Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein menschliches neuronales Kulturmodell zu entwickeln, neuronale Marker zu identifizieren und eine reine Population von Neuronen für die Genexpressionsanalyse zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst menschliche neuronale Vorläuferzellen expandiert werden, um eine kontinuierliche Versorgung mit Vorläuferzellen sicherzustellen. Als zweiter Schritt werden die neuronalen Vorläuferzellen in Anwesenheit von Differenzierungs-Zusätzen und neurotrophen Wachstumsfaktoren in mit Anheftungsfaktoren beschichteten Petrischalen kultiviert.

Anschließend wird eine immunfluoreszenzfarbliche Markierung für neuronale Marker durchgeführt, um das Schicksal der differenzierten neurogenen Vorläuferzellen zu bestimmen. Schließlich erfolgt eine Laser-Mikrodissektion von auf PEN-Membranobjektträgern kultivierten Neuronen, um eine neuronenspezifische Genexpressionsanalyse zu ermöglichen. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die differenzierten neurogenen Vorläuferzellen überwiegend neuronalen Charakters sind.

Ausgehend von immunfluoreszenzfärbungen und der Gewinnung von Neuronen. Durch Laser-Mikrodissektion können menschliche neuronale Vorläuferzellen vermehrt und in neuronenreiche Kulturen differenziert werden. Für In-vitro-Studien, da diese Kulturen einige Gal-Zellen enthalten, können wir die Laser-Mikrodissektion nutzen, um eine reine Population von Neuronen zu isolieren.

Die Durchführung dieser Verfahren erfolgt durch Ron Bouchard, einen leitenden wissenschaftlichen Mitarbeiter unserer Mikroskopie-Kernfacility. Um dieses Verfahren zu beginnen, bringen Sie eine gefrorene Probe menschlicher neuronaler Vorläuferzellen, die aus fetalem Gehirn gewonnen wurden, durch schnelles Erwärmen auf 37 Grad Celsius zum Ansatz und geben sie anschließend in eine T75-Flasche mit 15 Milliliter vorgewärmtem Neurobasal-Medium, das mit 10 Nanogramm pro Milliliter EGF und FGF ergänzt ist. Nachdem die Zellen drei Tage lang kultiviert wurden, überführen Sie die Neurosphären in ein 15-Milliliter-Röhrchen und pelletieren sie durch Zentrifugation bei 1000 U/min für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand, wobei etwa 100 Mikroliter Medium zurückbleiben, und übertragen das Zellpellet in ein Eppendorf-Röhrchen.

Ein Zellpellet von 100 Mikrolitern reicht aus, um auf zwei T-75-Flaschen aufgeteilt zu werden. Falls weniger vorhanden ist, reduzieren Sie die Anzahl der Flaschen, da sich neurale Vorläuferzellen andernfalls nicht vermehren. Falls eine dünne Aufteilung erfolgt, dann lösen Sie die Neurosphären gründlich in eine Einzelzell-Suspension auf, indem Sie 50-mal auf- und abpipettieren, wobei Sie die 200-Mikroliter-Spitze stets am Boden des Röhrchens anlegen.

Überprüfen Sie den Fortschritt visuell mithilfe eines Mikroskops, um die Dissoziation der Neurosphären sicherzustellen. Anschließend teilen Sie die Zellsuspension gleichmäßig auf und geben sie auf zwei T-75-Flaschen auf. Eine für die weitere Expansion und eine weitere zur Differenzierung.

Dann inkubieren Sie die Flaschen. Ersetzen Sie das Medium der neuronalen Vorläuferzellen in der für die Expansion markierten Flasche durch Zentrifugation. Entsorgen Sie anschließend das alte Medium und geben Sie frisches Medium hinzu.

Erneuern Sie das Medium alle vier bis fünf Tage, bis die Neurosphären ihre ursprüngliche Größe von 300 bis 500 Mikron erreicht haben. Um die Differenzierung von Neuroprogenitorzellen in eine neuronenreiche Kultur zu beginnen, geben Sie je einen Deckglaser in jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte und beschichten Sie diese, indem Sie 500 Mikroliter einer Lösung mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Poly-L-Lysin in jede Vertiefung geben. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur und saugen Sie anschließend die Poly-L-Lysin-Lösung ab.

Spülen Sie die Platte mit deionisiertem sterilem Wasser und saugen Sie erneut ab. Beschichten Sie anschließend die Vertiefungen der Platte mit 500 Mikrolitern fünf Mikrogramm pro Milliliter Maus-Laminin und inkubieren Sie 30 Minuten. Nach der Inkubation waschen Sie die Vertiefungen mit PBS, saugen Sie erneut ab und lassen Sie sie in der Zellkulturfume abtrocknen. Vier Tage nach dem Aufspalten der Zellen überführen Sie die kleinen Neurosphären aus dem als Differenzierung gekennzeichneten Kolben in die beschichtete 24-Loch-Platte.

Fügen Sie eine Dichte von etwa 500 Neurosphären pro Vertiefung hinzu, nachdem sie sechs Stunden lang inkubiert wurden, bis die Neurosphären an der Platte angeheftet sind. Entfernen Sie dann das Proliferationsmedium und geben Sie Differenzierungsmedium hinzu, das aus Neurobasal-Medium, B27-Zusatz, N-G-F, B-D-N-F, D-B-C und Retinsäure besteht. Stellen Sie die Platte nach einer zweiwöchigen Kultur von neuronalen Vorläuferzellen in neuronalem Differenzierungsmedium zurück in den Inkubator; anschließend erhält man eine neuronenreiche Kultur.

Spülen Sie die Neuronen einmal mit PBS und fixieren Sie sie anschließend 30 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd. Nach der Fixierung spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Bereiten Sie dann die Zellen für die Immunfärbung vor, indem Sie sie 60 Minuten bei Raumtemperatur mit Puffer mit Permeabilisierungswirkung inkubieren.

Fügen Sie anschließend polyklonale und monoklonale Antikörper in 3 % BSA in PBS in die Vertiefungen hinzu. Geben Sie jeweils ein anderes Antikörperpaar in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Schüttler. Am nächsten Morgen waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS und inkubieren sie dann bei Raumtemperatur im Dunkeln 90 Minuten lang mit sekundären Antikörpern gegen Kaninchen-P-SI-drei und gegen US-Fitzy.

Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS. Geben Sie dann 10 Mikroliter Einbettmedium auf einen Objektträger. Nehmen Sie das Deckglas aus der Kulturschale und legen Sie es mit der Zellseite nach unten auf das Einbettmedium.

Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Einbettungsmedium und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack. Um die Zellen für die Mikrodissektion vorzubereiten, differenzieren Sie zunächst neurogene Vorläuferzellen zu einer neuronenreichen Kultur auf einer PEN-Membran. Objektträger, beschichtet mit Poly-L-Lysin und Laminin.

Führen Sie alle nachfolgenden Schritte unter RNA-freien Bedingungen durch. Färben Sie die Kulturen anschließend mit Histo Gene-Färbemittel, um die Zellen sichtbar zu machen. Histo Gene färbt die Kerne lila und das Zytoplasma hellrosa, wodurch sich Neuronen und Gliazellen anhand ihrer charakteristischen Morphologie leicht unterscheiden lassen. Legen Sie den Objektträger für 30 Sekunden in 75 %igen Ethanol und deionisiertes steriles Wasser.

Legen Sie dann den Objektträger auf ein Kim-Tuch. Geben Sie 200 Mikroliter Histo Gene hinzu und warten Sie 20 Sekunden. Anschließend führen Sie den Objektträger nacheinander jeweils 30 Sekunden lang in deionisiertem sterilem Wasser, 75 %igem Ethanol, 95 %igem Ethanol und 100 %igem Ethanol.

Danach in Xylol für fünf Minuten geben und fünf Minuten lang auf einem Kim-Tuch trocknen. Anschließend eine PEN-Membran-Slide über die normale Slide legen und mit dieser in das Veritas-Laser-Kapture-Mikrodissektionsystem oder LCM unter Verwendung der Software geben. Ein Übersichtsbild aufnehmen, um Areale mit reinen neuronalen Populationen zu identifizieren, die frei von Astrozyten sind.

Kennzeichnen Sie diese Neuronen mithilfe der Zeichenwerkzeuge. Führen Sie anschließend die Laser-Mikrodissektion dieser Bereiche unter Verwendung computergesteuerter Präzision und Automatisierung in einem zweistufigen Prozess durch. Zunächst wird IR an mehreren Stellen mit einer Laserleistung von 70 Milliwatt und einem Puls von 2.500 Mikrosekunden abgefeuert, um die Membran an die Kappe zu binden.

Anschließend wird der markierte Bereich mit einem UV-Schneidewerkzeug bei einer niedrigen Einstellung von 10 Millivolt ausgeschnitten. Die Kombination dieser Verfahren ermöglicht es, die markierten Bereiche gezielt auf LCM-Makrokappen aufzufangen. Sobald mindestens 100 Neuronen aufgefangen wurden, entfernen Sie mithilfe eines Mikroskops die Membran von der Kappe und platzieren Sie auf einem Röhrchen.

Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus LCM-Proben mithilfe eines P OPU-RNA-Isolationskits und behandeln Sie sie mit DNasen. Amplifizieren Sie anschließend die isolierte RNA unter Verwendung eines Ribo-Amp-RNA-Amplifikationskits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie abschließend eine Echtzeit-R-T-P-C-R-Analyse mit TAC-MAN-Proben durch, um die humane neurofilamentäre schwere Kette nachzuweisen.

Eine neuronenreiche Kultur wird durch die Differenzierung vier Tage alter Neurosphären unter Verwendung von poly-L-Lysin- und Laminin-beschichteten Oberflächen in Kombination mit differenzierungsspezifischen Wachstumsfaktoren erhalten. Nach zwei Wochen entsteht eine hier gezeigte neuronenreiche Kultur in Bereichen geringer Dichte. Die Zellen können sich in Astrozyten differenzieren, wie hier zu sehen ist.

Die Differenzierung von Astrozyten kann auch durch Verwendung des Wachstumsfaktors CNTF gesteuert werden, anstelle derjenigen Faktoren, die für die Neuronendifferenzierung verwendet werden. Die Neuronendifferenzierung kann mithilfe von Antikörpern gegen die spezifischen neuronalen Marker NeuN und Synapsin, Acetylcholinesterase und Synaptophysin sowie BDNF und GAP-43 nachgewiesen werden. Positiv gefärbte Zellen weisen Merkmale primärer Neuronen auf. Zusätzlich können Astrozyten durch positives STAT3- und GAP-Immunofärbung identifiziert werden.

Die Laser-Mikrodissektion von Neuronen wird an Zellen durchgeführt, die auf mit Poly-L-Lysin und Laminin beschichteten PEN-Membranen differenziert wurden. In den hier gezeigten Abbildungen sind die Neuronen mit Histo-Färbemittel gefärbt. Zur Visualisierung der Zellen können die gewünschten Zellen anschließend mit einem Laser umrissen werden, wodurch die PEN-Membran schmilzt und an der darüber platzierten Sammelkappe haften bleibt. Am Ende können zahlreiche Zellen umrissen und auf derselben Kappe für eine DNA- oder RNA-Analyse gesammelt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Neuronen mittels Laser-Mikrodissektion isoliert.