Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zellalterung auf schnelle und empfindliche Weise zu quantifizieren. Hier zeigen wir die Nützlichkeit dieser Methode bei der Untersuchung potenzieller chemotherapeutischer Wirkstoffe. Zunächst wird die zelluläre Seneszenz induziert.

Das chemotherapeutische Medikament Doxorubicin wird Krebszellen zugesetzt. Anschließend wird Bain A eins angewendet, um den sauren pH-Wert der zellulären Lysosomen zu neutralisieren. Danach wird das zellgängige Beta-Galacto-Substrat C 12 FDG nach zellulärer Aufnahme hinzugefügt.

Die C 12 FDG wird hydrolysiert und fluoresziert. Da beta-Galaktosidase in Lysosomen seneszenter Zellen angereichert ist, werden diese stärker fluoreszierend als nicht-seneszente Zellen. Um den Unterschied in der Fluoreszenz zu quantifizieren, werden die Zellen in einem Durchflusszytometer gemessen. Die Analyse der resultierenden Daten ermöglicht die Quantifizierung des Prozentsatzes seneszenter Krebszellen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie beispielsweise dem Beta-Galaktose-Assay besteht darin, dass sie eine schnelle und empfindliche Quantifizierung seneszenter Zellen ermöglicht. Tatsächlich entwickelten wir die Idee zu dieser Methode, als wir Schwierigkeiten bei der Quantifizierung seneszenter Zellen mittels des üblicherweise verwendeten Beta-Galaktose-Assays hatten. Obwohl wir diese Technik zur Detektion der Seneszenz in Krebszellen einsetzen, kann sie ebenfalls an normalen Zellen angewendet werden.

Mithilfe dieser Methode lassen sich schnelle Fragen im Krebsforschungsbereich beantworten, beispielsweise, ob ein chemotherapeutisches Medikament Krebszellen zur SSE induziert hat, was die Malignität fördern könnte. Somit könnte diese Technik letztendlich dabei helfen, neue therapeutische Behandlungen bei Krebs zu entwickeln. In einem chemischen Abzug wird das C 12 FDG-Pulver in DMSO gelöst, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar herzustellen, in Aliquots zu je 0,5 Milliliter in Eppendorf-Röhrchen abzufüllen und bei minus 80 Grad Celsius zu lagern.

DMSO sollte unter Einhaltung der entsprechenden Sicherheitsbedingungen verwendet und ebenfalls gelöst werden. CIN A1-Pulver in DMSO bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Millimolar lösen, die Lösung in 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen portionieren und bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Beachten Sie, dass die CIN unter Einhaltung geeigneter Sicherheitsvorkehrungen verwendet werden sollte. Dieses Verfahren kann mit anhaftenden oder nicht- anhaftenden Zellen durchgeführt werden. Hier wird das Verfahren anhand der humanen Myelomzelllinie RPMI 8 2 2 6 demonstriert.

Diese Zellen wachsen in Suspension; kultivieren Sie RPMI 8 2 2 6-Zellen in Medium mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid 24 Stunden vor Durchführung des Experiments. Säen Sie die Zellen in 6-Loch-Platten aus, sodass sie sich in der log-Phase der zellulären Proliferationskurve befinden. Zum Zeitpunkt des Experiments zur Bestimmung des Prozentsatzes seneszenter Zellen werden drei Zellproben benötigt: unbehandelte und nicht mit ST gefärbte Zellen, unbehandelte Zellen, die mit C 12 FDG gefärbt wurden, sowie behandelte Zellen, die mit C 12 FDG gefärbt wurden.

Für jede Bedingung werden mindestens fünf mal zehn hoch fünf Zellen für die Durchflusszytometrie-induzierte Seneszenz von Krebszellen benötigt. Durch Zugabe des chemotherapeutischen Wirkstoffs Doxorubicin sollten Konzentration des Medikaments und Dauer der Behandlung an den Zelltyp angepasst werden. Getestet an RPMI 8226-Zellen.

Seneszenz kann induziert werden, indem ein Zehntel der sechs Zellen pro Milliliter mit 15 Nanomolar Doxorubicin über 48 Stunden behandelt wird. Vergessen Sie nicht, eine unbehandelte Probe als negativen Kontrollansatz bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu inkubieren. Die Behandlung mit chemotherapeutischen Wirkstoffen kann zur Zellapoptose führen.

Daher zwei Tage später die Zellviabilität mittels Trypanblau-Ausschluss unter Verwendung eines Hämozytometers und eines Mikroskops überprüfen. Falls der Prozentsatz der Viabilität unter 70 % liegt, tote Zellen mit einem geeigneten Kit, wie beispielsweise dem Dead Cell Removal Kit von Milton E, entfernen, um sicherzustellen, dass tote Zellen die anschließende Analyse nicht verfälschen. Andernfalls das Kulturmedium entfernen, indem die Zellen fünf Minuten lang bei 300 ×g centrifugiert werden.

Danach nach dem Entfernen des Überstandes frisches, vorgewärmtes Kulturmedium mit 100 anom oder cin zugeben, um den sauren pH-Wert der Lysosomen zu neutralisieren, und eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Das Beta-galacto-A-Substrat C12-FDG in frischem, vorgewärmtem Kulturmedium bis zu einer Endkonzentration von zwei Millimolar auflösen. Nach der Inkubation mit Beilmycin.

Fügen Sie C 12 FDG direkt den Zellen und dem Medium hinzu, um eine Endkonzentration von 33 Mikromolar zu erreichen, und inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Zentrifugieren Sie nach der Inkubation die Zellen fünf Minuten bei 300 G und vier Grad Celsius.

Nach dem Zentrifugieren waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, wobei jedes Mal wie zuvor zentrifugiert und nach dem zweiten Waschschritt der Überstand entfernt wird. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern kaltem PBS und führen Sie anschließend eine Ko-Immunmarkierung durch, um die Population der seneszenten Zellen weiter zu charakterisieren. Falls Sie keine Erfahrung mit der Durchflusszytometrie haben, wird der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens die Durchführung der Durchflusszytometrie-Analyse sein.

Um Erfolg sicherzustellen, sollten Sie unbedingt die geeigneten Kontrollen einbeziehen und bei Bedarf Unterstützung von einer erfahrenen Person einholen. Bevor Sie die erste Probe analysieren, erstellen Sie eine zweiparametrige Grafik, die den Vorwärtsstreulichtkanal (FSC) gegen den Seitwärtsstreulichtkanal (SSC) darstellt. Anschließend analysieren Sie die erste Probe mit unbehandelten Zellen.

Stellen Sie die Photomultiplier-Röhren (PMTs) ein und definieren Sie einen Bereich von Interesse, wobei tote Zellen und zelluläre Trümmer, die während der Probenvorbereitung entstanden sein könnten, aus dem Gate ausgeschlossen werden. Dieser Bereich von Interesse befindet sich in einem eindimensionalen Histogramm, das die Fluoreszenz von C 12 FDG als FL1 auf der logarithmischen Skala der X-Achse und die Anzahl der Ereignisse auf der Y-Achse darstellt. Die Gesamtanzahl der Ereignisse entspricht der Anzahl analysierter Zellen.

Stellen Sie die PMT so ein, dass unbehandelte Zellen im ersten Dekadenbereich auf der logarithmischen Skala der x-Achse erscheinen. Bestimmen Sie gegebenenfalls die Autofluoreszenz der Zellen, indem Sie die unbehandelten Zellen im Durchfluss zählen. Führen Sie die zweite Probe mit unbehandelten Zellen am Durchflusszytometer aus, und zeigen Sie das Ein-Parameter-Histogramm für FL an, wobei Sie den Cursor hinter der schwach markierten Zellpopulation positionieren.

Diese Schwelle ermöglicht die Unterscheidung zwischen nicht-seneszenten Zellen, die schwach markiert sind, und seneszenten Zellen, die intensiv markiert sind. Führen Sie die dritte Probe mit behandelten Zellen durch. Intensiv markierte seneszente Zellen erscheinen oberhalb der in dem vorherigen Schritt bestimmten Schwelle.

Werten Sie den Prozentsatz seneszenter Zellen gegebenenfalls aus, indem Sie die Anzahl der hellen Ereignisse durch die Gesamtanzahl der Ereignisse dividieren. Die Aktivität der Beta-Galaktosidase kann auch anhand der mittleren Fluoreszenzintensität geschätzt werden, um die durch ein chemotherapeutisches Verfahren induzierte Seneszenz zu bewerten. Die kommerziell verfügbare Multiplen Myelom-Zelllinie R RRP I 8 2 2 6 wurde zwei Tage lang mit Doxorubicin, einem chemotherapeutischen Wirkstoff, behandelt und anschließend wie in diesem Video beschrieben auf Seneszenz untersucht. Diese Histogramme zeigen links die Fluoreszenz unbehandelter Zellen und rechts die behandelten Zellen.

Eine Population stark gefärbter Zellen, die seneszente Zellen darstellen, erscheint im Bereich V. Parallel dazu wurde die gleiche Zellprobe mit dem Beta-Galaktosidase-Assay gefärbt. Auf diesem repräsentativen Bild sind vollständig blaue und teilweise blaue Zellen dargestellt, um die Schwierigkeit zu verdeutlichen, tatsächlich blaue seneszente Zellen zu erkennen. Um die Spezifität von C 12 FDG bei der Bestimmung des Prozentsatzes seneszenter Zellen zu veranschaulichen, wurden die Zellen zudem mit verschiedenen Konzentrationen von Doxorubicin behandelt.

Der Prozentsatz seneszenter Zellen wurde ermittelt, indem die Anzahl der hellen Ereignisse durch die Gesamtanzahl der Ereignisse dividiert wurde. Die Anteile seneszenter Zellen betrugen 0,8 %, 15,78 % und 26,31 % für eine Dosis von 5, 25 bzw. 50 Nanomolar Doxorubicin. Dies zeigt, dass die C 12 FTG-Markierung spezifisch für seneszente Zellen ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie seneszente Zellen mittels Durchflusszytometrie quantifiziert werden können oder nicht, nachdem Methoden wie immunzytochemische Markierung durchgeführt wurden, um seneszente Zellen zu charakterisieren. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit DMSO oder Krebszellen äußerst gefährlich sein kann. Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.