Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Interaktionen von Stammzell-Endothelzellen in vivo sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Katheter der Oberschenkelarterie in ein sediertes Tier für den intraarteriellen Zugang eingeführt wird. Im zweiten Schritt wird der Chroma-Muskel chirurgisch für die intravitale Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet.

Als nächstes wird die interessierende Stammzellpopulation über den Katheter der Oberschenkelarterie injiziert. Letztendlich können die Wechselwirkungen zwischen den adoptiv übertragenen Stammzellen und dem Endothel der Mikrozirkulation des Mastermuskels sichtbar gemacht und quantifiziert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der regenerativen Medizin zu beantworten, wie z.B. wie die Migration von therapeutisch applizierten Stammzellen innerhalb eines lebenden Organismus reguliert wird.

Vor Beginn der Mikrochirurgie wird ein Katheter mit einer Ein-Milliliter-Spritze mit 0,9% Natriumchlorid verbunden. Rasieren Sie dann vorsichtig die vordere Seite des rechten Hodensacks sowie den rechten Oberschenkel und die rechte Leiste einer 20 bis 25 Milligramm narkotierten männlichen Maus. Sammeln Sie alle losen Haare mit einem angefeuchteten Wattestäbchen und legen Sie dann die Maus mit der Bauchseite nach oben auf einen speziell angefertigten Betrachtungstisch aus Plexiglas, der aus einer Grundplatte und einer zweiten Platte am Kettrand der Grundplatte besteht, um beide Hinterbeine und den Hodensack hochzulegen.

Nachdem Sie die Füße mit einem elastischen Tuch fixiert haben, legen Sie den Tisch auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur des Tieres auf 37 Grad Celsius zu halten. Verwenden Sie dann eine 10- bis 16-fache Vergrößerung, verwenden Sie ein Dissektionsmikroskop und eine Schere, um einen ersten Schnitt am rechten Oberschenkel vorzunehmen, direkt vor den Femurgefäßen vom Knie bis zur Leiste. Identifizieren Sie die Oberschenkelarterie und folgen Sie ihr proximal, wobei Sie die Arterie aus dem umgebenden Weichgewebe mobilisieren.

Identifizieren und schneiden Sie dann mit einem Thermokauter einen großen arteriellen Ast, der zum linken Hoden führt. Legen Sie eine Six-Oh-Prolene-Stay-Naht oberflächlich am linken Hoden an. Identifizieren und kauterisieren Sie dann den großen arteriellen Ast, der medial am Oberschenkel verläuft.

Ligatieren Sie anschließend mit sanfter Traktion die Oberschenkelarterie am distalen Teil des rechten Oberschenkels und legen Sie dann eine Naht um die proximale Oberschenkelarterie so nah wie möglich an der Mitte des Tieres. Legen Sie nun einen losen Knoten um die Oberschenkelarterie, aber binden Sie ihn nicht zusammen. Üben Sie dann einen sanften Zug auf die Naht aus, um einen arteriellen Knick zu erzeugen.

Nachdem Sie den Knick festgestellt haben, verwenden Sie eine Mikroschere, um die Arterie sorgfältig zu dimensionieren, und achten Sie besonders darauf, die Oberschenkelvene nicht zu beschädigen. Führen Sie anschließend den zuvor vorbereiteten Mikrokatheter in den Schnitt ein. Lösen Sie vorsichtig den Knick, um die Passage des Katheters zu erleichtern.

Der arterielle Blutfluss sollte innerhalb des Katheters sofort sichtbar sein. Schieben Sie den Katheter langsam einige Millimeter über das vorherige Knicken hinaus vor. Binden Sie dann die vorbereitete Ligatur zur Fixierung des Katheters fest.

Spülen Sie nun den Katheter vorsichtig mit dem Natriumchlorid und aspirieren Sie dann die Lösung, um die korrekte Position des Katheters zu bestätigen. Verwenden Sie ein Stück Klebeband, um den Katheter weiter an der Operationsstufe zu befestigen. Nachdem der Katheter ausreichend fixiert und zur Seite geschoben wurde, schneiden Sie die Haut und die Faszie oberhalb der ventralen Seite des rechten Hodensacks.

Achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe nicht mit Instrumenten zu berühren. Verlängern Sie den Schnitt bis zur Leistenfalte und kuschelig bis zum distalen Ende des Hodensacks. Trennen Sie dann vorsichtig das darunter liegende Weich- und Bindegewebe oberhalb des Cremaster-Sacks, ohne das Gewebe selbst zu berühren.

Platzieren Sie dann eine Six-Oh-Prolene-Stay-Naht am distalen Ende des Cremasters, um den Muskel leicht zu dehnen. Ziehen Sie dann vorsichtig an den Muskeln und nach vorne, um das verbleibende Weichgewebe unter dem Muskelsack zu resezieren. Nach der vollständigen Trennung vom Bindegewebe wird mit einer Schere der C-Mastersack am Schädelrand geöffnet und der Schnitt von dieser Öffnung bis zum distalen Ende des Muskels verlängert.

Nachdem Sie das kleine Gefäß, das den Hoden am Cremaster verbindet, thermisch kauterisiert haben, schneiden Sie mit einer Schere die restlichen Verbindungen zwischen dem Muskel und dem Hoden durch. Der geöffnete Cremaster liegt nun flach auf der Bühne. Platzieren Sie nun vier sechs oh prolene Stay Nähte an den Rändern des Gewebes und fixieren Sie diese mit dem elastischen Tuch.

Um das cremaster-Muskelgewebe ab diesem Zeitpunkt zu verteilen, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um das Gewebe kontinuierlich mit PBS zu befeuchten. Nachdem das Präparat 15 Minuten geruht hat, injizieren Sie 0,05 bis 0,1 Milliliter 1%iges Rodindextrin über die linke Oberschenkelarterie zur Kontrastverstärkung der Mikrogefäße. Bewegen Sie nun die Maus und stellen Sie sie unter ein ladungsgekoppeltes Gerät.

Fluoreszenzmikroskop mit Videokameraanschluss, modifiziert für die Epi-Beleuchtung, wobei besonders darauf geachtet wird, dass der Katheter der Oberschenkelarterie nicht ausgerenkt wird. Nach Anpassung des Wasserimmersionsobjektivs für eine ausreichende Visualisierung der chma wurden stochastisch sechs postkapilläre ES definiert, um später die Adhärenz der festen Stammzellen zu analysieren. Laden Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze mit 200 Mikrolitern der zuvor markierten fluoreszierenden Spender-Knochenmarkstammzellen.

Klopfen Sie vorsichtig auf die Spritze, um sie wiederzubeleben, suspendieren Sie die Zellsuspension und verabreichen Sie die Zellen dann durch den Femurkatheter in 40-Mikroliter-Injektionen für insgesamt fünf aufeinanderfolgende Injektionen. Erfassen Sie das Rollen der Stammzellen unmittelbar nach der Zellinjektion. Definiert wird das Rollen als eine um mehr als 50%ige Verringerung der Zellgeschwindigkeit entlang der Endothelauskleidung in Kombination mit den typischen zellulären Stick- und Release-Bewegungen.

Nach Abschluss der Intravitalmikroskopie wird der Cremaster-Muskel vorsichtig entnommen und für die spätere Analyse aufbewahrt. Im Allgemeinen ist die Interaktion von direkt injizierten Stamm- oder Vorläuferzellen mit dem vaskulären Endothel innerhalb der Mikrozirkulation des Cremaster-Muskels ein seltenes Ereignis und tritt aufgrund der Fluoreszenzmarkierung ausschließlich in den postkapillaren LES auf. Die rollenden Zellen, wie sie durch die schwarze Pfeilspitze angedeutet sind, und die fest anhaftenden Stammzellen, wie sie durch die weißen Pfeile angedeutet sind, sind deutlich von den zirkulierenden endogenen Leukozyten in den es zu unterscheiden.

Die mikrozirkulatorischen Bedingungen, die durch die Blutflussgeschwindigkeit und die Wandscherrate repräsentiert werden, unterscheiden sich in der Regel nicht signifikant zwischen den jeweiligen Versuchsgruppen mit unterschiedlicher Chemokinbehandlung. Lokale Behandlung des Muskelgewebes mit verschiedenen Chemokinen oder Mediatoren der Entzündungsreaktion. Zum Beispiel ist der von Stromazellen abgeleitete Faktor 1 alpha oder der Tumornekrosefaktor alpha in der Lage, spezifische Mikroumgebungsbedingungen nachzuahmen.

Solche Bedingungen verstärken die Interaktionen zwischen Stammzell-Endothelzellen in unterschiedlichem Maße, abhängig von dem spezifischen Chemokin oder Mediator, der angewendet wird, und der injizierten Stammzellpopulation. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und Zellen in vivo durch Intravitalmikroskopie der CreER-Muskelmikrozirkulation visualisieren können.