Name: Das Utility von Stage-spezifischen Mid-zu-spät Drosophila Follikel Isolation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-02T20:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung mittlerer bis später Drosophila-Follikelstadien für Entwicklungsbiologie und molekulare Analysen. Diese Methode ermöglicht Live-Imaging und Untersuchungen zur Oogenese.

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Wir möchten Thomas Lecuit (SQH Utrophin :: GFP-Linie), die Bloomington Stock Center, und der Entwicklungsforschung Hybridoma Bank für Reagenzien danken. Wir danken ferner alle Mitglieder der Tootle Lab für hilfreiche Diskussionen und Kritiken des Manuskripts. Finanzierung durch die National Science Foundation MCB-1158527 und Start-up-Fonds aus der Anatomie und Zellbiologie Department, University of Iowa unterstützt diese Arbeit. National Institutes of Health Predoctoral Ausbildungsförderung in Pharmakologische Wissenschaften T32GM067795 AJS unterstützt. Datenspeicherung Unterstützung wurde von der ICTS, die durch die CTSA vom National Center for Research Resources und dem National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, unterstützt durch Zuschuss UL1RR024979 finanziert wird.

1. Vorbereitung Drosophila Vor der Isolation Bühne <ol><li> Machen nassen Hefe-Paste durch die Kombination von 50 g Trockenhefe mit 90 ml destilliertem Wasser. Mischen Sie mit einem Spatel zu kombinieren. Lassen Sie die Mischung für ca. 30 Minuten vor der Beurteilung Konsistenz. Die Konsistenz sollte nur dick genug, um an der Seite einer Fliege Fläschchen halten, aber nicht heruntergekommen die Seite. Um die gewünschte Konsistenz zu erreichen, kann es notwendig sein, bis zu 10 ml zusätzlichem Wasser oder einer kleinen Menge von Trockenhefe hinzuzufügen. Lagerung in einem geschlossenen Behälter bei 4 ° C Die gespeicherte Hefe kann für ~ 1-2 Wochen verwendet werden. </li><li> Sammeln &lt;24 h alten erwachsenen Fliegen (beide Männer und Frauen) der gewünschten Genotypen und legte sie in ein Fläschchen mit Fliegen Essen und nasse Hefe-Paste auf der Seite der Fläschchen verschmiert. Die Temperatur, bei der die Fliegen gehalten wird abhängig von dem Experiment ab. Für Routineversuche werden entfernt bei Raumtemperatur gehalten. Wohingegen Versuche, in denen ein Genwobei unter Verwendung des Systems 15 UAS/GAL4 überexprimiert erfordern die Aufrechterhaltung der Fliegen bei 25 ° C oder höher ist, als angemessen. </li><li> Geben Sie die Fliegen mit einer frischen Abstrich von Hefe-Paste täglich für 2 Tage. HINWEIS: Follikel-Entwicklung ist eng mit den Ernährungszustand des weiblichen Fliege reguliert, ist es wichtig, die Fliege mit dem nährstoffreichen Hefe-Paste für mindestens 36 Stunden vor der Präparation werden. </li></ol> 2. Isolieren von Mid-zu-spät Inszenierte Drosophila Follikel <ol><li> Ermöglichen, dass die Medien auf Raumtemperatur (~ 30 min) kommen. Wenn die Follikel inszeniert gehen, um für in-vitro-Entwicklungstests verwendet werden, frisch vorbereiten IVEM Medien (Grace Insekten Medien, 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1x Penicillin / Streptomycin). Wenn die Follikel inszeniert gehen, um verwendet für die mRNA-oder Proteinisolierung entweder Grace Insekt oder IVEM Medien werden. WICHTIG: Medientemperatur ist kritisch. Wenn die Medien ist kalt wird es ändernsowohl das Aktin und Mikrotubuli-Zytoskelett und Blockbebauung. </li><li> Anesthetize die Fliegen in der yeasted Fläschchen durch die Injektion von CO 2-Gas und legen 3-5 weibliche Fliegen auf einer Fliege Lage unter CO 2. WICHTIG: mehr Frauen, als in einem 10 Minuten Zeit auf der Fliege Pad seziert Lassen Sie keine verlängerte Exposition gegenüber CO 2 verursachen können Unfruchtbarkeit und Tod. </li><li> Füllen Sie eine Vertiefung einer 9-Punkt-Platte mit Medien und legen Sie es auf einer dunklen Fläche (ein Stück schwarzes Plexiglas funktioniert gut). Fokussieren Sie das Binokular auf dem Grund des Brunnens. </li><li> Mit # 5 Dumont Zange holen eine einzige Frau mit einer Hand (dies wird am besten mit der dominanten Hand). Es ist oft am einfachsten zu holen die weiblichen von den Flügeln, Beinen, Bauch oder Brustkorb Übergang. Tauchen Sie die Frau in den Medien gut gefüllt. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops wie nötig. </li><li> Mit einer zweiten Pinzette in der nicht-dominanten Hand, greifen die weibliche am vorderen Ende des Abdomensso dass das hintere Ende in Richtung auf die dominante Hand (2A) angeordnet ist. Stellen Sie sicher, die Fliege in den Medien unter Wasser zu halten. </li><li> Mit der dominanten Hand, verwenden Sie die Zange, um die Nagelhaut bei der 2. hintersten pigmentierte Segment packen und zerreißen es vom Rest des Bauches (2B-C). </li><li> Mit der Zange in der dominanten Hand, drücken Sie leicht die vorderen Ende des Abdomens, bis die Eierstöcke entstehen (Abb. 2D-E). Falls nötig, in die Zange zwischen den beiden Eierstöcke und ziehen sie aus der Karkasse. </li><li> Entweder gehen die Eierstöcke zu einer neuen und mit frischem Medium (2F) oder entfernen Sie die Karkasse zu einem Kimwipe oder Papiertuch. Dies ist besonders wichtig, wenn Follikel ist für die in vitro Entwicklung isoliert. </li><li> Wiederholen, bis 3-5 Paar Eierstöcke isoliert. HINWEIS: Jeder Eierstock ist von ~ 16 Ovariolen oder Ketten von sequentiell Reifung Follikel zusammen. Jeder Ovarioleinnerhalb einer Muskelhülle enthalten. </li><li> Mit Stift Schraubstöcke und die mit ihnen gelieferten Nadeln vorsichtig auseinander ziehen den Eierstock, indem Sie die Nadeln zwischen den Ovariolen (2G). Dies wird manchmal lösen die einzelnen Follikel als gut. </li><li> Individuelle Ovariolen und die leicht zu unterscheiden morphologischen Stadien der Follikel-Entwicklung sollte jetzt sichtbar (Abbildung 2G, neckte auseinander Ovar) sein. Siehe Fig. 1 und 2H morphologischen Unterschiede, die verwendet werden können, um die verschiedenen Phasen zu unterscheiden. Um Follikel, die in intakten Ovariolen sind und immer noch innerhalb einer Muskelhülle enthalten isolieren, verwenden Sie eine Nadel, über die an der vorderen Ovariole des vorangehenden Follikel und an der hinteren der Follikel unmittelbar nach der Follikel von Interesse geschnitten. Dadurch wird die Muskelhülle zu brechen und die Follikel von Interesse kann nun entfernt von den benachbarten Follikel ohne es zu beschädigen geschnitten werden. </li&gt; <li> Da die einzelnen Stufen voneinander getrennt sind, bewegen Sie die Follikel von Interesse, mit einer Glaspipette, zu einem neuen und frischen Medien. Dies ist besonders wichtig bei der Isolierung von Follikeln zur in vitro-Entwicklung. HINWEIS: Es ist wichtig, um die Pipette Glühbirne vor dem Eintritt in die Medien, um die Luftblasen aus Umverteilung der Follikel of Interest der auch verhindern zu quetschen. Außerdem, wenn die Follikel Verkleben mit der Glaspipette, die Pipette mit 3% Rinderserumalbumin (BSA) durch Pipettieren der BSA-Lösung und mehrmals nieder und Spülen mit Sezieren Medien vorbeschichtet werden. </li><li> Sobald genügend Follikel isoliert wurden, fahren Sie mit den nachfolgenden Experimenten. </li></ol> 3. In-vitro-Entwicklung von S10B Follikel <ol><li> Isolieren S10B Follikel mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) in IVEM Medien. Stellen Sie sicher, dass die Follikel schnell von Schutt bewegt. Da diese Follikel weiter zu reifen, ist es important dass S10Bs sind für 30-60 min gesammelt und dann in die Reifung Medium der Wahl gestellt. HINWEIS: S10B müssen sorgfältig von S10A Follikel (Fig. 1C im Vergleich zu 1B) unterschieden werden, wie S10A Follikel nicht im IVEM Kulturmedien reifen. In beiden S10A und S10B Follikel wird die Hälfte der Länge der Krankenschwester Zellen zusammengesetzt und die andere Hälfte ist die Eizelle, aber in S10B die Länge der Follikel gleich, dass der S14 Follikel ist. </li><li> Mit einer Glaspipette, bewegen ~ 30 S10B Follikel in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie überprüfen, ob alle der Follikel übertragen sind S10B und nicht zu S11 gereift. </li><li> Bereiten 1 ul der Reifung Medien pro Vertiefung, dh IVEM Medien sowie pharmakologische Reagenzien. </li><li> Mit einer Glaspipette gezogen *, entfernen Sie so viel Medien aus dem Brunnen (Schritt 3.2), wie möglich und schnell hinzufügen Reifung Medium der Wahl. HINWEIS: Es ist wichtig, ein Glas gezogen pip verwendenette als inszeniert Follikel kann leicht entweder mit Glaspipetten oder Pipettenspitzen mit einem Pipetman genommen werden. * Um gezogen Pipetten machen: 1) erhitzen das dünne Teil der lang, Glaspipetten in der Flamme eines Bunsenbrenners nur, bis das Glas weich zu werden beginnt, 2) die Pipette sofort zu bewegen aus der Flamme und ziehen horizontal, um die Pipette in zeichnen ein feiner Schlauch, 3) zu brechen, um eine Geldstrafe zu generieren. VORSICHT: Augenschutz wie Glasscherben können sich lösen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.4 für so viele Brunnen, wie das Experiment erfordert. </li><li> Lassen Follikel für&gt; 10 h entwickeln und Gäste die Entwicklungsfortschritt unter einem Binokular. HINWEIS: Die Experimente werden in der Regel am nächsten Tag hat, um ausreichend Zeit für die Follikel entwickeln kann. S10B ist ~ 5 Stunden, ist S11 ~ 30 min, S12 ~ 2 h und S13 ~ 1 Stunde Dauer bei 25 ° C 1 und Entwicklung bei Raumtemperatur wird etwas länger dauern. Ähnliche Experimente wie für S10B Follikel beschrieben werden kannunter Verwendung von S11-S13 Follikel. </li></ol> 4. Bühnen Isolierung für die Live-Imaging <ol><li> Isolieren spät Follikel (S10B-14), in den Fluoreszenzmarker der Wahl mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) in IVEM Medien, schnell bewegt Follikel weg von Schutt. </li><li> Bewegen Sie Follikel von Interesse in neuen Medien und dann durch Glaspipette übertragen, um einem Deckglas Boden Petrischale. Achten Sie auf Medien hinzufügen, so dass es sprudelt in der Deck unteren Bereich, aber nicht überschwappen. </li><li> Für längere Zeitraffer-Filme, ist es manchmal notwendig, um Feuchtigkeit in der Petrischale durch Zugabe einer aufgerollt Kimwipe, mit Wasser befeuchtet, an den inneren Rand der Petrischale zu halten. Legen Sie den Deckel auf. </li><li> Bild auf einem inversen Mikroskop. Detailauflösung wird der konfokalen Mikroskopie erforderlich. Es ist notwendig, Frequenz-Bildgebung, Beleuchtungsstärke und die Länge des Abbildungsleichen, dies muss unabhängig arbeitet werden für jedes lAbeling Werkzeug-und Entwicklungsprozess. </li></ol> 5. Bühnen Isolierung für die mRNA-Vorbereitung <ol><li> Isolieren Sie einzelne Stufe Follikel mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) entweder mit Grace oder IVEM Medien. </li><li> Mit einer Glaspipette, verschieben Sie die einzelnen Stufen von Interesse in neue Brunnen mit den Medien, ist es möglich, mehrere Stufen auf einmal zu sammeln. </li><li> Halten Abholzeiten unter 1 Stunde. Bewegen Sie die Follikel, mit einer Glaspipette auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Drehen Sie das Rohr kurz in einem Mini-Mikrozentrifuge, um alle Follikel zu pelletieren. Mit einer Glaspipette gezogen (siehe Schritt 3.4) entfernen Sie vorsichtig alle Medien. HINWEIS: Wenn Sie eine volle Größe Mikro, Spin-Down der Follikel bei niedriger Geschwindigkeit. </li><li> 100 l Trizol und schleifen von Hand für ~ 20 sec mit einem Kunststoff-Stößel. Spin down bei voller Geschwindigkeit in einer Mikro und bewegen Trizol auf ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig, keine pelletiert d störenebris. Bei -80 ° C </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,1-5,5 bis genügend Follikel wurden für das Experiment erhalten wurde. Routinemäßig ~ 75 S10B, ~ 75 S12 und S14 ~ 100 Follikel ergeben ~ 10 ug RNA. </li><li> Tauen Sie die Proben auf Eis. Kombinieren Proben, gegebenenfalls in ein Mikrozentrifugenröhrchen und bringen die Trizol Volumen von bis zu 800 ul. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung, wie vom Hersteller gerichtet. WICHTIG: Denken Sie daran, DNase behandeln die isolierte RNA mit RNase freier DNase. </li></ol> 6. Bühnen Isolation für Western Blotting <ol><li> Heizen Sie einen Wärmeblock bis 100 ° C </li><li> Isolieren Sie einzelne Stufe Follikel mit der Bühne Isolation Protokoll (Schritt 2) entweder mit Grace oder IVEM Medien. HINWEIS: Es ist notwendig, empirisch festzustellen, wie viele von einer bestimmten Stufe Follikel werden benötigt, um jede spezifische Protein zu beobachten. Für stark exprimierten Proteine ​​S10B 1-3 Follikel / gut genug, um ein starkes Signal auf einem Western-Blot zu sehen. Es ist jedoch wichtig, um einerepräsentativen Stichprobe unter Follikel aus mehreren Weibchen. Somit sind 15-20 Follikel einer bestimmten Stufe in der Regel gesammelt. </li><li> Follikel bewegen, unter Verwendung einer Glaspipette in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Spin kurz in einem Mini-Mikrozentrifuge, um die Follikel zu pelletieren (siehe Schritt 5.4). Mit einer Glaspipette gezogen Entfernen Sie vorsichtig alle Medien (siehe Schritt 3.4) und 50 ul 1x PBS und 50 ul 2x Laemmli-Puffer. </li><li> Schleifen von Hand für ~ 20 sec mit einer Kunststoff-Stößel. HINWEIS: Kunststoff Stößel kann zum Schleifen westlichen Proben durch Waschen und Autoklavieren sie wiederverwendet werden. </li><li> Kochen Sie die Proben für 10 min in der Wärmeblock. </li><li> Kühlen Sie kurz auf Eis und Spin bei voller Geschwindigkeit für 15 Sekunden in einer Mikrozentrifuge. Entweder sofort auf eine SDS-PAGE-Gel oder bei -20 ° C laden HINWEIS: Wenn die Proben gespeichert sind, denken Sie daran, die Proben vor dem Laden auf das Gel aufzukochen. </li><li> Führen Western-Blot-Analyse nach Standardprotokollen. </li></ol>

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</ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Die Drosophila Follikel von nur einer kleinen Anzahl von Zelltypen aufgebaut, so dass es ideal für morphologische und molekulare Analysen. Außerdem ist es aufgrund der Struktur des Eierstocks, ist es relativ einfach, eine große Zahl von spezifischen Stadien der Follikel-Entwicklung mit einem gemeinsamen Binokular und minimales Training erhalten. Wie jede Stufe stellt eine kurze Zeitfenster, können Stufen-Isolations signifikante Einblicke in die molekularen Entwicklungsprozesse während dieser Phase auftretenden ...

Jeder Drosophila Eierstock von ~ 16 Ovariolen oder Ketten von sequentiell Reifekammern oder-Ei Follikel zusammen. Jeder Follikel besteht aus einer einzigen Eizelle, 15 Keimbahn abgeleitet Krankenschwester oder Stützzellen und ~ 650 somatischen Zellen bezeichnet Follikel-Zellen (Abbildung 1A) zusammen. Wird Drosophila Oogenese in 14 morphologisch definierten Entwicklungsstufen 1 unterteilt. Jedes Stadium der Follikelentwicklung wird viele Male innerhalb einer Fliege beobachtet, so dass es relativ einfach, eine beträchtliche Anzahl von stufenspezifischen Follikel zu isolieren. Die mittleren bis späten Stadien der Oogenese (Stages 10B-14) sind besonders gut geeignet für die Bühne Trennung (Abbildung 1). In Stufe 10B (S10B) wird das Follikel vollständig gestreckt (dh gleich dem eines Stage-14 (S14) Follikel seine Länge, siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 H) und die Hälfte der Länge der Follikel der Krankenschwester Zellen zusammengesetztdie andere Hälfte ist die Eizelle (Abbildung 1C). In diesem Stadium die Krankenschwester Zellen durchlaufen dramatischen Aktin-Umbau, die Stärkung der kortikalen Aktin und Erzeugung parallelen Bündeln von Aktin-Filamenten 2. Zur gleichen Zeit, eine Bevölkerung von Follikel-Zellen, genannt zentripetalen Zellen wandern zwischen den Nährzellen und der Eizelle und zwei Rücken Gruppen von Follikelzellen angegebenen geworden, Migration zu unterziehen, um die Rückenanhänge, Röhrenatemgeräten für den Embryo bilden 3 . Die Zellen werden dann Krankenschwester Vertrag (S11), drückte ihre zytoplasmatische Inhalt in die Eizelle in einem Prozess namens Krankenschwester Zelle Dumping, das die Eizelle bietet mit den notwendigen Faktoren für sie Embryogenese (1D), um abzuschließen. Die Krankenschwester Zellen durchlaufen dann den Zelltod (S12-S13) 4, und die Follikel-Zellen sezernieren und die Eierschale Muster 5 (1E-G). So reich an wichtigen Entwicklungs eine ist das Ende der Oogenesed morphogenetischen Prozessen. Isoliert mittleren bis späten Stadium Follikel (S10B, S14) für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich der molekularen Analysen verwendet werden. Beispielsweise kann mRNA aus statt Follikel für RT-PCR, Microarray isoliert werden oder RNA-seq analysiert. Dies erlaubt es, bei der Genexpression in kurzer Entwicklungs Fenster schauen, mit nur wenigen Zelltypen vorhanden, und bestimmen, wie die Genexpression entweder durch pharmakologische oder genetische Störungen verändert. Stufe Isolierung kann auch verwendet werden, um auf Proteine ​​durch Western-Blotting zu suchen. Eine solche Analyse ist wichtig, weil es erlaubt, die Höhe der Proteinexpression in Wildtyp-Mutanten gegenüber in bestimmten Phasen zu quantifizieren. Während einer Immunfluoreszenzanalysen verwenden, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen, die Quantifizierung der Fluoreszenz weniger robust ist aufgrund der strengen Anforderungen, die alle Pixel innerhalb des linearen Bereichs des Nachweises 6 sein. Zusätzlich können Western-Blot-Analyse von anderen Informationen, wie eins, wenn das Protein posttranslational modifiziert oder von einer bestimmten Spleiß-Isoform exprimiert. Isoliert Stufen können auch für weitere Proteinreinigung, einschließlich subzelluläre Fraktionierung oder Coimmunpräzipitation verwendet werden. Stufe spezifischen Follikel Isolierung kann auch für die in vitro Entwicklung Assays 7 und Live-Abbildungs ​​8 verwendet werden. Isoliert S10B-S13 Follikel wird weiterhin auf S14 in einfachen Kulturmedien zu entwickeln (siehe unten). Es ist wichtig zu beachten, dass S10A Follikel nicht durch Dumping Krankenschwester Zelle mit Hilfe der Kulturbedingungen in diesem Manuskript diskutiert Fortschritte. Wir haben S10B in-vitro-Tests zur Entwicklung der Rolle der Prostaglandine sowohl pharmakologisch und genetisch zu definieren, bei der Regulierung der Aktin-Umbau durch die Verwendung Krankenschwester Zelle Dumping und Entwicklung Auslesen 7,9. Ebenso können die späteren Entwicklungsstadien isoliert werden, um die Wirkungen von pharmakologischen Behandlungen oder genetische Menschen bestimmenipulations auf bestimmte Prozesse wie zentripetale Zellmigration, Rücken Anhängsel Migration / Bildung 10 und Krankenschwester Zelltod. Solche Tests können verwendet werden, um dominante Wechselwirkung Bildschirmen oder Tests durchzuführen, zum Beispiel, während Heterozygotie für Mutationen in pxt oder Fascin allein haben keine Auswirkungen auf S10B in vitro Entwicklung von Follikeln Doppel Heterozygoten zeigen Krankenschwester Zelle Dumping Fehler und ein Block in der Entwicklung 9. Darüber hinaus, da S10B-13 in Kultur entwickeln, werden alle Prozesse, die während dieser Zeit auftreten kann mit Live-Bildgebung beobachtet werden. Solche Bildgebung kann einfach mit Durchlicht (wenn man nur daran interessiert, große Änderungen in der Morphologie ist) oder mit der konfokalen Mikroskopie mit transgenen Fliegen exprimieren Fluoreszenzsonden oder Follikel mit Live-Bildfarbstoffe gefärbt durchgeführt werden. Live-Bildgebung verwendet wird, um unser Verständnis der Entwicklungsprozesse wesentlich voranzubringen. Tatsächlich leben imaging spät Follikel hat das Wissen der dorsalen Anhängsel Migration, ein Beispiel Tubulogenese 10 erweitert. Wir erwarten, dass die Live-Darstellung von zusätzlichen späten Stadium Prozesse, einschließlich der Aktin-Dynamik während Krankenschwester Zelle Dumping, werden neue Einblicke in diesen Entwicklungs Veranstaltungen. Es ist wichtig zu beachten, dass während S10A und frühen Stadien der Follikel-Entwicklung wird nicht weiter in der Kultur in eine S14 zu entwickeln, ist Live-Imaging von Veranstaltungen in diesen Stadien der Entwicklung auftreten können, die alternative Kulturbedingungen 11-14 (siehe Diskussion für mehr Information). Hier bieten wir Ihnen ausführliche Protokolle zur Isolierung spät Follikel entweder für in-vitro-Entwicklung und Live-Bildgebung, oder molekulare Analysen (mRNA-und Protein-Trennung).

<table><tbody><tr><td>Aktive Trockenhefe</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Jede Quelle für aktive Trockenhefe ist in Ordnung</td></tr><tr><td>. s Insect Media</td><td>Lonza</td><td>04-457F</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals S11050H</td><td></td><td>Jedes hitzeinaktivierte FBS sollte funktionieren</td></tr><tr><td>10x Pen/Strep</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pin Schraubstöcke und Nadeln</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-10</td><td></td></tr><tr><td>Spot-Platte, Neun-Well-Corning</td><td></td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Becton Dickinson</td><td>35 3226</td><td>Jede 24-Well-Gewebekulturschale sollte funktionieren</td></tr><tr><td>Deckglas-Bodenschalen (35 mm)</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td>Die Deckglasdicke hängt vom Mikroskop ab/ Verwendetes Objektiv</td></tr><tr><td>Glaspipetten</td><td>Corning</td><td>7095B-5x (für den Transfer von Follikeln)</td><td></td></tr><tr><td>Glaspipetten - lang</td><td>Corning</td><td>7095B-9 (für die Herstellung von gezogenen Pipetten)</td><td></td></tr><tr><td>Probenstößel (1,5 &mu; l; RNase/DNase-frei)</td><td>Forschung Produkte International</td><td>199228</td><td>Jeder Kunststoffstößel, der für 1,5 μm geeignet ist; l Mikrofuge-Röhrchen können verwendet werden</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr></tbody></table>

das utility von stage-spezifischen mid-zu-spät<em&gt; drosophila</em&gt; follikel isolation

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila Oogenese oder Follikel-Entwicklung wurde häufig verwendet, um das Verständnis für komplexe Entwicklungsprozesse und Zell biologischen voranzutreiben. Das Methodenpapier beschrieben, wie Sie mittleren bis späten Stadium Follikel (Stufe 10B-14) zu isolieren und zu nutzen, um neue Einblicke in die molekularen und morphologischen Ereignisse während dichte Fenster der Entwicklungs Zeit auftreten werden. Isolierte Haarfollikel kann für eine Vielzahl von experimentellen Techniken, einschließlich in vitro-Assays Entwicklung, Echtzeit-Bildgebung, mRNA-Analyse und Western-Blot-Analyse von Proteinen verwendet werden. Follikel bei Stage 10B (S10B) oder später wird die Entwicklung in Kultur zu vervollständigen, dies erlaubt es, genetische oder pharmakologische Störungen mit in-vitro-Entwicklung zu kombinieren, um die Auswirkungen dieser Manipulationen auf die Prozesse zu bestimmten Zeiten auftretenden Entwicklung zu definieren. Darüber hinaus, da diese Follikel entwickeln, in der Kultur, sind sie ideal für Live-Imaging-Studien geeignet sind, Die oft zeigen neue Mechanismen, die morphologische Ereignisse zu vermitteln. Isoliert Follikel kann auch für molekulare Analysen verwendet werden. Zum Beispiel können Veränderungen in der Genexpression, die von genetischen Störungen führen zu spezifischen Entwicklungs Fenster definiert werden. Zusätzlich können Protein-Ebene, die Stabilität und / oder posttranslationale Modifikation Zustand während einer bestimmten Stufe der Follikelentwicklung durch Western-Blot-Analysen untersucht werden. So Stufe spezifischen Isolierung von Drosophila Follikel bietet eine reiche Quelle von Informationen in stark konservierten Prozesse der Entwicklung und Morphogenese.

Bei der Isolierung von spezifischen Stadien der Follikel-Entwicklung von Drosophila ist es wichtig, in der Lage, die unterschiedlichen morphologischen Stufen präzise zu unterscheiden. Dies ist für S10A und S10B etwas schwierig, da die Krankenschwester Zellen und die Eizelle nehmen jeweils die Hälfte der Länge der Follikel in diesen Phasen (Abbildung 1B im Vergleich zu 1C). Jedoch S10A Follikel kürzer als S10B Follikel, da die S10B Follikel vollständig gedehnt und somit in der L...

Stufe spezifischen Isolierung von mittleren bis späten Drosophila Follikel ist nützlich für eine Vielzahl von Zwecken. Wie Follikel in Kultur, die für die genetische und / oder pharmakologischen Manipulationen in vitro-Assays und Entwicklung die Bildgebung gekoppelt werden können. Zusätzlich kann Follikel für molekularbiologische Untersuchungen, wie Isolierung von mRNA und Protein verwendet werden.

Das Utility von Stage-spezifischen Mid-zu-spät<em&gt; Drosophila</em&gt; Follikel Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, spezifische Stadien von mittelreifen bis späten Ovarialfollikeln für eine Vielzahl von Experimenten zu isolieren, einschließlich molekularer Analysen, Live-Bildgebung und In-vitro-Entwicklungsassays. Dies wird erreicht, indem zunächst die Eierstöcke präpariert und anschließend in Follikel getrennt werden. Sobald Follikel eines bestimmten Stadiums isoliert wurden, können sie für molekulare Analysen, Live-Bildgebung oder die In-vitro-Entwicklung verwendet werden.Schließlich können die Ergebnisse zeigen, welche Aspekte der späten Drosophila-Oogenese durch spezifische Faktoren über pharmakologische und genetische Eingriffe in Kombination mit diesen Assays reguliert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Entwicklung und Zellbiologie zu beantworten, wie beispielsweise Aktin-, Zytoskelettdynamik, morphologische Prozesse, tubuläre Genese sowie Sekretion und Musterbildung der extrazellulären Matrix. Für dieses Protokoll sammeln Sie zwei Tage vor der Isolierung der Follikel gut genährte junge adulte Fliegen beiderlei Geschlechts.Wenn die Follikel im Anfangsstadium für die Entwicklung in vitro verwendet werde

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila melanogaster Hoden können schnell und effizient von erwachsenen Männern mit Sezieren Nadeln isoliert. Mit etwas Übung kann man leicht in ein oder zwei Tage zu isolieren einen Betrag von Hoden reicht für die Analyse von DNA oder RNA, die im Hochdurchsatz-Sequenzierung oder eher traditionellen Methoden der Molekularbiologie oder der Protein-Antikörper-oder Enzym-Assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

Dieses Video beschreibt eine Methode zur mechanischen Entfernung der Chorion- und Vitellinmembranen von zuvor fixierten reifen Drosophila-Eizellen. Das vorgestellte Protokoll zeigt eine detaillierte Demonstration des Verfahrens, das Eizellen liefert, die mit fluoreszierenden In-situ-Hybridisierungsassays kompatibel sind.

Mechanische Entfernung der Chorion- und Vitellinmembran: Eine Methode zur Vorbereitung von Drosophila-Eizellen für die direkte Beobachtung

Drosophila-Gewebe enthalten häufig eine heterogene Mischung von Zelltypen. Um die Genexpression in spezifischen Zelltypen aus einem bestimmten Gewebe zu untersuchen, können Keime genetisch markiert und anschließend mit einer Affinität-basierten Ansatz isoliert. Isolierte Kerne für nachgelagerte Anwendungen wie Genexpressionsanalyse und Chromatinimmunpräzipitation verwendet werden.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Kultivierung von intakten Hoden und Keimbahnzysten aus Puppen von Drosophila melanogaster. Diese Methode ermöglicht die mikroskopische Beobachtung der Spermatogenese ex vivo. Des Weiteren wird ein pharmakologischer Assay zur Wirkung von Inhibitoren auf bestimmte Stadien der Keimzellentwicklung im Puppenhoden beschrieben.

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

Die in diesem Protokoll beschriebene aufrechte Bildgebungsmethode ermöglicht die detaillierte Visualisierung der Pole eines sich entwickelnden Drosophila melanogaster-Eies.  Diese End-on-Ansicht bietet eine neue Perspektive auf die Anordnungen und Morphologien mehrerer Zelltypen im follikulären Epithel.

Upright-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Wir präsentieren Protokolle für die Entnahme, Aufbereitung und Bildgebung von reifen Drosophila-Eizellen. Diese Methoden ermöglichen die Visualisierung des Chromosomenverhaltens sowie des Spindelaufbaus und der Funktion während der Meiose.

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Ziel dieses Protokolls ist es, einen direkten und kostengünstigen Ansatz für die Sammlung von Drosophila- Embryonen im mittleren Maßstab (0,5-1 g) und die Herstellung von Proteinextrakten, die in nachgeschalteten proteomischen Anwendungen verwendet werden können, wie Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (AP-MS ).

Mittelmaßnahme Vorbereitung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoextrakte für Proteomversuche

Hier stellen wir ein Protokoll zur Trennung und Sortierung einer bestimmten Zellpopulation von den Drosophila männlichen Zubehördrüsen (Sekundärzellen) für RNA-Sequenzierung und RT-qPCR vor. Die Zellisolation erfolgt durch FACS-Reinigung von GFP-exezierenden Sekundärzellen nach einem mehrstufigen Dissoziationsprozess, der Dissektion, Proteasenverdauung und mechanische Dispersion erfordert.

Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

Hier stellen wir ein Sezierprotokoll zur Verfügung, das erforderlich ist, um die spätembryonale Drosophila-Gonade live zu fotografieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse unter normalen Bedingungen oder nach transgener oder pharmakologischer Manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Live-Bildgebung der asymmetrischen Teilung von Keimbahnstammzellen (GSCs) in der ovariellen Nische von Drosophila durchzuführen. Wir verwenden eine transgene Linie, die ubiquitär eine grün fluoreszierende Protein (GFP)-Fusion des Spektrosomproteins Par-1 exprimiert.

Erweiterte Live-Bildgebung von weiblichen Drosophila melanogaster Keimbahn-Stammzellnischen

Erfahren Sie die Isolierung mittlerer bis später Drosophila-Follikelstadien für Entwicklungsbiologie und molekulare Analysen. Diese Methode ermöglicht Live-Imaging und Untersuchungen zur Oogenese.

Das Utility von Stage-spezifischen Mid-zu-spät

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