Trypsin Digest Protokoll zum Analysieren des retinalen Gefäßsystem eines Maus-Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das retinale Gefäßnetz zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Reihe von Wasserwaschungen auf der isolierten Netzhaut durchgeführt werden. Im zweiten Schritt wird die Netzhaut in Trypsin bei 37 Grad Celsius für etwa ein bis eineinhalb Stunden verdaut, je nach Größe der Netzhaut.

Anschließend wird das Gefäßsystem durch zusätzliche Wasserspülungen und Dissektion unter dem Mikroskop isoliert. Letztendlich können pathologische Gefäßveränderungen wie Mikroaneurysmen, Kapillardegeneration und ein abnormales Verhältnis von Endothelzellen zu Parasiten sichtbar gemacht werden. Der Hauptvorteil von Try and Digest gegenüber bestehenden Methoden wie der Herstellung von retinalen Flat-Mounts besteht also darin, dass das gesamte Gefäßnetzwerk in großer Klarheit hervorgehoben werden kann.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie technisch anspruchsvoll und schwierig ist, sie konsistent durchzuführen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Gefäßisolierung allein mit Worten schwer zu erlernen sind. Dies ist ein sehr wertvolles Werkzeug in jedem Labor, das Studien zur Netzhautgefäßbiologie durchführt, wie z. B. einige Krankheiten wie die diabetische Retinopathie, und Jonathan Chow, ein talentierter Medizinstudent aus meinem Labor, wird diese Technik demonstrieren.

Nachdem Sie das enukleierte Mausauge und das 10%ige neutral gepufferte Formin 24 Stunden lang fixiert haben, legen Sie das Auge in eine Petrischale und bedecken Sie es mit einer kleinen Menge Wasser. Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie mit einer Präparierschere vorsichtig einen ersten Schnitt in die Hornhaut machen. Halten Sie dann den Schnittbereich mit einer geraden Pinzette fest und schneiden Sie mit einer Schere entlang des Randes der Hornhaut und der Sklera, um die Hornhaut zu entfernen.

Verwenden Sie als Nächstes eine feine, gebogene und gerade Pinzette. Um die Sklera und die Aderhaut langsam und vorsichtig von der Netzhaut weg in Richtung Sehnerv zu schälen. Entfernen Sie dann die Linse und überschüssige Iris und Ablagerungen von der Netzhaut, um die neuralen Netzhautschichten von den Blutgefäßen zu trennen.

Bei etwa 500 Mikrolitern 45 Mikrometer gefiltertes Wasser in eine 24-Well-Platte geben und die Netzhaut in eine Vertiefung legen, dann vier bis fünf Stunden lang bei Raumtemperatur vorsichtig schütteln und das Wasser alle 30 bis 60 Minuten wechseln. Fahren Sie fort, die Netzhaut über Nacht unter leichtem Schütteln in Wasser zu waschen. Entfernen Sie am nächsten Tag bei Raumtemperatur das Wasser und überprüfen Sie bei 3 % Trypsin unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich keine Ablagerungen in der Vertiefung befinden. Um zu vermeiden, dass das Gefäßsystem daran haftet, inkubieren Sie das Gewebe anschließend bei 37 Grad Celsius mit leichtem oder keinem Schütteln für ein bis eineinhalb Stunden.

Wenn das Gewebe Anzeichen des Zerfalls zeigt, legen Sie die Platte auf den Mikroskoptisch und vermeiden Sie dann die Netzhaut. Entfernen Sie vorsichtig das Trypsin, um das Gefäßsystem zu trennen. Geben Sie zunächst gefiltertes Wasser mit einer Pinzette auf die Netzhaut.

Ziehen Sie die innere Begrenzungsmembran ab, die als dünne, transparente Schicht erscheint. Schütteln Sie den Teller unter leichtem Rühren. Legen Sie die Platte nach fünf Minuten wieder auf den Mikroskoptisch und ersetzen Sie vorsichtig das Wasser, um eine Beschädigung der Netzhaut zu vermeiden, um das Gefäßnetz vom anhaftenden Netzhautgewebe zu befreien.

Waschen Sie die Netzhaut wie gerade gezeigt, bis nach der letzten Wäsche nur noch wenig bis gar keine Ablagerungen mehr im Wasser vorhanden sind. Daher ist die Entfernung des gesamten nichtvaskulären Gewebes in der Regel der schwierigste Teil des Eingriffs. Die folgenden Techniken können entweder nacheinander oder einzeln angewendet werden: Um die Isolierung des Gefäßnetzes zu erleichtern, ist ein wichtiger Tipp, alle Werkzeuge und Trypsin vor der Manipulation der Netzhaut zu tauchen.

Dies kann dazu beitragen, dass ein Taschentuch nicht an den Geräten haften bleibt. Bestreichen Sie eine 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze mit reserviertem Trypsin und pipettieren Sie dann vorsichtig Wasser auf und ab, angrenzend an und in Richtung der Netzhautgefäße, wodurch eine sanfte Bewegung verursacht wird. Wenn das nichtvaskuläre Gewebe immer noch resistent zentriert ist, wird eine mit Trypsin beschichtete Mikropipette auf den Sehnerv gestochen und vorsichtig das gesamte Gefäßnetzwerk auf und ab pipettiert, um das nichtvaskuläre Gewebe abzubauen.

Endlich gut. Mit einer Pinzette kann das Gefäßsystem vorsichtig aus dem Wasser gehoben werden, um anhaftende nichtvaskuläre Komponenten zu entfernen. Das Endergebnis sollte ein intaktes, trümmerfreies retinales Gefäßnetzwerk sein.

Um das Gefäßsystem sichtbar zu machen, geben Sie zunächst einen Tropfen Wasser auf einen sauberen Objektträger. Übertragen Sie dann die verdauten Gefäße unter einem Scope Check ins Wasser. Wenn die Klappenhalterung des VAs eingeklappt oder aufgeklappt ist, führen zusammengeklappte Gefäße zu schlechter Sicht.

Wenn das Gewebe verfärbt ist und gefaltet ist, fügen Sie zusätzliches Wasser hinzu und schütteln Sie den Objektträger vorsichtig, um das Entfalten zu erleichtern. Verwenden Sie dann eine Mikropipette, um überschüssiges Wasser langsam zu entfernen. Das Endprodukt eines erfolgreichen Verfahrens ist eine flache Halterung des gesamten Netzwerks des retinalen Gefäßsystems der Maus, wobei die Architektur beibehalten und mit Hämat, Toin und Eoin gefärbt wird.

Wie hier zu sehen, wie in diesem Bild zu sehen, ist in der Netzhaut eine deutliche Unterscheidung zwischen den Endothelzellen und den Perizyten zu beobachten. Die Kerne der Endothelzellen, die durch den weißen Pfeil angedeutet sind, sind oval oder länglich und liegen vollständig innerhalb der Gefäßwand. Die Parasitenkerne, die durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet sind, sind kleine, kugelförmige Flecken, die im Allgemeinen eine hervorstehende Position entlang der Kapillarwand haben.

Trypsin und Digest ist ein gängiges Verfahren zur Analyse der Gefäßpathologie in diabetischen Tiermodellen. Dieses Bild zeigt ein Beispiel für eine Kapillardegeneration, wie sie durch den weißen Pfeil angezeigt wird, wie sie in einer DB DB-Maus, einem Modell für Typ-2-Diabetes, beobachtet wurde. Obwohl dieses Verfahren für die Netzhaut von Mäusen optimiert wurde, können ähnliche Ergebnisse auch bei Netzhäuten von Ratten erzielt werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Netzhaut von Ratten, wie sie auf diesen Bildern zu sehen ist, größer ist als die Netzhaut von Mäusen und 12 statt 24 Zoll benötigt. Auch das Gefäßnetzwerk der Netzhaut der Ratte ist weniger fragil als das der Maus. Es ist äußerst wichtig, so viel nichtvaskuläres Gewebe wie möglich zu entfernen.

Reste führen zu unspezifischen Verfärbungen und zu einer schlechten Visualisierung des Gefäßsystems. In diesem Bild ist z.B. eine erfolglose Entfernung des gesamten nichtvaskulären Gewebes zu sehen. Ebenso ist es wichtig, dass die Netzhaut bei der Montage entfaltet wird, um die Visualisierung des Gefäßsystems zu verbessern.

Dieses Bild zeigt eine erfolglose Entfaltung der vaskulären flachen Halterung. Nachdem Sie dieses technisch schwierige Verfahren gemeistert haben. Trips und Digests können eine äußerst wertvolle Methode sein, die eine detaillierte Visualisierung des gesamten Gefäßnetzes ermöglicht.

Durch die Verbesserung dieser Technik im Mausauge können Forscher genetisch manipulierte Mäuse nutzen, um verschiedene Signalwege zu untersuchen, die die Kontrolle über das retinale Gefäßsystem übernehmen und es uns ermöglichen, die Pathophysiologie verschiedener Netzhauterkrankungen zu verstehen. Auf diese Weise können wir unser Verständnis von Krankheitspathologien wie der diabetischen Retinopathie verbessern. Durch die Untersuchung von Mausmodellen wie der DVDB-Maus kann dies letztendlich die Möglichkeit bieten, neue potenzielle therapeutische Interventionen zu finden, die auf das retinale Gefäßsystem abzielen.