Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) von Schwach-Streuung Themen
February 8th, 2014
Die dreidimensionalen Positionen der schwach streuende Objekte eindeutig mit digitalen Inline holografische Mikroskopie (Dihm), die eine geringfügige Modifikation an einem Standardmikroskop umfasst identifiziert werden. Unsere Software verwendet eine einfache Heuristik Bildgebung verbunden mit Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation, um die dreidimensionale Position und Geometrie eines mikroskopischen Phasenobjekt zu erhalten.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die 3D-Position in der Geometrie einer Kette schwimmender Bakterienzellen zu rekonstruieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Bakterienzellen auf die richtige Konzentration gezüchtet werden, um eine geeignete Probe für die Bildgebung bereitzustellen. In einem zweiten Schritt wird die LED-Lichtquelle eingerichtet und ausgerichtet, so dass holografische Bilder erhalten werden können.
Als nächstes wird die Rekonstruktionssoftware verwendet, um die 3D-Koordinaten einer Kette von Bakterienzellen zu erhalten. Die Ergebnisse zeigen die Möglichkeit, die Position und Konfiguration der Bakterienzellen in 3D auf der Grundlage holographischer Bildgebung zu rekonstruieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass eine markierungsfreie volumetrische Bildgebung bei hohen Bildraten möglich ist.
Zu Beginn der Inokulation werden 10 Milliliter KTY-Medien mit Eiskristallen aus einem gefrorenen Bestand von Streptokokken Stamm V 4 0 5 1 1 97 inkubiert, die Starterkultur in einem Rotationsschüttler über Nacht bei 35 Grad Celsius und 150 U/min. Wenn es erwachsen ist, beimpfen Sie 10 Milliliter frisches KTY-Medium mit 500 Mikrolitern aus der gesättigten Starterkultur. Inkubieren Sie 3,5 Stunden bei 35 Grad Celsius und 150 U/min, bis die Zellen bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern eine optische Dichte von 0,8 bis 1,0 erreichen.
Dies entspricht etwa fünfmal 10 bis acht Zellen pro Milliliter. Verdünnen Sie dann die Zellen bei eins bis 400 in frischen Medien, um die Endkonzentration von etwa 1 Million Zellen pro Milliliter zu erhalten. Füllen Sie als Nächstes eine Spritze mit Vaseline und machen Sie einen einen Millimeter hohen Fettring auf einen Objektträger.
Geben Sie dann einen Tropfen der Probenlösung in die Mitte. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über die Probe und drücken Sie leicht auf das Glas, um die Ränder zu versiegeln, und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit sowohl mit dem Objektträger als auch mit dem Deckglas in Kontakt kommt. Die resultierende Probenkammer sollte 100 bis 200 Mikrometer tief sein.
Drehen Sie eine 60-fache Öl-Tauchlinse an ihren Platz und fügen Sie einen Tropfen Öl hinzu. Stellen Sie dann die Probenkammer mit dem Deckglas nach unten auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen zwischen dem Glasdeckglas und der Linse bilden.
Fokussieren Sie auf die Unterseite der Probenkammer und fokussieren Sie dann den Kondensator. Schalten Sie anschließend die Standardbeleuchtung aus und platzieren Sie den LED-Kopf hinter der Kondensoröffnung des Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass der Kondensator auf den Hellfeldmodus eingestellt ist, und stellen Sie die LED-Stromversorgung auf maximale Leistung ein.
Schließen Sie dann die Kondensorblende vollständig und schieben Sie die LED in ihre Halterung, bis die Beleuchtung auf die Blende des Objektivs zentriert ist. Schalten Sie den Computer ein und leiten Sie den Lichtweg auf den Kameraanschluss des Mikroskops um. Stellen Sie die Bildrate auf 30 Bilder pro Sekunde und die Bildgröße auf fünf 12 x fünf 12 Pixel in der Bildaufnahmesoftware ein.
Überprüfen Sie ein Histogramm der Bildintensität, um sicherzustellen, dass kein Teil des Bildes gesättigt oder unterbelichtet ist. Die Belichtungszeit des Bildes sollte so kurz wie möglich sein und gleichzeitig einen guten Kontrast erhalten. Wenn sich Zellen in der Nähe einer Grenzfläche ansammeln, fokussieren Sie das Mikroskop neu, so dass die Bakterienzellen leicht unscharf werden.
Die Zellen sollten für eine optimale Rekonstruktion etwa 10 bis 30 Mikrometer von der Brennebene entfernt liegen. Erfassen Sie nach dem Refokussieren eine Reihe von Videoframes und speichern Sie eine VI-Datei als unkomprimierte Datei. Starten Sie dann die DIHM-Software, die zum kostenlosen Download zur Verfügung steht, um ein Videobild in einen numerisch neu fokussierten Bildstapel zu konvertieren.
Beispielrahmen werden mit der Software bereitgestellt, um mit der Rekonstruktion zu beginnen. Geben Sie den gewünschten Frame und seinen Hintergrund als separate Bilddateien in die Felder ein. Das Hintergrundbild stellt den Hintergrund des Videos ohne Hologramm fair dar und wird verwendet, um festes Musterrauschen zu unterdrücken, das die holografische Lokalisierung und Analyse beeinträchtigen könnte.
Geben Sie als Nächstes die Parameter des Ausgabestapels in die globalen Einstellungsfelder ein. Geben Sie zunächst die axiale Position des ersten Frames im Startfokus ein. Geben Sie dann die Anzahl der Slices im rekonstruierten Stack in Anzahl der Schritte ein, und geben Sie schließlich den tatsächlichen Abstand zwischen den einzelnen Slices im Stack in Schrittgröße ein.
Legen Sie die Schrittweite so fest, dass sie mit dem lateralen Pixelabstand übereinstimmt, um Objekte mit den richtigen Proportionen anhand der Beispieldaten zu rekonstruieren. Dieser Wert sollte 0,233 Mikrometer betragen. Geben Sie als Nächstes die Beleuchtung, die Wellenlänge und den mittleren Brechungsindex der Kamera sowie die laterale Abtastfrequenz ein.
Im Pixel-pro-Mikron-Feld kann die laterale Abtastfrequenz der Kamera ermittelt werden, indem die Vergrößerung des Objektivs durch die Pixelgröße des Kamerasensors dividiert wird. Unter Verwendung der Beispieldaten wäre die Zahl 60 x geteilt durch 14 Mikrometer, was 4,29 Pixel pro Mikrometer entspricht. Wenn dann die Mitte des Objekts im Hologramm dunkel ist, drücken Sie die Schaltfläche Z-Farbverlauf umkehren.
Dadurch wird ein Filter angewendet, der Objekte unterhalb der Fokusebene in der Originalprobe extrahiert. Schalten Sie dann den Bandpassfilter ein, der für die Unterdrückung des verrauschten Pixelbeitrags zum Bild verantwortlich ist. Sie wird unmittelbar nach der Generierung auf jedes Bild-Slice angewendet.
Überprüfen Sie als Nächstes, ob der Zwischenausgang ausgeschaltet ist, und stellen Sie sicher, dass sie eingeschaltet sind. Wenn diese Schalter eingeschaltet sind, werden zwei Videos erstellt. Die erste Ausgabe ist der Refokus-Stack mit einem Dateinamen, der auf Stack a V endet.Der zweite Stack ist die eigentliche Verlaufsoperation mit einem Dateinamen, der auf Gradient a VI endet.Im Idealfall enthält dieser zweite Stack das Objekt von Interesse, das als helles Objekt vor einem dunklen Hintergrund hervorgehoben ist.
Nachdem Sie alle Parameter eingestellt haben, drücken Sie im Hauptfenster auf Ausführen, um die Befehle auszuführen. Der ausgewählte Rahmen wird im Hauptfeld der Software angezeigt. Verwenden Sie dann das Lupenwerkzeug in der Symbolleiste links neben dem Bild, um es zu vergrößern und zu verkleinern.
Verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um einen Interessenbereich oder ROI auszuwählen, und erfassen Sie so viele Hologramm-Säume wie möglich innerhalb des Rechtecks, um die Rekonstruktion zu optimieren. Drücken Sie abschließend die Prozesstaste, um die beiden separaten Bildstapel zu generieren. Überprüfen Sie die resultierenden Stapel mit Bild J, das auf dieser Website verfügbar ist.
Wenn das Objekt von Interesse im Stapel des Verlaufsbildes deutlich zu sehen ist, fahren Sie mit dem Rendering-Abschnitt fort, um die Objektkoordinaten zu extrahieren. Um mit dem Rendern zu beginnen, drücken Sie die Schaltfläche zum Extrahieren von Merkmalen, um die Funktion für die Positionierung von X-, Y- UND Z-Koordinaten zu aktivieren. Geben Sie dann einen Pfad und eine Erweiterung für die Ausgabekoordinatendatei ein, und wählen Sie im Feld für den Ausgabekoordinatenstil die Option POV-Ray-Stil aus.
Dies veranlasst das Programm, eine Objektdatei zu schreiben, die mit dem kostenlosen POV-Raytracing-Softwarepaket, das von dieser Website bezogen werden kann, visualisiert werden kann, und die Bilder neu zu verarbeiten, um die Objektkoordinaten zu extrahieren. Das Programm stellt eine Reihe von X-, Y- und Z-Koordinaten in der ausgewählten ROI bereit, die in den Dateinamen im Feld für die Ausgabekabel geschrieben werden. Die Extraktion von Objektkoordinaten dauert deutlich länger als die Generierung von Stapeln.
Stellen Sie sicher, dass sich die mit dem Rekonstruktionscode gelieferte POV-Beispieldatei im selben Ordner wie die Ausgabekoordinatendatei befindet. Bearbeiten Sie die Beispiel-Punkt-POV-Datei und ersetzen Sie den Dateinamen in Anführungszeichen in der Zeile. Fügen Sie meine Datei NC mit dem Namen der Datendatei ein, die durch den Rekonstruktionscode generiert wurde.
Passen Sie dann die Kameraposition, die Beleuchtung, die Textur und die Rendering-Optionen in POV Ray an. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um ein Bitmap-Bild zu rendern. Dies ist das Bild einer Streptokokken-Bakterienkette, die kurzzeitig ausgerichtet war.
Enden Sie auf der Fokusebene. Objekte in dieser Konfiguration sind schwer zu rekonstruieren und ergeben in der Regel einen Blob in der Nähe der Fokusebene. Hier ist ein korrekt gerendertes Bild zu sehen, das für die meisten Frames dieser Serie repräsentativ ist, in denen die Kette nicht direkt entlang der optischen Achse ausgerichtet ist.
Die Form und Position des Objekts werden im Rendering originalgetreu wiedergegeben, wie im Bedienfeld rechts zu sehen ist. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in wenigen Minuten durchgeführt werden.
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Übersicht
Diese Studie demonstriert den Einsatz der digitalen holografischen Inline-Mikroskopie (DIHM) zur Rekonstruktion der dreidimensionalen Positionen und Geometrien von schwimmenden Bakterienzellen. Die Technik ermöglicht eine label-freie volumenbasierte Bildgebung mit hohen Bildraten und bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biophysik
- Bildgebungstechniken
Hintergrund
- Die digitale holografische Inline-Mikroskopie (DIHM) ist eine modifizierte Mikroskopie-Technik.
- Sie ermöglicht die eindeutige Identifizierung schwach streuender Objekte in drei Dimensionen.
- Die holografische Bildgebung kann dynamische Prozesse in Echtzeit erfassen.
- Bestehende Methoden wie die konfokale Mikroskopie erfordern oft eine Markierung, die das Verhalten biologischer Proben verändern kann.
Zweck der Studie
- Um die 3D-Position und -Geometrie von schwimmenden Bakterienzellen zu rekonstruieren.
- Um die Wirksamkeit von DIHM bei der Erfassung von dynamischen Prozessen lebender Zellen zu demonstrieren.
- Um die Vorteile von DIHM im Vergleich zu herkömmlichen Bildgebungsmethoden zu vergleichen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Bakterienzellkulturen in geeigneten Konzentrationen.
- Ausrichtung einer LED-Lichtquelle für optimale holografische Bildgebung.
- Nutzung von Rekonstruktionssoftware zur Gewinnung von 3D-Koordinaten.
- Analyse der resultierenden holografischen Bilder zur Beurteilung der Zellkonfiguration.
Hauptergebnisse
- Die 3D-Positionen der Bakterienzellen wurden erfolgreich rekonstruiert.
- Die Technik zeigte eine hohe Bildrate bei der Bildgebung ohne die Notwendigkeit von Markierungen.
- Die Ergebnisse wiesen einen klaren Vorteil gegenüber der konfokalen Mikroskopie in Bezug auf Bildgebungsgeschwindigkeit und Probenintegrität auf.
- Die holografische Bildgebung erwies sich als effektiv für dynamische biologische Prozesse.
Schlussfolgerungen
- DIHM ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung lebender Bakterienzelldynamiken.
- Die Methode ermöglicht eine detaillierte 3D-Bildgebung ohne Veränderung der Probe.
- Diese Technik könnte in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Digital inline holographic microscopy (DIHM) enables label-free volumetric imaging of weakly-scattering biological samples at high frame rates, addressing a key limitation in live-cell imaging where traditional methods require labeling or lack 3D spatial resolution. This capability supports early discovery workflows by providing quantitative, model-free measurements of cellular position and geometry in native conditions, reducing mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening. The technique’s compatibility with standard imaging hardware and scalable sample volumes positions it as a reusable platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables unambiguous, model-free measurement of object location and shape in microscopic samples, supporting therapeutic hypothesis interrogation without exogenous labels.
- Operational Value: Uses standard CMOS/CCD cameras and LED or laser illumination, allowing integration into existing microscopy workflows without specialized reagents.
- Predictive Value: Provides quantitative 3D coordinates of cellular structures, facilitating functional target validation and biological de-risking through direct observation of native dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Captures interference patterns that contain depth information for 3D reconstruction, enabling label-free assessment of cellular responses in complex microenvironments.
- Operational Value: Defines accessible sample volume via camera sensor size and illumination coherence, supporting standardization across platforms with volumes up to 5 mm³ using laser illumination.
- Predictive Value: Employs Rayleigh-Sommerfeld back propagation and Gouy phase anomaly heuristics to generate reproducible, quantitative outputs for assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time observation of dynamic biological processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Allows high-frame-rate imaging without sample alteration, preserving native behavior for longitudinal tracking in preclinical models.
- Predictive Value: Delivers mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular geometry and positioning, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
DIHM fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, particularly where label-free, volumetric, and dynamic imaging are required to compare experimental conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing model-free 3D localization of weakly-scattering objects like bacterial cells or subcellular structures.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, refocused image stacks that allow comparison of cellular configurations across conditions.
- Analytics: Generates X, Y, Z coordinate outputs via feature extraction, enabling statistical analysis of spatial distributions and motion patterns.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving sample integrity during longitudinal imaging of dynamic processes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability rather than a single-use technique, leveraging free reconstruction software and standard hardware.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free, model-free 3D reconstruction of object geometry and position.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via numerical refocusion and fixed-pattern noise suppression using background subtraction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early, high-fidelity observation of native cellular dynamics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via quantitative spatial data that informs target confidence and lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holographic image acquisition and numerical reconstruction using Rayleigh-Sommerfeld back propagation.
- Needs instrumentation capable of plane-wave illumination and CMOS/CCD image capture at defined frame rates and resolutions.
- Demands cross-team standardization of illumination coherence, step size, and lateral sampling frequency for reproducible 3D reconstruction.
- Requires adaptation of output stack parameters (start focus, number of steps, step size) to match experimental scale and magnification.
- Practical limitation: optimal reconstruction requires objects to lie 10–30 microns from the focal plane, necessitating precise sample preparation and focusing.
