Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) von Schwach-Streuung Themen
8. Februar 2014
Die dreidimensionalen Positionen der schwach streuende Objekte eindeutig mit digitalen Inline holografische Mikroskopie (Dihm), die eine geringfügige Modifikation an einem Standardmikroskop umfasst identifiziert werden. Unsere Software verwendet eine einfache Heuristik Bildgebung verbunden mit Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation, um die dreidimensionale Position und Geometrie eines mikroskopischen Phasenobjekt zu erhalten.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die 3D-Position in der Geometrie einer Kette schwimmender Bakterienzellen zu rekonstruieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Bakterienzellen auf die richtige Konzentration gezüchtet werden, um eine geeignete Probe für die Bildgebung bereitzustellen. In einem zweiten Schritt wird die LED-Lichtquelle eingerichtet und ausgerichtet, so dass holografische Bilder erhalten werden können.
Als nächstes wird die Rekonstruktionssoftware verwendet, um die 3D-Koordinaten einer Kette von Bakterienzellen zu erhalten. Die Ergebnisse zeigen die Möglichkeit, die Position und Konfiguration der Bakterienzellen in 3D auf der Grundlage holographischer Bildgebung zu rekonstruieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass eine markierungsfreie volumetrische Bildgebung bei hohen Bildraten möglich ist.
Zu Beginn der Inokulation werden 10 Milliliter KTY-Medien mit Eiskristallen aus einem gefrorenen Bestand von Streptokokken Stamm V 4 0 5 1 1 97 inkubiert, die Starterkultur in einem Rotationsschüttler über Nacht bei 35 Grad Celsius und 150 U/min. Wenn es erwachsen ist, beimpfen Sie 10 Milliliter frisches KTY-Medium mit 500 Mikrolitern aus der gesättigten Starterkultur. Inkubieren Sie 3,5 Stunden bei 35 Grad Celsius und 150 U/min, bis die Zellen bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern eine optische Dichte von 0,8 bis 1,0 erreichen.
Dies entspricht etwa fünfmal 10 bis acht Zellen pro Milliliter. Verdünnen Sie dann die Zellen bei eins bis 400 in frischen Medien, um die Endkonzentration von etwa 1 Million Zellen pro Milliliter zu erhalten. Füllen Sie als Nächstes eine Spritze mit Vaseline und machen Sie einen einen Millimeter hohen Fettring auf einen Objektträger.
Geben Sie dann einen Tropfen der Probenlösung in die Mitte. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über die Probe und drücken Sie leicht auf das Glas, um die Ränder zu versiegeln, und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit sowohl mit dem Objektträger als auch mit dem Deckglas in Kontakt kommt. Die resultierende Probenkammer sollte 100 bis 200 Mikrometer tief sein.
Drehen Sie eine 60-fache Öl-Tauchlinse an ihren Platz und fügen Sie einen Tropfen Öl hinzu. Stellen Sie dann die Probenkammer mit dem Deckglas nach unten auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen zwischen dem Glasdeckglas und der Linse bilden.
Fokussieren Sie auf die Unterseite der Probenkammer und fokussieren Sie dann den Kondensator. Schalten Sie anschließend die Standardbeleuchtung aus und platzieren Sie den LED-Kopf hinter der Kondensoröffnung des Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass der Kondensator auf den Hellfeldmodus eingestellt ist, und stellen Sie die LED-Stromversorgung auf maximale Leistung ein.
Schließen Sie dann die Kondensorblende vollständig und schieben Sie die LED in ihre Halterung, bis die Beleuchtung auf die Blende des Objektivs zentriert ist. Schalten Sie den Computer ein und leiten Sie den Lichtweg auf den Kameraanschluss des Mikroskops um. Stellen Sie die Bildrate auf 30 Bilder pro Sekunde und die Bildgröße auf fünf 12 x fünf 12 Pixel in der Bildaufnahmesoftware ein.
Überprüfen Sie ein Histogramm der Bildintensität, um sicherzustellen, dass kein Teil des Bildes gesättigt oder unterbelichtet ist. Die Belichtungszeit des Bildes sollte so kurz wie möglich sein und gleichzeitig einen guten Kontrast erhalten. Wenn sich Zellen in der Nähe einer Grenzfläche ansammeln, fokussieren Sie das Mikroskop neu, so dass die Bakterienzellen leicht unscharf werden.
Die Zellen sollten für eine optimale Rekonstruktion etwa 10 bis 30 Mikrometer von der Brennebene entfernt liegen. Erfassen Sie nach dem Refokussieren eine Reihe von Videoframes und speichern Sie eine VI-Datei als unkomprimierte Datei. Starten Sie dann die DIHM-Software, die zum kostenlosen Download zur Verfügung steht, um ein Videobild in einen numerisch neu fokussierten Bildstapel zu konvertieren.
Beispielrahmen werden mit der Software bereitgestellt, um mit der Rekonstruktion zu beginnen. Geben Sie den gewünschten Frame und seinen Hintergrund als separate Bilddateien in die Felder ein. Das Hintergrundbild stellt den Hintergrund des Videos ohne Hologramm fair dar und wird verwendet, um festes Musterrauschen zu unterdrücken, das die holografische Lokalisierung und Analyse beeinträchtigen könnte.
Geben Sie als Nächstes die Parameter des Ausgabestapels in die globalen Einstellungsfelder ein. Geben Sie zunächst die axiale Position des ersten Frames im Startfokus ein. Geben Sie dann die Anzahl der Slices im rekonstruierten Stack in Anzahl der Schritte ein, und geben Sie schließlich den tatsächlichen Abstand zwischen den einzelnen Slices im Stack in Schrittgröße ein.
Legen Sie die Schrittweite so fest, dass sie mit dem lateralen Pixelabstand übereinstimmt, um Objekte mit den richtigen Proportionen anhand der Beispieldaten zu rekonstruieren. Dieser Wert sollte 0,233 Mikrometer betragen. Geben Sie als Nächstes die Beleuchtung, die Wellenlänge und den mittleren Brechungsindex der Kamera sowie die laterale Abtastfrequenz ein.
Im Pixel-pro-Mikron-Feld kann die laterale Abtastfrequenz der Kamera ermittelt werden, indem die Vergrößerung des Objektivs durch die Pixelgröße des Kamerasensors dividiert wird. Unter Verwendung der Beispieldaten wäre die Zahl 60 x geteilt durch 14 Mikrometer, was 4,29 Pixel pro Mikrometer entspricht. Wenn dann die Mitte des Objekts im Hologramm dunkel ist, drücken Sie die Schaltfläche Z-Farbverlauf umkehren.
Dadurch wird ein Filter angewendet, der Objekte unterhalb der Fokusebene in der Originalprobe extrahiert. Schalten Sie dann den Bandpassfilter ein, der für die Unterdrückung des verrauschten Pixelbeitrags zum Bild verantwortlich ist. Sie wird unmittelbar nach der Generierung auf jedes Bild-Slice angewendet.
Überprüfen Sie als Nächstes, ob der Zwischenausgang ausgeschaltet ist, und stellen Sie sicher, dass sie eingeschaltet sind. Wenn diese Schalter eingeschaltet sind, werden zwei Videos erstellt. Die erste Ausgabe ist der Refokus-Stack mit einem Dateinamen, der auf Stack a V endet.Der zweite Stack ist die eigentliche Verlaufsoperation mit einem Dateinamen, der auf Gradient a VI endet.Im Idealfall enthält dieser zweite Stack das Objekt von Interesse, das als helles Objekt vor einem dunklen Hintergrund hervorgehoben ist.
Nachdem Sie alle Parameter eingestellt haben, drücken Sie im Hauptfenster auf Ausführen, um die Befehle auszuführen. Der ausgewählte Rahmen wird im Hauptfeld der Software angezeigt. Verwenden Sie dann das Lupenwerkzeug in der Symbolleiste links neben dem Bild, um es zu vergrößern und zu verkleinern.
Verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um einen Interessenbereich oder ROI auszuwählen, und erfassen Sie so viele Hologramm-Säume wie möglich innerhalb des Rechtecks, um die Rekonstruktion zu optimieren. Drücken Sie abschließend die Prozesstaste, um die beiden separaten Bildstapel zu generieren. Überprüfen Sie die resultierenden Stapel mit Bild J, das auf dieser Website verfügbar ist.
Wenn das Objekt von Interesse im Stapel des Verlaufsbildes deutlich zu sehen ist, fahren Sie mit dem Rendering-Abschnitt fort, um die Objektkoordinaten zu extrahieren. Um mit dem Rendern zu beginnen, drücken Sie die Schaltfläche zum Extrahieren von Merkmalen, um die Funktion für die Positionierung von X-, Y- UND Z-Koordinaten zu aktivieren. Geben Sie dann einen Pfad und eine Erweiterung für die Ausgabekoordinatendatei ein, und wählen Sie im Feld für den Ausgabekoordinatenstil die Option POV-Ray-Stil aus.
Dies veranlasst das Programm, eine Objektdatei zu schreiben, die mit dem kostenlosen POV-Raytracing-Softwarepaket, das von dieser Website bezogen werden kann, visualisiert werden kann, und die Bilder neu zu verarbeiten, um die Objektkoordinaten zu extrahieren. Das Programm stellt eine Reihe von X-, Y- und Z-Koordinaten in der ausgewählten ROI bereit, die in den Dateinamen im Feld für die Ausgabekabel geschrieben werden. Die Extraktion von Objektkoordinaten dauert deutlich länger als die Generierung von Stapeln.
Stellen Sie sicher, dass sich die mit dem Rekonstruktionscode gelieferte POV-Beispieldatei im selben Ordner wie die Ausgabekoordinatendatei befindet. Bearbeiten Sie die Beispiel-Punkt-POV-Datei und ersetzen Sie den Dateinamen in Anführungszeichen in der Zeile. Fügen Sie meine Datei NC mit dem Namen der Datendatei ein, die durch den Rekonstruktionscode generiert wurde.
Passen Sie dann die Kameraposition, die Beleuchtung, die Textur und die Rendering-Optionen in POV Ray an. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um ein Bitmap-Bild zu rendern. Dies ist das Bild einer Streptokokken-Bakterienkette, die kurzzeitig ausgerichtet war.
Enden Sie auf der Fokusebene. Objekte in dieser Konfiguration sind schwer zu rekonstruieren und ergeben in der Regel einen Blob in der Nähe der Fokusebene. Hier ist ein korrekt gerendertes Bild zu sehen, das für die meisten Frames dieser Serie repräsentativ ist, in denen die Kette nicht direkt entlang der optischen Achse ausgerichtet ist.
Die Form und Position des Objekts werden im Rendering originalgetreu wiedergegeben, wie im Bedienfeld rechts zu sehen ist. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in wenigen Minuten durchgeführt werden.
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Übersicht
Diese Studie zeigt die Anwendung der digitalen inline-holographischen Mikroskopie (DIHM) zur Rekonstruktion der dreidimensionalen Positionen und Geometrien schwimmender Bakterienzellen. Die Technik ermöglicht eine markierungsfreie volumetrische Abbildung mit hohen Bildraten und bietet damit einen erheblichen Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biophysik
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Digitale inline-holographische Mikroskopie (DIHM) ist eine modifizierte Mikroskopietechnik.
- Sie ermöglicht die eindeutige Identifizierung schwach streuender Objekte in drei Dimensionen.
- Mittels holographischer Bildgebung können dynamische Prozesse in Echtzeit erfasst werden.
- Bestehende Methoden wie die konfokale Mikroskopie erfordern häufig Markierungen, die das Verhalten biologischer Proben verändern können.
Zweck der Studie
- Die dreidimensionale Position und Geometrie schwimmender Bakterienzellen zu rekonstruieren.
- Die Wirksamkeit der DIHM bei der Erfassung der Dynamik lebender Zellen zu demonstrieren.
- Die Vorteile der DIHM im Vergleich zu herkömmlichen Abbildungsmethoden zu vergleichen.
Verwendete Methoden
- Herstellung bakterieller Zellkulturen in geeigneten Konzentrationen.
- Ausrichtung einer LED-Lichtquelle für eine optimale holographische Abbildung.
- Nutzung einer Rekonstruktionssoftware zur Gewinnung der 3D-Koordinaten.
- Analyse der resultierenden holographischen Bilder zur Beurteilung der Zellkonfiguration.
Hauptergebnisse
- Die 3D-Positionen bakterieller Zellen wurden erfolgreich rekonstruiert.
- Die Technik zeigte eine hohe Bildrate bei der Bildgebung, ohne dass Markierungen erforderlich waren.
- Die Ergebnisse wiesen einen klaren Vorteil gegenüber der konfokalen Mikroskopie hinsichtlich der Bildgeschwindigkeit und der Probeneinheitlichkeit auf.
- Die holografische Bildgebung erwies sich als wirksam für dynamische biologische Prozesse.
Schlussfolgerungen
- DIHM ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik lebender Bakterienzellen.
- Die Methode ermöglicht detaillierte 3D-Aufnahmen, ohne die Probe zu verändern.
- Diese Technik könnte auf verschiedene Bereiche der biologischen Forschung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Digitale inline-holographische Mikroskopie (DIHM) ermöglicht die markierungsfreie, volumetrische Abbildung schwach streuender biologischer Proben mit hohen Bildraten und behebt damit eine zentrale Einschränkung der Lebendzell-Bildgebung, bei der herkömmliche Methoden entweder Markierungen erfordern oder über keine räumliche 3D-Auflösung verfügen. Diese Fähigkeit unterstützt frühe Entdeckungsabläufe, indem sie quantitative, modellfreie Messungen der zellulären Position und Geometrie unter nativen Bedingungen liefert und so mechanistische Unklarheiten bei der Target-Validierung und phänotypischen Bildschirmung verringert. Die Kompatibilität der Technik mit Standard-Bildgebungshardware und skalierbaren Probenvolumina positioniert sie als wiederverwendbare Plattform zur Risikominderung therapeutischer Hypothesen in der Entdeckungsbiologie.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die eindeutige, modellfreie Messung von Objektlage und -form in mikroskopischen Proben und unterstützt die Überprüfung therapeutischer Hypothesen ohne exogene Markierungen.
- Operativer Wert: Verwendet handelsübliche CMOS/CCD-Kameras sowie LED- oder Laserbeleuchtung und ermöglicht so die Integration in bestehende Mikroskopie-Workflows ohne spezialisierte Reagenzien.
- Prädiktiver Wert: Liefert quantitative 3D-Koordinaten zellulärer Strukturen und erleichtert dadurch die funktionelle Validierung von Zielstrukturen und die biologische Risikominimierung durch direkte Beobachtung nativer Dynamiken.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erfasst Interferenzmuster, die Tiefeninformationen für die 3D-Rekonstruktion enthalten, und ermöglicht so die markierungsfreie Beurteilung zellulärer Reaktionen in komplexen Mikroumgebungen.
- Operativer Wert: Definiert das zugängliche Probenvolumen anhand der Kamera-Sensorgröße und der Kohärenz der Beleuchtung und unterstützt die Standardisierung über verschiedene Plattformen hinweg mit Volumina bis zu 5 mm³ bei Verwendung von Laserbeleuchtung.
- Prädiktiver Wert: Wendet die Rayleigh-Sommerfeld-Rückpropagation und Heuristiken zur Gouy-Phasenanomalie an, um reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für die Bereitschaft und Skalierbarkeit von Assays zu erzeugen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem dynamische biologische Prozesse in krankheitsrelevanten Systemen in Echtzeit beobachtet werden können.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die Aufnahme mit hoher Bildfrequenz, ohne die Probe zu verändern, und erhält so das native Verhalten für die langfristige Verfolgung in präklinischen Modellen.
- Prädiktiver Wert: Bietet eine mechanistische Risikominimierung, indem Unsicherheiten hinsichtlich der zellulären Geometrie und Positionierung verringert werden, was fundierte, risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung ermöglicht.
Pipeline- und Workflow-Integration
DIHM fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung in der frühen Biologie bis hin zur Leitsubstanzidentifizierung und präklinischen Validierung ein, insbesondere dort, wo bildgebende Verfahren ohne Markierung, volumetrische und dynamische Aufnahmen erforderlich sind, um experimentelle Bedingungen zu vergleichen.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Wegen, indem sie eine modellfreie 3D-Lokalisierung schwach streuender Objekte wie bakterieller Zellen oder subzellulärer Strukturen ermöglicht.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch quantitative, nachfokussierte Bildstapel, die den Vergleich zellulärer Konfigurationen unter verschiedenen Bedingungen erlauben.
- Analytik: Erzeugt X-, Y-, Z-Koordinatenausgaben mittels Merkmalsextraktion und ermöglicht so die statistische Analyse räumlicher Verteilungen und Bewegungsmuster.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem die Probendurchgängigkeit während der Langzeitbildgebung dynamischer Prozesse erhalten bleibt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Bildgebungsfähigkeit statt als Einmaltechnik und nutzt freie Rekonstruktionssoftware sowie Standardhardware.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch markierungsfreie, modellfreie 3D-Rekonstruktion der Objektgeometrie und -position.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch numerische Nachfokussierung und Unterdrückung von Festmuster-Rauschen mittels Hintergrundsubtraktion.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung biologischer Risiken in späteren Phasen dank frühzeitiger, hochpräziser Beobachtung nativer zellulärer Dynamiken.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung durch quantitative räumliche Daten, die die Zielzuversicht und die Auswahl führender Kandidaten unterstützen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der holografischen Bildaufnahme und numerischen Rekonstruktion mittels Rayleigh-Sommerfeld-Rückpropagation.
- Benötigt eine Instrumentierung, die eine ebene Wellenbeleuchtung sowie die Aufnahme von CMOS/CCD-Bildern mit definierten Bildraten und Auflösungen ermöglicht.
- Erfordert eine standardisierte Abstimmung zwischen den Teams hinsichtlich Kohärenz der Beleuchtung, Schrittweite und lateraler Abtastfrequenz für reproduzierbare 3D-Rekonstruktionen.
- Erfordert eine Anpassung der Parameter des Ausgabestapels (Startfokus, Anzahl der Schritte, Schrittweite) an Maßstab und Vergrößerung des Experiments.
- Praktische Einschränkung: Für eine optimale Rekonstruktion müssen die Objekte 10–30 Mikrometer von der Fokusebene entfernt liegen, was eine präzise Probenvorbereitung und Fokussierung notwendig macht.
