Bestimmung der tolerierbaren Fettsäuren und Cholera Toxin-Konzentrationen mit menschlichen Darm-Epithelzellen und BALB / c Maus-Makrophagen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, verträgliche Konzentrationen von Fettsäuren und Cholera-Toxin zu ermitteln, die das Zellüberleben nicht negativ beeinflussen. Dies wird erreicht, indem zunächst die geeignete Zellart kultiviert wird. Im zweiten Schritt werden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der drei zu testenden Fettsäuren oder mit Cholera-Toxin inkubiert.

Nach 24 Stunden wird die Zellüberlebensrate mittels eines MTT-Assays bestimmt. Letztendlich zeigen die Spektrometriedaten des MTT-Assays die optimalen Konzentrationen von Fettsäuren und Cholera-Toxin, mit denen die Zellen behandelt werden können, ohne dass die Überlebensrate signifikant abnimmt. Die Bedeutung dieser Methode reicht bis zur Prävention von Cholera-Infektionen, da Impfungen nicht immer erfolgreich sind.

Murine Makrophagen aus Bowel C-Mäusen werden für alle Co-Toxin-Bestimmungen sowie zur großskaligen Konzentrationsbestimmung von Fettsäuren verwendet. Die Zellen werden in einem der beiden folgenden Medien kultiviert: DMEM mit L-Glutamin, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum, oder RPMI 1640 Basismedium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum, 5 % L-Glutamin und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum. Für dieses Protokoll werden die Bowel C-Zellen in 75 cm² Corning-Flaschen mit belüfteten Verschlüssen bei 37 °C, 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid kultiviert. Für die Bestimmung der Fettsäurekonzentration im kleinen Maßstab werden humane intestinale Epithelzellen in 75 cm² Corning-Flaschen mit belüfteten Verschlüssen in Hypercare-Medium, ergänzt mit 10 % FPS und 30 Nanogramm pro Milliliter, kultiviert.

Menschliches EGF: Antibiotika-Antimykotika-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers nicht verwenden; Inkubation bei 37 Grad Celsius, 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid. Passage aller Zellen im Verhältnis eins zu drei bei etwa 70 % Konfluenz, abhängig von der Zelltypart; die Zellen werden in der Regel alle zwei bis fünf Tage vor der Fettsäurebehandlung passagiert. Bereiten Sie zunächst die Fettsäuren vor, indem Sie Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure aus den vom Unternehmen bereitgestellten Glasampullen in sterilisierte Glasfläschchen umpipettieren. Danach überführen Sie jede Fettsäure in ein separates, sterilisiertes Eppendorf-Röhrchen.

Lösen Sie jede Fettsäure in 100 % Ethanol in einer Verdünnung von eins zu sechs auf, gefolgt von der Zugabe von RPMI 1640. Unvollständiges Medium auf eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Mikroliter. Vortexen Sie jede Lösung und überführen Sie sie in Glasfläschchen zur Lagerung in der minus 20 Grad Celsius Gefrierplatte.

Menschliche intestinale Epithelzellen mit 2.500 Zellen pro Vertiefung in 96-Vertiefungs-Kulturschalen; geben Sie das entsprechende vollständige Medium hinzu, um das Gesamtvolumen jeder Vertiefung auf 200 µL zu bringen. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C, 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid.

Nach der 24-stündigen Proliferationsphase das Medium entfernen. Die geeigneten Konzentrationen jeder zu testenden Fettsäure als positiven Kontrollansatz in die Vertiefungen geben. Die Zellen mit komplettem Medium als negative Kontrolle inkubieren, die Zellen mit 70 % Ethanol inkubieren.

Anschließend vollständiges Medium hinzufügen, um das Gesamtvolumen jedes Wells auf 200 Mikroliter aufzufüllen. Die behandelten Platten vor Beginn des MTT-Assays 24 Stunden inkubieren, um das Cholera-Toxin für die Zellbehandlungen vorzubereiten. Das Cholera-Toxin in PBS mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter lösen.

Portionieren Sie die Lösung in Kryoröhrchen und lagern Sie sie vor der Zellbehandlung bei zwei bis acht Grad Celsius. Verdünnen Sie das Toxin im Verhältnis 1:100 in sterilisierter PBS oder unvollständigem DMEM, um eine endgültige Arbeitskonzentration von einem Nanogramm pro Mikroliter Platte zu erhalten. Makrophagen mit 2.500 Zellen pro Loch in 96.

Gewebekulturplatten werden 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Nach der 24-stündigen Proliferationsphase entfernen Sie das Medium und geben die geeigneten Testkonzentrationen von Cholera-Toxin in die Vertiefungen. Analog zu den Fettsäurebehandlungen inkubieren Sie die Zellen mit vollständigem Medium als positiven Kontrollansatz und 70 %igem Ethanol als negativen Kontrollansatz für alle Proben und Behandlungen.

Verwenden Sie mindestens drei Wiederholungen, bei positiven Kontrollen mehr Wiederholungen. Geben Sie komplettes Medium hinzu, um das Gesamtvolumen jedes Wells auf 200 µL einzustellen. Inkubieren Sie die mit Cholera-Toxin behandelten Platten 24 Stunden, bevor Sie mit dem MTT-Assay beginnen.

24 Stunden nach der Behandlung der Zellen mit entweder Fettsäuren oder Farbstoff zur Bestimmung der Zellviabilität wird der MTT-Assay durchgeführt. Entfernen Sie die Lösung in jedem Wells der 96-Well-Platte, die getestet werden soll, und ersetzen Sie sie durch 200 Mikroliter frische, vollständige Nährlösung.

Fügen Sie 10 µL einer frisch zubereiteten MTT-Lösung mit 2,5 mg/mL zu jedem hinzu. Inkubieren Sie die Platte 3 bis 4 Stunden bei 37 °C. Nach 3 bis 4 Stunden entfernen Sie die Mediumlösung und geben 100 µL einer 0,04 molaren Salzsäure in Isopropanol zu jedem hinzu.

Die Platte fünf Minuten bei Raumtemperatur gut inkubieren. Anschließend die Lösung aus jedem Well in ein Zentrifugenröhrchen überführen und eine Minute lang bei 20.000 ×g zentrifugieren oder bis sich ein Pellet gebildet hat. Zwischen 20 und 40 Mikroliter jeder Probe in einen Mikroplattenreader überführen und die Absorption bei 570 Nanometern mithilfe eines Spektrophotometers messen.

Diese Abbildung zeigt das Überleben der meisten Makrophagen, dargestellt als Funktion der positiven Kontrolle für Behandlungen mit ansteigenden Konzentrationen von Ölsäure, Linolsäure und Linolsäuren. Es ist ersichtlich, dass die Zellen keine Konzentrationen oberhalb von 100 Nanogramm pro Mikroliter für irgendeine der Fettsäuren vertragen. Das Experiment wurde mit humanen epithelialen Zellen bei Konzentrationen wiederholt, die unterhalb von 100 Nanogramm pro Mikroliter lagen, in Schritten von jeweils 10 Nanogramm pro Mikroliter, bis hin zu 70 Nanogramm pro Mikroliter.

Dieses Diagramm zeigt die Zellüberlebensrate für jede Konzentration von Ölsäure. Eine Möglichkeit, wie Inova anzeigte, dass einer oder mehrere Mittelwerte statistisch unterschiedlich waren. Allerdings waren es nur die Behandlungen bei höheren Konzentrationen, die Mittelwerte ergaben, die statistisch signifikant von denen der positiven Kontrolle abwichen.

Interessanterweise beruhten die beobachteten Unterschiede auf einer Zunahme der Zellviabilität mit größerer Variabilität. Ähnliche Ergebnisse wurden für Linolsäure und Linolensäure erhalten. Eine Möglichkeit.

Inova wies darauf hin, dass keiner der Behandlungsmittelwerte statistisch signifikant vom Mittelwert der positiven Kontrolle abwich, jedoch scheint die Variabilität bei einigen der höheren Konzentrationen zuzunehmen, beispielsweise bei 60 Nanogramm pro Mikroliter Linolsäure oder Linolsäure aus diesen Ergebnissen. Die optimalen Fettsäurekonzentrationen bei der Verwendung menschlicher intestinaler Epithelzellen liegen offenbar zwischen einem und fünf Nanogramm pro Mikroliter. Die Wirkungen variierender Konzentrationen von Collar-Toxin auf das Überleben der meisten Makrophagen wurden ebenfalls getestet, wobei die Toxinstufen in relativ großen Inkrementen angelegt waren.

Ein abnehmender Trend der Zellüberlebensfähigkeit wurde beobachtet, wie erwartet, da die Zellviabilität bei jeder Behandlung stark variierte. Die große Variabilität der Viabilität führte dazu, dass kein signifikanter Unterschied zwischen dem Mittelwert der positiven Kontrolle und einer der Behandlungen bestand, was weitere Untersuchungen mit Toxinmengen von 100 Nanogramm oder weniger notwendig machte. Dieses Diagramm zeigt die Zellviabilität für die Behandlungen mit geringeren Toxinmengen.

Die Zellviabilität ist für nahezu alle Toxin-Konzentrationen stark variabel, obwohl geringfügige Zunahmen der Viabilität als Ergebnis der Behandlungen beobachtet wurden. Diese Zunahmen sind im Vergleich zum Mittelwert der positiven Kontrolle für keine der Behandlungen statistisch signifikant. Basierend auf diesen Ergebnissen.

Die empfohlene Konzentration des Farbtoxins beträgt weniger als 30 Nanogramm pro Behandlung, wenn Darm-C-Mausmakrophagen verwendet werden, nach der Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Farbforschung den Weg, um zu untersuchen, ob Fettsäuren die Immunabwehr gegen eine Infektion durch V. cholerae stärken können.