläche the sechs vordefinierten Venolen (Durchmesser x Länge x π) als adhärenten Zellen / mm 2. Firm Haftung gilt, wenn kein Zellbewegung ist für 30 Sekunden nachweisbar. </li><li> Nach Abschluss der Intravitalmikroskopie vorsichtig den M. cremaster und speichern sie in Übereinstimmung mit späteren Analyse (Immunhistochemie und Molekularbiologie). Sacrifice das Tier durch Genickbruch. Die Analyse der Intravitalmikroskopie-Aufnahmen für die Quantifizierung der Stammzellroll und fest endotheliale Adhäsion, sowie mikrovaskuläre Hämodynamik, wie rote Blutkörperchen Geschwindigkeit (mm / s), der Schiffslänge (um), Gefäßdurchmesser (um), Wandanteil Rate (s -1); sollte offline von einem Ermittler auf die jeweilige experimentelle Gewebebehandlung mittels eines Bildverarbeitungssoftware blind durchgeführt werden. </li></ol>

<ol><li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li>
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</ol>

Alle Tierversuche, für dieses Manuskript durchgeführt wurden, von der lokalen Tierpflege und die Nutzung genehmigt worden. Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

<html> Intravitalfluoreszenzmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung und quantitative Analyse der Stammzell-Endothel-Interaktionen. Der Cremaster-Muskel-Modell ist besonders nützlich, da mikrochirurgischen Techniken Intravital Belichtung und Visualisierung haben sich etabliert in der Forschung auf Leukozyten-Endothel-Interaktionen und verschiedenen chemischen Komponenten können durch einfache Superfusionstechnik selektiv an das Zielgewebe angewendet werden. Aufgrund der Abwesenheit von Bewegungsartefakten und sc...

Der Zweck dieses Artikels ist es, die Technik der Intravitalmikroskopie (IVM) auf der Maus Cremaster Mikrozirkulation für die direkte Beobachtung und Analyse der peripheren Knochenmark-Stammzellen angewendet Migration zu beschreiben. Das aktuelle Konzept der Stammzell Gewebe-und Organregeneration beinhaltet die Homing von Knochenmark-Stammzellen in die verletzte Gewebe ein. Ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche Stammzell-Migration beinhaltet die Stammzell Interaktion mit der lokalen Endothel innerhalb des verletzten Organ, gefolgt von transendotheliale Migration und schließlich Organ Transplantation 2. Intravital Analyse dieser Stammzellen - Endothelzell-Interaktionen bildet einen idealen Parameter für die Quantifizierung einer Stammzellregenerationsreaktion in verschiedenen pathophysiologischen Einstellungen in vivo. Ferner erscheint es denkbar, dass in der Zukunft, intravital Analyse der Migrationsfähigkeit spezifischer Stammzellen populations innerhalb der Mikrozirkulation standardisierten Umgebungen kann angewendet werden, bevor fort diese Bevölkerungs weitere klinische Tests. Intravitalmikroskopie wurde ursprünglich für die Beobachtung und Quantifizierung der Leukozyten-Endothel-Zell-Wechselwirkung in vivo im Bereich der Entzündungsforschung 3 entwickelt. Erste erfolgreiche Aufnahmen von Intravitalmikroskopie Studien wurden von Cohnheim bereits im 19. Jahrhundert berichtet, Studium Froschzungen und Gekröse unter einem Lichtmikroskop 4. Seit seinem ersten Einsatz IVM hat eine enorme technische Entwicklung durchgemacht und ist heute bestimmte wesentliche Komponenten bilden Voraussetzungen, um quantitative IVM durchführen: (i) Gewebezubereitungen, die optischen Zugang zu ermöglichen, (ii) molekulare Sonden, die mit einem Mikroskop erkannt werden können, (iii ) ein Mikroskop, um ein Detektionssystem und (iv) Computer-basierte Analyse-Systeme, die interessierenden Parameter aus den Bilddaten zu extrahieren anschließbarSet 4. Eine Vielzahl von Gewebepräparationen für IVM Studien einschließlich der Mesenterien und Leber der Maus und der Ratte 5, den Rückenhautkammern 6 der Maus und Hamster, Kaninchenohr und der Hamsterbackentasche ein paar zu nennen eingeführt. Doch im folgenden werden wir auf der Maus Cremaster-Muskel, was eine ideale Gewebe für die Intravital Beobachtungen zu konzentrieren, als Vorbereitung und Visualisierung von einem gut standardisierten chirurgischen Eingriff möglich ist, und in der Regel keine Probleme von Bewegungsartefakten kommen. Die offene Cremaster-Muskel-Präparat wurde zum ersten Mal in den 1970er Jahren von Baez Kollegen und 7 durchgeführt. Ursprünglich für Ratten beschrieben, wurde auch erfolgreich auf die Maus 8 angenommen. Nach früheren Studien hatte vor allem auf Leukozyten-Interaktionen mit der Gefäßwand konzentriert, vor kurzem unsere eigene Gruppe die Maus Cremaster-Muskel-Präparat als BewertungsBLE Werkzeug für die direkte Visualisierung und quantitative Analyse der Stammzell-Endothel-Interaktionen innerhalb einer definierten Mikro 9. Verschiedene Stammzellpopulationen untersucht die Verwendung dieses Modells, einschließlich murinen c-kit + Knochenmarkstammzellen und mesenchymale Stammzellen, sowie Menschen CD 133 + Knochenmarkstammzellen 10-12. Nach der Zellisolation aus Spender-Knochenmark-und Fluoreszenzmarkierung zur Anzeige, werden die Stammzellen selektiv in die Cremaster Mikrozirkulation unter Verwendung eines arteriellen Injektion über die Oberschenkelarterie eingesetzt, wodurch jede Zelle Einschließen in entfernte Organe vermieden. Darüber hinaus ist der Cremaster-Muskel-Modell besonders nützlich, da verschiedene Chemokine potenziell Vermittlung lokalen Stammzellmigration innerhalb der jeweiligen Einstellungen können lokal auf dem Zielgewebe durch einfache Superfusionstechnik angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Carboxy-fluorescein-diacetat succinimidylester (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin 6 g (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, München, Deutschland</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlin, Deutschland</td><td>nicht verfügbar</td><td></td></tr><tr><td>Xylacin (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Deutschland</td><td>nicht verfügbar</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat - gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Deutschland</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

intravitalmikroskopie der mikrozirkulation in der maus cremaster-muskel für die analyse der peripheren stammzell migration

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In der Ära der intravaskulären Zellanwendungsprotokolle im Rahmen der regenerativen Zelltherapie, die zugrunde liegenden Mechanismen der Stammzellmigration, um Gewebe nonmarrow nicht vollständig geklärt. Wir beschreiben hier die Technik der Intravitalmikroskopie an der Maus Cremaster Mikrozirkulation für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellmigration in vivo angewendet. Intravitalmikroskopie des M. cremaster zuvor im Bereich der Entzündungsforschung für die direkte Beobachtung der Leukozyten-Wechselwirkung mit dem vaskulären Endothel eingeführt. Da eine ausreichende Umfangs Stamm-und Vorläuferzellmigration umfasst ähnliche anfänglichen Schritte entlang rollen und feste Haftung am Endothel es denkbar, den M. cremaster Modell für die Beobachtung und Quantifizierung der Wechselwirkung intravasculary verabreicht Stammzellen mit dem Endothel anzuwenden. Verschiedene chemische Komponenten selektiv an das Ziel t aufgetragen werdenProblem durch einfache Superfusionstechniken ist es möglich, wesentliche Voraussetzungen für die Mikroumgebungs ersten Stammzellrekrutierung, um in einem lebenden Organismus außerhalb des Knochenmarks nehmen zu etablieren.

Im allgemeinen Zusammenspiel von direkt eingespritzt Stamm-oder Vorläuferzellen mit dem vaskulären Endothel innerhalb der M. cremaster Mikrozirkulation ist ein seltenes Ereignis und tritt ausschließlich in postkapillären Venolen (Durchmesser: 30 bis 80 um). Aufgrund Fluoreszenzmarkierung Walzen und fest haftenden Stammzellen deutlich getrennt von zirkulierenden endogenen Leukozyten in den Venen beobachtet (Fig. 2) quantifiziert werden. Die Mikrozirkulationsbedingungen durch ...

Intravitalmikroskopie der Maus M. cremaster Mikrozirkulation bietet eine einzigartige und in-vivo-Modell für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellen Migration gut standardisiert.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Interaktionen zwischen Stammzellen und endothelialen Zellen in vivo zu visualisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Katheterisierung der Arteria femoralis bei einem sedierten Tier für den intraarteriellen Zugang vorgenommen wird. Im zweiten Schritt wird der Musculus gastrocnemius chirurgisch für die intravitale Fluoreszenzmikroskopie präpariert.Anschließend wird die Population der gewünschten Stammzellen über einen Katheter in die Arteria femoralis injiziert. Letztendlich können die Wechselwirkungen zwischen den adoptiv übertragenen Stammzellen und dem Endothel der Mikrozirkulation des Hauptmuskels sichtbar gemacht und quantifiziert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, beispielsweise wie die Migration therapeutisch verabreichter Stammzellen innerhalb eines lebenden Organismus reguliert ist.Bevor die Mikrochirurgie D Luft beginnt, einen Katheter an eine Ein-Milliliter-Spritze mit 0,9 % Natriumchlorid anschließen. Anschließend die vordere Seite des rechten Skrotums sowie den rechten Oberschenkel und Leistenbereich eines 20 bis 25 Milligramm anästhesierten männlichen Mäusen vorsichtig rasieren. Alle losen Haare mit einem angefeuchteten Wattestäbchen aufsammeln und dann die Maus mit der Bauchseite nach oben auf eine aus Plexiglas gefertigte, speziell angefertigte Beobachtungsplattform legen, die aus einer Grundplatte und einer zweiten Platte an der gewölbten Kante der Grundplatte besteht, um beide Hinterbeine und das Skrotum anzuheben.Nachdem die Füße mit einem elastischen Tuch fixiert wurden, stellen Sie den Präparationsplatz auf eine Heizplatte, um die Körpertemperatur des Tieres bei 37 Grad Celsius zu halten. Verwenden Sie dann ein Stereomikroskop und eine Schere bei 10- bis 16-facher Vergrößerung, um einen initialen Schnitt am rechten Oberschenkel knapp vor den femoralen Gefäßen von der Kniegegend bis zur Leiste anzulegen. Identifizieren Sie die Arteria femoralis und verfolgen Sie sie proximal, wobei Sie die Arterie vom umgebenden Weichgewebe lösen.Danach mithilfe einer thermischen Kauterisierung einen großen arteriellen Zweig, der zur linken Hoden führt, identifizieren und durchtrennen. Eine sechsfache Prolen-Naht vorübergehend oberflächlich am linken Hoden anbringen. Danach den großen arteriellen Zweig, der medial am Oberschenkel verläuft, identifizieren und mit thermischer Kauterisierung verschließen.Als Nächstes ligieren Sie unter sanfter Zugkraft die femorale Arterie im distalen Teil des rechten Oberschenkels und legen anschließend einen Faden um die proximale femorale Arterie so nah wie möglich an der Körpermitte des Tieres an. Legen Sie nun einen lockeren Knoten um die femorale Arterie, ziehen Sie ihn jedoch noch nicht fest. Anschließend wird sanfter Zug auf den Faden ausgeübt, um eine arterielle Knickung zu erzeugen.Nachdem die Verknotung hergestellt wurde, die Arterie mit einer feinen Schere vorsichtig freilegen, wobei besondere Vorsicht geboten ist, um die Vena femoralis nicht zu beschädigen. Anschließend den zuvor vorbereiteten Mikrokatheter in den Einschnitt einführen. Die Verknotung vorsichtig lösen, um das Voranschieben des Katheters zu erleichtern.Der arterielle Blutfluss sollte sofort im Katheter sichtbar sein. Führen Sie den Katheter langsam einige Millimeter über die vorherige Knickstelle hinaus fort. Danach befestigen Sie die vorbereitete Ligatur zur Fixierung des Katheters.Spülen Sie den Katheter nun vorsichtig mit Natriumchlorid und aspirieren Sie anschließend die Lösung, um die korrekte Position des Katheters zu bestätigen. Sichern Sie den Katheter mit einem Stück Klebeband zusätzlich am Operationsständer. Nachdem der Katheter ausreichend fixiert und zur Seite gelegt wurde, schneiden Sie die Haut und die Faszie über der ventralen Seite des rechten Skrotums auf.Dabei darauf achten, das darunterliegende Gewebe mit keinerlei Instrumenten zu berühren. Den Schnitt bis zur Leistenfalte und kaudal bis zum distalen Ende des Skrotums verlängern. Anschließend vorsichtig das darunterliegende weiche und Bindegewebe oberhalb des Tunica-cremaster-Sacks trennen, ohne das Gewebe selbst zu berühren.Danach platzieren Sie eine Sechser-Prolen-HalteNaht am distalen Ende des Musculus cremaster, um den Muskel leicht zu dehnen. Ziehen Sie anschließend den Muskel vorsichtig kaudal und anterior, um das darunterliegende Weichgewebe zu entfernen. Nach vollständiger Trennung vom Bindegewebe öffnen Sie mit einer Schere den Cremaster-Sack am kranialen Rand und verlängern den Schnitt von dieser Öffnung bis zum distalen Ende des Muskels.Nachdem das kleine Gefäß, das den Hoden am Musculus cremaster befestigt, thermisch kauterisiert wurde, schneiden Sie die verbleibenden Verbindungen zwischen Muskel und Hoden mit einer Schere durch. Der geöffnete Cremaster liegt nun flach auf der Unterlage. Bringen Sie nun vier Halte-Nähte aus Sechser-Prolen an den Rändern des Gewebes an und fixieren Sie diese mit der elastischen Abdeckung.Um das Cremastermuskelgewebe ab diesem Punkt zu spreizen, befeuchten Sie das Gewebe kontinuierlich mit PBS unter Verwendung einer Ein-Milliliter-Spritze. Nach einer Ruhezeit der Präparation von 15 Minuten injizieren Sie 0,05 bis 0,1 Milliliter 1 %iger Rodin-Dextrin-Lösung über die linke Femoralarterie, um den Mikrogefäßverlauf kontrastreich darzustellen. Bewegen Sie nun die Maus und die Probe unter eine CCD-Kamera (charge coupled device).Videokamera-verbundenes Fluoreszenzmikroskop, modifiziert für Epi-Beleuchtung, unter besonderer Vorsicht, um die Katheterisierung der Arteria femoralis nicht zu verrücken. Nach Justierung des Wasser-Immersion-Objektivs für eine ausreichende Visualisierung der zufällig definierten Mikrozirkulation des chma wurden sechs postkapilläre ES zur späteren Analyse der festen Stammzelladhärenz ausgewählt. Danach eine Ein-Milliliter-Spritze mit 200 Mikrolitern zuvor markierter fluoreszierender Spender-Knochenmark-Stammzellen befüllen.Klopfen Sie vorsichtig auf die Spritze, um die Zellsuspension aufzurühren, und verabreichen Sie anschließend die Zellen in 40 Mikroliter-Injektionen über einen femoralen Katheter, insgesamt fünf aufeinanderfolgende Injektionen. Zeichnen Sie das Rollverhalten der Stammzellen unmittelbar nach der Injektion auf. Definieren Sie das Rollen als eine Reduktion der Zellgeschwindigkeit entlang der endothelialen Auskleidung um mehr als 50 % in Kombination mit den typischen zellulären Anheftungs- und Freisetzungs­bewegungen.Nach Abschluss der intravitale Mikroskopie den Musculus cremaster vorsichtig entfernen und für spätere Analysen aufbewahren. Im Allgemeinen ist die Interaktion direkt injizierter Stamm- oder Vorläuferzellen mit der vaskulären Endothelzellschicht innerhalb der Mikrozirkulation des Musculus cremaster ein seltenes Ereignis und tritt aufgrund der fluoreszenten Markierung ausschließlich in den postkapillären Venulen auf. Die rollenden Zellen, gekennzeichnet durch den schwarzen Pfeil, und die fest adhärenten Stammzellen, gekennzeichnet durch die weißen Pfeile, können deutlich von den zirkulierenden endogenen Leukozyten in den Venulen unterschieden werden.Die mikrozirkulären Bedingungen, die durch die Blutflussgeschwindigkeit und die Wandscherrate repräsentiert werden, unterscheiden sich in der Regel nicht signifikant zwischen den jeweiligen Versuchsgruppen mit unterschiedlicher Chemokinbehandlung. Eine lokale Behandlung des Ker-Master-Muskelgewebes mit verschiedenen Chemokinen oder Mediatoren der entzündlichen Reaktion, beispielsweise dem aus stromalen Zellen abgeleiteten Faktor 1α oder Tumor-Nekrose-Faktor-α, kann spezifische mikroumgebungsbedingte Zustände nachahmen.Derartige Bedingungen verstärken die Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und Endothelzellen in unterschiedlichem Ausmaß, abhängig vom jeweils verwendeten Chemokin oder Mediator sowie von der injizierten Stammzellpopulation. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Stammzell- und Endothelzell-Wechselwirkungen in vivo mittels intravitale Mikroskopie der Mikrozirkulation im CreER-Muskel sichtbar gemacht werden können.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine neue vielseitige Methode zur Beobachtung der Mikrozirkulation wird vorgestellt. Es gilt als geeignet für eine langfristige Beobachtung und für die Kombination mit pharmacophysiological oder molekularbiologische Eingriffe.

In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie

Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

Ein Gewebe Vorbereitung ist für die Visualisierung und experimentelle Manipulation des Lebendigen Mikrozirkulation beschrieben. In narkotisierten männlichen Mäusen ist die dünne, stark vaskularisierten M. cremaster für Intravitalmikroskopie zu mikrovaskulären Netzwerken, einschließlich Arteriolen, Kapillaren und Venolen Studie vorbereitet. Die Zubereitung ist leicht für Ratten und Hamstern angepasst.

Die Maus Cremaster Muscle Vorbereitung Intravital Imaging der Mikrozirkulation

Microiontophoresis bringt Bewegung von Ionen aus einer Mikropipette in Reaktion auf eine Differenz des elektrischen Potentials zwischen den innerhalb und außerhalb der Mikropipette. Biologisch aktive Moleküle sind dabei im Verhältnis zur elektrischen Strom geliefert. Wir illustrieren Acetylcholin microiontophoresis in Verbindung mit Mikromanipulation an Endothel-abhängige Vasodilatation in der Mikrozirkulation zu untersuchen.

Microiontophoresis und Mikromanipulation für Intravital Fluoreszenz-Imaging der Mikrozirkulation

Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

Digitale intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie von postkapillären Venolen in der cremasterica Mikrozirkulation ist eine bequeme Methode, um Einblicke in die Leukozyten-Endothel Interaktion zu...

Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Diese vereinfachte Anwendung der Intravitalmikroskopie von Mesenterialvenen bei Mäusen kann in verschiedenen Entzündungsmodellen verwendet werden, um Leukozyten-Endothel- und Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu beobachten.

Intravitalmikroskopie der Leukozyten-Endothel und Plättchen-Leukozyten-Wechselwirkungen in Mesenterialvenen in Mice

Monozyten sind wichtige Vermittler des Arteriogenesis im Rahmen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Mit einem Basalmembran-wie Matrix und intravitalen Mikroskopie, untersucht dieses Protokoll Monocyte homing und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese nach Monocyte-Injektion in die Femoral Arterie Ligatur Mausmodell.

Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Lernen Sie die Intravitalmikroskopie zur Analyse der Stammzell-Endothel-Interaktionen in der Mikrozirkulation des M. cremaster bei der Maus. Diese Methode ermöglicht die quantitative Erfassung der peripheren Stammzellmigration in vivo.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

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