Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein humanes neuronales Kulturmodell zu entwickeln, neuronale Marker zu identifizieren und eine reine Population von Neuronen für die Genexpressionsanalyse zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst menschliche Neurovorläuferzellen expandiert werden, um eine kontinuierliche Versorgung mit Vorläuferzellen zu schaffen. In einem zweiten Schritt werden die Neurovorläuferzellen in Gegenwart von Differenzierungszusätzen und neurotrophen Wachstumsfaktoren in Schalen kultiviert, die mit Bindungsfaktoren beschichtet sind.

Als nächstes wird eine Immunfluoreszenzfärbung für neuronale Marker durchgeführt, um das Schicksal der differenzierten Neurovorläuferzellen zu bestimmen. Schließlich wird eine Laser-Capture-Mikrodissektion von Neuronen durchgeführt, die auf PEN-Membran-Objektträgern kultiviert wurden, um die neuronenspezifische Genexpressionsanalyse zu erleichtern. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass differenzierte Neurovorläuferzellen überwiegend neuronaler Natur sind.

Basierend auf Immunfluoreszenzfärbung und Einfang von Neuronen. Durch Laser-Capture-Mikrodissektion können die menschlichen Neuro-Vorläuferzellen zu neuronenreichen Kulturen vermehrt und differenziert werden. Für In-vitro-Studien können wir, da diese Kulturen einige Galzellen enthalten, die Laser-Capture-Mikrodissektion verwenden, um eine reine Population von Neuronen zu isolieren.

Ron Bouchard, Senior Research Associate in unserer Mikroskop-Core-Einrichtung, wird diese Verfahren vorführen. Um dieses Verfahren zu beginnen, beleben Sie einen gefrorenen Bestand menschlicher Neurovorläuferzellen, die aus dem Gehirn des Fötus isoliert wurden, indem Sie sie schnell auf 37 Grad Celsius erwärmen und dann zu einem T 75 hinzufügen, das 15 Milliliter vorwarmes neuronales Basalmedium enthält, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter, EG, F und FGF. Nachdem die Zellen drei Tage lang kultiviert wurden, überführen Sie die Neurosphären in ein 15-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation bei 1000 U/min für fünf Minuten nach der Zentrifugation, verwerfen Sie den Überstand, lassen Sie etwa 100 Mikroliter Medium zurück und überführen Sie das Zellpellet in ein Einor-Röhrchen.

Ein 100-Mikroliter-Zellpellet reicht aus, um in zwei T 75-Kolben aufzuteilen. Wenn weniger, reduzieren Sie die Anzahl der Kolben, da sich die Neurovorläuferzellen nicht vermehren. Wenn es dünn gespalten ist, brechen Sie die Neurosphären gründlich in eine Einzelzellsuspension auf, indem Sie 50 Mal auf und ab pipettieren, während Sie die 200-Mikroliter-Spitze am Boden des Röhrchens halten.

Überprüfen Sie den Fortschritt visuell mit einem Mikroskop, um die Dissoziation der Neurosphären sicherzustellen. Anschließend wird die Zellsuspension gleichmäßig aufgeteilt und in zwei T 75-Kolben gegeben. Eine für die kontinuierliche Expansion und eine andere für die Differenzierung.

Dann die Kolben inkubieren. Wechsel des Mediums der Neurovorläuferzellen in dem Kolben, der für die Expansion durch Zentrifugation markiert ist. Dann das alte Medium verwerfen und neues Medium hinzufügen.

Wechseln Sie das Medium alle vier bis fünf Tage, bis die Neurosphären ihre ursprüngliche Größe von 300 bis 500 Mikrometern erreicht haben. Um mit der Differenzierung der Zellen der Neurovorläuferzellen in eine neuronenreiche Kultur zu beginnen, legen Sie einen einzelnen Deckzettel in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und beschichten Sie sie, indem Sie jeweils 500 Mikroliter 100 Mikrogramm pro Milliliter Poly-L-Lysin hinzufügen. Inkubieren Sie die Schalen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und ziehen Sie dann die Polyol-Lysin-Lösung an.

Spülen Sie die Platte mit entionisiertem sterilem Wasser ab und aspirieren Sie erneut. Als nächstes beschichten Sie die Vertiefungen der Platte mit 500 Mikrolitern zu fünf Mikrogramm pro Milliliter, Mauslaminin und inkubieren Sie nach der Inkubation 30 Minuten lang, waschen Sie die Vertiefungen erneut mit PBS-Aspirat und lassen Sie sie in der Gewebekulturhaube trocknen. Vier Tage nach der Teilung der Zellen werden die kleinen Neurosphären aus dem für die Differenzierung markierten Kolben in die beschichtete 24-Well-Platte überführt.

Fügen Sie nach sechsstündiger Inkubation eine Dichte von etwa 500 Neurosphären pro Vertiefung hinzu, wenn sich die Neurosphären an die Schale angelagert haben, entfernen Sie das Proliferationsmedium und fügen Sie die Differenzierung hinzu. Medium, bestehend aus neurobasalem Medium, B 27, Supplement, N-G-F-B-D-N-F-D-B-C und Retinsäure. Bringen Sie die Platte wieder in den Inkubator zurück, nachdem Sie zwei Wochen lang Neurovorläuferzellen in neuronalem Differenzierungsmedium kultiviert haben, und erhalten Sie eine neuronenreiche Kultur.

Spülen Sie die Neuronen einmal in PBS und fixieren Sie sie dann 30 Minuten lang in 4%Paraformaldehyd. Sobald sie fixiert sind, spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Bereiten Sie dann die Zellen für die Immunfärbung vor, indem Sie sie 60 Minuten lang mit durchlässigem Puffer bei Raumtemperatur inkubieren.

Geben Sie als Nächstes polyklonale und monoklonale Antikörper in 3%BSA in PBS in die Vertiefungen. Fügen Sie jedem ein anderes Antikörperpaar hinzu und inkubieren Sie sie am nächsten Morgen über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Shaker. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie dann nach der Inkubation 90 Minuten lang bei Anti-Kaninchen-, P-, SI-Drei- und Anti-US-Fitzy-Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Waschen Sie die Eindeckeinlagen dreimal mit PBS. Geben Sie dann 10 Mikroliter Eindeckmedium auf einen Objektträger. Nehmen Sie den Deckglas aus der Kulturschale und legen Sie ihn kopfüber auf das Eindeckmedium.

Wischen Sie überschüssiges Einbettmedium vorsichtig ab und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack. Um die Zellen zunächst für die Mikrodissektion vorzubereiten, differenzieren Sie die Neurovorläuferzellen in eine neuronenreiche Kultur auf der PEN-Membran. Objektträger mit Poly-L-Lysin und Laminin beschichtet.

Führen Sie alle nachfolgenden Schritte unter RNA-freien Bedingungen durch. Als nächstes färben Sie die Kulturen mit der Histo-Genfärbung, um die Zellen zu visualisieren. Das Histo-Gen färbt die Zellkerne violett und das Zytoplasma in einem hellen Rosa, was die Unterscheidung von Neuronen und Gliazellen anhand ihrer unterschiedlichen Morphologien erleichtert. Legen Sie den Objektträger 30 Sekunden lang in 75%iges Ethanol und entionisiertes steriles Wasser.

Legen Sie dann die Folie auf ein Kim-Tuch. Fügen Sie 200 Mikroliter Histo-Gen hinzu und warten Sie 20 Sekunden. Legen Sie den Objektträger anschließend nacheinander für jeweils 30 Sekunden in entionisiertes steriles Wasser, 75 % Ethanol, 95 % Ethanol und 100 % Ethanol.

Dann fünf Minuten in Xylol legen und fünf Minuten auf einem Kim-Tuch trocknen. Platzieren Sie dann einen PEN-Membran-Slide über den regulären Objektträger und platzieren Sie ihn mithilfe der Software in das Veritas Laser Capture Micro Dissection System (LCM). Nehmen Sie ein Roadmap-Bild, um die Bereiche reiner neuronaler Populationen zu finden, die frei von Astrozyten sind.

Markieren Sie diese Neuronen mit den Zeichenwerkzeugen. Führen Sie anschließend eine Lasererfassung dieser Bereiche mit computergesteuerter Präzision und Automatisierung in einem zweistufigen Prozess durch. Zunächst wird IR mit einer Laserleistung von 70 Milliwatt und einem Impuls von 2.500 Mikrosekunden auf mehrere Spots abgefeuert, um die Membran an der Kappe zu befestigen.

Anschließend wird der markierte Bereich mit einem UV-Schneidewerkzeug bei einer niedrigen Einstellung von 10 Millivolt ausgeschnitten. Durch die Kombination dieser Prozesse werden die markierten Bereiche selektiv auf LCM-Makrokappen erfasst. Wenn mindestens 100 Neuronen eingefangen wurden, verwenden Sie ein Mikroskop, um die Membran von der Kappe zu entfernen und auf ein Röhrchen zu legen.

Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus LCM-Proben mit einem P OPU RNA-Isolationskit und behandeln Sie sie mit DNAs. Amplifizieren Sie dann die isolierte RNA mit dem Ribo-Amp-RNA-Amplifikationskit, indem Sie den Anweisungen des Kits folgen. Führen Sie schließlich eine Echtzeit-R-T-P-C-R-Analyse mit TAC MAN-Sonden durch, um menschliche Neurofilament-Schwerketten zu erkennen.

Eine neuronenreiche Kultur wird durch die Differenzierung von vier Tage alten Neurosphären unter Verwendung von Poly-L-Lysin und laminatbeschichteten Oberflächen in Kombination mit differenzierungsspezifischen Wachstumsfaktoren erhalten. Nach zwei Wochen wird eine hier gezeigte neuronenreiche Kultur in Bereichen mit geringer Dichte gewonnen. Die Zellen können sich zu Astrozyten differenzieren, wie hier zu sehen.

Die Astrozytendifferenzierung kann auch durch die Verwendung des Wachstumsfaktors CNTF anstelle der für die Neuronendifferenzierung verwendeten Faktoren gesteuert werden. Die Neuronendifferenzierung kann anhand von Antikörpern gegen die spezifischen neuronalen Marker, neues N und Synapsin, Acetylcholinesterase und Synaptophysin sowie BDNF und GAAP 43 identifiziert werden. Die positive Färbung ist ein Beweis dafür, dass die differenzierten Zellen Eigenschaften von primären Neuronen aufweisen. Darüber hinaus können Astrozyten durch positive Stat 3- und GAP-Immunfärbung identifiziert werden.

Die Laser-Capture-Mikrodissektion von Neuronen wird an Zellen durchgeführt, die auf einer mit Poly-L-Lysin und Laminin beschichteten PEN-Membran differenziert wurden. Die hier gezeigten Objektträger sind Neuronen, die mit Histo-Färbung gefärbt wurden. Um die Zellen sichtbar zu machen, können die interessierenden Zellen dann mit einem Laser umrissen werden, der die PEN-Membran schmilzt und sie an der darüber platzierten Fangkappe kleben lässt. Am Ende können zahlreiche Zellen umrissen und für die DNA- oder RNA-Analyse auf derselben Kappe eingefangen werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Neuronen mit Hilfe der Laser-Capture-Mikrodissektion isoliert