Name: Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie eine empfindliche Durchflusszytometrie-Methode zur Quantifizierung zellulärer Seneszenz in Krebszellen. Diese Technik ermöglicht die schnelle Analyse chemotherapeutischer Wirkstoffe wie Doxorubicin.

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Wir danken dem SF 4206 ICORE (Université de Caen) für die Nutzung der Durchflusszytometrie Anlage. JC erhielt Post-Doc-Stipendien aus Conseil de Strahlenschutz d&#39;EDF und Conseil Régional der Basse-Normandie. Diese Daten wurden im Rahmen von Projekten von der Ligue Nationale contre le Cancer finanziert - Comités de l&#39;Orne et du Calvados.

1. Herstellung von C12FDG, Bafilomycin A1 und Zellkultur <ol><li> Man löst den C 12 FDG Pulver in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu einer Endkonzentration von 20 mM. Aliquot und bei -20 ° C DMSO sollte mit entsprechenden Sicherheits-Bedingungen verwendet werden. </li><li> Man löst den bafilomycin A1 Pulver in DMSO auf eine Endkonzentration von 0,1 mM. Aliquot und lagern bei - 20 ° C. Bafilomycin sollte mit entsprechenden Sicherheits-Bedingungen verwendet werden. </li><li> Kultivieren RPMI 8226-Zellinie, oder andere Zelllinien haftende oder nicht, in Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum und 1% Antibiotika, bei 37 ° C, 5% CO 2. Schätzen der Anzahl von Zellen für das Experiment benötigt. Um eine ausreichende Anzahl von Ereignissen in der Durchflusszytometrie aufgezeichnet werden 5 x 10 5 Zellen erforderlich. Um den Prozentsatz der alternden Zellen bestimmen, drei Zellproben erforderlich: für unmarkierte Proben, unbehandelte Zellen, die mit C 12 FDG gefärbt, behandelte Zellen angefärbt mitC 12 FDG. </li><li> Seed die Zellen 24 Stunden vor Durchführung des Experiments so dass die Zellen in der log-Phase der Zellproliferation Kurve sind. </li></ol> 2. Induktion von Seneszenz <ol><li> Induce Seneszenz von Krebszellen, indem Sie eine chemotherapeutische Medikament. Drug Konzentration und Dauer der Behandlung sollte der Zelltyp getestet angepasst werden. Beginnen mit einer 48-Stunden-Behandlung in einer Endkonzentration von 50 nM Doxorubicin für eine Konzentration der Zellen bei etwa 10 6 Zellen / ml. Vergessen Sie nicht, unbehandelten Probe sind (negative Kontrolle). </li></ol> 3. Bafilomycin A1 Behandlung <ol><li> Überprüfen Zelllebensfähigkeit durch Mischen von Zellen mit Trypanblau (v / v), die chemotherapeutische Medikament in dem vorhergehenden Schritt verwendet werden, um die Apoptose führen könnten. Füllen Sie in eine Kammer Malassez und zählen die Anzahl der blauen Zellen (tote Zellen) und der weißen Blutkörperchen (lebende Zellen). Wenn der Prozentsatz der Lebensfähigkeit ist weniger als 70%, vielleicht toten Zellen rem seinoved Verwendung eines geeigneten Kit, um sicherzustellen, dass tote Zellen nicht beeinflussen die nachfolgende Analyse. </li><li> Entfernen Sie die Kulturmedien und ersetzen durch vorgewärmte frische Kulturmedien. Behandeln der Zellen mit einer Endkonzentration von 100 nM bafilomycin A1. Bafilomycin A1 wird verwendet, um den sauren pH der Lysosomen zu neutralisieren. Inkubieren 1 h bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 4. C 12 FDG Färbung <ol><li> Auflösen C 12 FDG in vorgewärmte frische Nährmedien in einer Endkonzentration von 2 mM. </li><li> In der Verbindung zu den Zellen mit einer Endkonzentration von 33 uM und inkubiert 2 h bei 37 ° C, 5% CO 2. Bei der Verwendung von nicht-haftenden Zellen zentrifugiert, die Zellen bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C (die Geschwindigkeit haben könnte, um den verwendeten Zelltyp angepasst werden), 2x mit PBS waschen. Zellpellet in 500 ul kaltem PBS. Bei Verwendung von anhaftenden Zellen, entfernen Sie die Medien und waschen 2x mit PBS. Ernten Sie die anhaftenden Zellen unter Verwendung einer Trypsin-Lösung und ZentrifugeZellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C (die Geschwindigkeit möglicherweise zum verwendeten Zelltyp eingestellt werden). Zellpellet in 500 ul kaltem PBS. In beiden Fällen sollte die Zellkonzentration etwa 10 6 Zellen / ml. </li><li> Führen Sie eine Co-Immunmarkierung weiter zu charakterisieren, die Bevölkerung von alternden Zellen. </li></ol> 5. Durchflusszytometrie <ol><li> Kalibrieren des Durchflusszytometer unter Verwendung der Steuerung Perlen vom Hersteller des Durchflusszytometer empfohlen. Für alle Schritte müssen mindestens 10 4 Ereignisse aufgezeichnet werden sollen. </li><li> Führen Sie die erste Probe, die unmarkierten Zellen. Bereiten Sie eine Zwei-Parameter-Grafik Anzeige Forward Scatter Channel (FSC) gegen Side Scatter Channel (SSC). Stellen Sie die Photomultiplier Tubes (PMT) und definieren Sie einen Bereich von Interesse außer abgestorbenen Zellen und Zelltrümmer, die während der Probenvorbereitung erschien haben könnte. Tor diese Region von Interesse in einer Ein-Parameter-Histogramm, FL1 auf der logarithmischen Skalader x-Achse und die Anzahl von Ereignissen in der y-Achse. Die Gesamtzahl der Ereignisse die Anzahl der analysierten Zellen. Stellen Sie die PMT so dass unmarkierten Zellen in der ersten Dekade erscheinen auf der logarithmischen Skala der x-Achse. Bestimmen Sie die Autofluoreszenz der Zellen, wenn nötig. </li><li> Führen Sie die zweite Probe, die unbehandelten Zellen. Auf der Ein-Parameter-Histogramm, FL1 (Fluoreszenz von C 12 FDG), platzieren Sie den Cursor nach der schwach markierten Bevölkerung. Diese Schwelle wird es die Unterscheidung zwischen nicht-alternden Zellen (schwach markierten Zellen) und alternden Zellen (hell markierten Zellen). </li><li> Führen Sie die dritte Probe, die behandelten Zellen. Hell markierten Zellen scheinen also alternden Zellen über dem Schwellenwert in dem vorherigen Schritt bestimmt. Bewerten Sie den Prozentsatz der alternden Zellen, indem die Zahl der hellen Ereignisse pro Gesamtzahl der Veranstaltungen. Falls erforderlich, kann die Aktivität der β-Galactosidase auch unter Verwendung der mittleren Fluoreszenz werdenIntensität. </li></ol>

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li>
<li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li>
<li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li>
<li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis%3A+a+link+between+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li>
<li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li>
<li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%28beta%29-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446(2012).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir präsentierten hier eine Durchflusszytometrie basierende Methode, um zelluläre Seneszenz in lebenden Krebszellen zu quantifizieren. Diese Methode beruht auf der Verwendung der Membran durchlässig Verbindung, die C 12-FDG Basis und kann daher in allen Zelltypen und nach verschiedenen Behandlungen verwendet werden, solange die Verbindung von den Zellen aufgenommen. Nach Aufnahme in die Zelle ist die C 12 FDG hydrolysiert durch die β-Galactosidase, in Lysosomen von alternden Zellen angereichert. Na...

Seit Anfang der sechziger Jahre und seiner Entdeckung durch Hayflick und Moorhead, Seneszenz bleibt eine zelluläre Neugier 1. Menschliche Zellen nicht unbegrenzt vermehren und durch Seneszenz Hayflick und Moorhead den zellulären Alterungsprozess geprägt. Seneszenz ist eine stabile Arretierung des Zellzyklus in dem Zellen metabolisch aktiv bleiben, um Zelltod entgegen. Bisher wurden vier zellulären Mechanismen gezeigt, Seneszenz induzieren: Verkürzung der Telomere, DNA-Schäden, Chromatin Störung und abnormale Expression von Onkogenen mitogene 2. Dies deutet darauf hin, dass nicht nur normale Zellen, sondern auch Krebszellen sind in der Lage, Seneszenz 3 zu unterziehen. In der Tat wurden Krebszellen unterziehen Seneszenz gezeigt, um eine Barriere zur weiteren Tumorprogression 4-5 darstellen. Allerdings haben einige Berichte nun darauf hin, dass unter bestimmten Umständen, zelluläre Seneszenz kann auch die Förderung Bösartigkeit 6-7 hingewiesen. Studieren Seneszenz von Krebs cells ist im Begriff, ein Drang in der Krebsforschung als derzeit verwendeten Chemotherapeutika können Seneszenz von Krebszellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo 8 führen werden. Die Master-Assay, um das Vorhandensein von alternden Zellen zu untersuchen ist β-Galactosidase-Assay bei saurem pH-Wert. Diese histochemischen Test spiegelt die in lysosomalen Biogenese vorkommenden in den meisten alternden Zellen erhöht. Kurz gesagt, wird exogene X-gal, die auf Zellen von β-Galactosidase in Lysosomen von alternden Zellen angereichert gespalten, was zu einer blauen Farbe 9. Die blauen alternden Zellen können dann unter einem Hellfeld-Mikroskop quantifiziert werden. Obwohl sehr beliebt, stellt die β-Galactosidase Assay große Nachteile. Zuerst wird dieser Test auf fixierte Zellen durchgeführt. Zweitens ist es sehr zeitaufwendig, weil es um den Grad der Seneszenz durch Zählen eine signifikant hohe Anzahl von alternden Zellen unter einem Mikroskop zu quantifizieren impliziert. Drittens, dieser Testnicht empfindlich ist als die Unterscheidung zwischen alternden und nicht-alternden Zellen ganz auf die Betrachter. Wir diskutieren hier ein ungenutztes, schnell und empfindlich Durchflusszytometrie basierende Assay auf das Vorhandensein von lebenden alternden Zellen beurteilen. Dieser Assay auf der Hydrolyse von einer Membran durchlässig Molekül, das 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C 12 FDG) basiert, durch β-Galactosidase in alternden Zellen angereichert. Nach der Hydrolyse-und Laser-Anregung emittiert der C 12 FDG grüne Fluoreszenz und kann daher mittels Durchflusszytometrie 10, 11 detektiert werden. Der Nachweis von alternden Zellen via Durchflusszytometrie bietet den großen Vorteil, dass sie schneller und empfindlicher. Darüber hinaus kann die Erfassung von alternden Zellen mittels Durchflusszytometrie mit der Detektion von anderen zellulären Marker gekoppelt werden. Dieser Test kann verwendet werden, um alternde Zellen in einer Population von Krebszellen mit einer Chemotherapie behandelt werden, erkennen und kann routinemäßig eingestellt werdenauf Gewebeschnitten nach zellulären Dissoziation, in der Klinik.

<table><tbody><tr><td>5-Dodecanoylaminofluorescein di-&#946;-D-Galactopyranosid </td><td>Invitrogen</td><td>D-2893</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid </td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma</td><td>B1793</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Sandoz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Zellkulturmedium</td><td>Lonza</td><td>BE12-702</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>PAA Laboratories GmBH</td><td>A15 101</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td>Gibco</td><td>5290-018</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94291</td><td></td></tr></tbody></table>

eine empfindliche methode zur quantifizierung seneszente cancer cells

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Menschliche Zellen nicht unbegrenzt vermehren. Bei externen und / oder intrinsische Signale könnten Zellen sterben oder geben Sie einen stabilen Zellzyklus genannt Seneszenz. Mehrere zellulären Mechanismen, wie Telomerverkürzung und abnormale Expression mitogene Onkogene, haben gezeigt, dass Seneszenz bewirken. Seneszenz nicht auf normalen Zellen beschränkt; Krebszellen haben auch berichtet, altern. Chemotherapeutika wurde gezeigt, Seneszenz in Krebszellen zu induzieren. Es bleibt jedoch umstritten, ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung. Als es schließlich könnte Patienten-spezifischen, wird eine schnelle und empfindliche Methode zur Seneszenz in Krebszelle beurteilen bald erforderlich sein. Zu diesem Zweck stellt die Standard-β-Galactosidase-Assay wird die aktuell verwendete Methode, wesentliche Nachteile: es ist zeitaufwendig und nicht empfindlich. Wir schlagen hier eine Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Seneszenz auf li studierenve Zellen. Dieser Test hat den Vorteil, dass eine schnelle, empfindliche und können zur Immunmarkierung von verschiedenen zellulären Marker gekoppelt werden.

Multiples Myelom, eine hämatologische Malignität, wurde verwendet, um das Altern von einem chemotherapeutischen Verfahren induziert bewerten. Dazu muss ein handelsübliches MM-Zelllinie (RPMI 8226) für 2 Tage mit Doxorubicin, einem chemotherapeutischen Medikament behandelt wurde. Die Zellen wurden dann bafilomycin A1 unterzogen und weiter mit C 12 FDG inkubiert. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Abbildung 1 zeigt die verschiedenen Schritte und zeigt, dass der Prozentsa...

Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.

Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zellalterung auf schnelle und empfindliche Weise zu quantifizieren. Hier zeigen wir die Nützlichkeit dieser Methode bei der Untersuchung potenzieller chemotherapeutischer Wirkstoffe. Zunächst wird die zelluläre Seneszenz induziert.Das chemotherapeutische Medikament Doxorubicin wird Krebszellen zugesetzt. Anschließend wird Bain A eins angewendet, um den sauren pH-Wert der zellulären Lysosomen zu neutralisieren. Danach wird das zellgängige Beta-Galacto-Substrat C 12 FDG nach zellulärer Aufnahme hinzugefügt.Die C 12 FDG wird hydrolysiert und fluoresziert. Da beta-Galaktosidase in Lysosomen seneszenter Zellen angereichert ist, werden diese stärker fluoreszierend als nicht-seneszente Zellen. Um den Unterschied in der Fluoreszenz zu quantifizieren, werden die Zellen in einem Durchflusszytometer gemessen. Die Analyse der resultierenden Daten ermöglicht die Quantifizierung des Prozentsatzes seneszenter Krebszellen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie beispielsweise dem Beta-Galaktose-Assay besteht darin, dass sie eine schnelle und empfindliche Quantifizierung se

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Assay zur Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen mit dualen Seneszenzmarkern. Der Nachweis und die Quantifizierung seneszenter Zellen erfolgt unter Verwendung eines β-Galactosidase-Substrats. Das Substrat wird durch aktive lysosomale β-Galactosidase innerhalb der seneszenten Zellen gespalten, wodurch ein fluoreszierendes Produkt entsteht, das in Verbindung mit autofluoreszierenden Lipofuszin-Granulaten die...

Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

Hier diskutieren wir eine Reihe von Protokollen für die Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in kultivierten Zellen. Wir konzentrieren uns auf unterschiedlichen Seneszenz-induzierende Stimuli und beschreiben die Quantifizierung der gemeinsamen Seneszenz-assoziierten Marker. Wir bieten technische Details mit Fibroblasten als Modell, aber die Protokolle können verschiedene zelluläre Modelle angepasst werden.

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

Intrazellulären ROS hat nachweislich eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz. Hier beschreiben wir einen sensible Assay zur Quantifizierung der ROS Ebenen während der zellulären Seneszenz. Wir bieten auch Protokolle für die Beurteilung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, was angeblich zu verschiedenen altersbedingte Funktionsstörungen beiträgt.

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

Zelluläre Seneszenz ist der Schlüsselfaktor bei der Entwicklung chronischer altersbedingter Pathologien. Die Identifizierung von Therapeutika, die auf seneszente Zellen abzielen, verspricht, eine gesunde Alterung zu verlängern. Hier präsentieren wir einen neuartigen Test zur Identifizierung von Senotherapeutika auf der Grundlage der Messung der seneszenzassoziierten Galactosidase-Aktivität in Einzelzellen.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow für die metabolische Markierung von seneszenten und nicht teilenden Zellen mit gepulstem SILAC, ungezielter Massenspektrometrie-Analyse und einer optimierten Berechnung der Proteinhalbwertszeiten.

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

In dieser Studie werden die proliferativen Effekte von Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotypfaktoren (SASP) von seneszenten HeLa-Zellen auf nicht-seneszente HeLa-Zellen unter Verwendung von drei in vitro-Modellen mit Echtzeit-Monitoring untersucht. Die Vorteile und Grenzen der einzelnen Methoden wurden systematisch verglichen, um die Zell-Zell-Wechselwirkungen bei Krebs besser zu verstehen.

Bewertung der Wirkung von SASP-Faktoren auf die Proliferation von Krebszellen anhand einer vergleichenden Analyse von drei verschiedenen Methoden

Dieses Protokoll bietet eine reflektierte-licht-konfokale Mikroskopie zur objektiven, einzelzelligen Detektion der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-gal) Aktivität in der stromalen Gefäßfraktion, die aus menschlichem Fettgewebe isoliert ist. Die Methode ist mit der Immunzytochemie kompatibel, beinhaltet pH-Kontrollen zur quantitativen Beurteilung und bietet zudem eine sensiblere und weniger subjektive Alternative zur herkömmlichen SA-β-gal-Färbung.

Seneszenzdetektion mit reflektiertem Licht in der fettreichen stromalen Gefäßfraktion

Dieser Artikel stellt ein lebendzelliges LysoTracker-Protokoll zur Messung der lysosomalen Remodellierung während der Seneszenz in humanen Fibroblasten von IMR-90 vor.

Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Lernen Sie eine empfindliche Durchflusszytometrie-Methode zur Quantifizierung zellulärer Seneszenz in Krebszellen. Diese Technik ermöglicht die schnelle Analyse chemotherapeutischer Wirkstoffe wie Doxorubicin.

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