Name: Prüfung der Drosophila Larven Tracheal Terminal-Cells durch Lichtmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Lichtmikroskopie-Methode zur Analyse trachealer Terminalzellen in Drosophila-Larven. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Verzweigungs- und Lumenmorphologie für genetische Entwicklungsstudien.

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Wir danken Gillian Stanfield für Kommentare zum Manuskript. TAJ wird von der University of Utah Genetics Ausbildungsförderung T32-GM007464 von NIH NIGMS unterstützt.

1. Mosaic-Generation <ol><li> Genetische Kreuz w FRT 19A Badewanne: GAL80 FLP 122 / Y; BTL-GAL4, UAS-GFP (Männchen) X * FRT 19A / Bal (Frauen), wobei * für die Mutante untersucht werden. Hinweis: Richten Sie überqueren mindestens einen Tag vor dem Experiment, da dies ermöglicht Tiere angemessen zu paaren. </li><li> Pre-lay: Transfer Kreuz zu fliegen-Food-Fläschchen mit einem kleinen Abstrich frische Hefe Paste auf den Medien platziert. Man lässt 1 Stunde bei 25 ° C lag </li><li> Lay: Transfer von Tieren vor der Verlegung in ein frisches Fläschchen Fläschchen mit einem kleinen Abstrich frische Hefe Paste. Lassen Sie für 6 Stunden bei 25 ° C lag </li><li> Übertragen Erwachsenen zurück vor, lag Fläschchen für die Lagerung und den Einsatz in nachfolgenden Experimenten. Unmittelbar Hitzeschock die Laien Fläschchen mit 0-6 Stunden alte Embryonen für 45 min bei 38 ° C, in einem zirkulierenden Wasserbad. Hinweis: Die Oberfläche des Lebensmittels sollte unterhalb des Wasserspiegels, alle zu überprüfenEmbryonen werden entsprechend erwärmen schockiert. </li><li> Inkubieren wärmegeschockt Fläschchen bei 25 ° C für 4-5 Tage bis zum dritten Larvenstadium beginnen zu wandern. </li></ol> 2. Schirm für Mosaic Tiere <ol><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig holen wandernden dritten Larvenstadium von den Seiten des Fläschchens und legen Sie sie in ein gekühltes 100% Glycerin in einem kleinen Kunststoff-Platte. </li><li> Untersuchen Larven mit einer hohen Vergrößerung-Binokular mit fluoreszierenden Optik ausgestattet. Identifizieren Larven mit Mosaik-Expression von fluoreszenzmarkierten trachealen Zellen. Typischerweise kann dies in 10-20-facher Vergrößerung durchgeführt werden. </li></ol> 3. Wärmefixierung <ol><li> Mit feinen Pinzette sorgfältig auswählen Mosaik Tiere aus der Schale und in einem Tropfen frisch 100% Glycerin auf einem 75x25x1 mm Weißglas Objektträger. Hinweis: mehrere Tiere können in der Dropdown (Abbildung 1A) platziert werden. Tiere können auch in einem Tropfen Glycerin direkt auf einem Deckglas platziert werden,aber es muss während der Fixierung (Schritt 3.2) genommen werden, da die Tiere sehr schnell erwärmen wird und kann sich über-fixed. </li><li> Platz Glasträger auf 70 ° C Heizblock bis die Tiere einfach nicht mehr bewegen, nicht mehr als 20 Sekunden für eine Folie, und 10 sec für ein Deckglas (Abbildung 1B). Tiere zappeln zunächst aber stoppen und steif und längliche einmal tot ist. Hinweis: überlange Wärmeeinwirkung wird Endästen und Lumen sowie um das GFP-Signal schwach und diffus beschädigen. Für eine optimale Effizienz empfiehlt es sich, um die Wärme-Block im selben Raum wie die Mikroskope haben. </li><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig orientieren alle Larven im Drop in eine einzige Richtung, so dass alle Larven auf der Folie parallel zueinander (Fig. 1c). </li><li> Sanft legen eine micro 18x18mm Deckglas auf der Oberseite der Larven (oder invertieren das Deckglas auf einen Glasträger) und Bildung von Blasen zu vermeiden (Abbildung 1D). Hinweis: Deckglas kann nicht genau liegenflach über Larven, ist dies kein Problem. </li><li> Bild Larven innerhalb von 30 min. Wärme Festanschlusses Zellen abgebaut wird und GFP-Signal wird sehr diffus. </li></ol> 4. In vivo Imaging von Tracheal Terminal-Cells <ol><li> Legen Sie gleiten auf der Bühne einer Verbindung Stereomikroskop. Mit einem Ziel 5X lokalisieren die beiden parallelen Leitungen ausgeführt dorsal von anterior auf der dorsalen Fläche des Tieres (1F) posterior. Suchen Sie die beiden dorsalen Terminal Zellen, direkt zwischen den beiden dorsalen Stämme. Dies hilft bei der Identifizierung der entsprechenden Segment für die Analyse. </li><li> Einmal ausgerichtet, drehen die Tiere Bild gewünschte Terminal Zellen. Um dies zu tun, sorgfältig schieben das Deckglas auf dem Rand mit der Zange senkrecht zur Längsachse der Larven, langsam rollen die Larven unter dem Deckglas (1E und 1G). </li><li> Die Auswahl der richtigen Terminal Zellen ist entscheidend für konsistente Ergebnisseund Vergleiche zwischen den Mutanten. Die Fettkörper Zweig (FB) Terminalzellen sind leicht zu finden neben dem dorsalen Stamm, lateral der Mittellinie. Die seitlichen Gruppe G Terminal Zellen (LG) sind leicht zu finden und befindet sich nur lateral der ventralen Mittellinie (Abbildung 1H). Hinweis: in den vorderen (Tr1) und posterioren (Tr10) die Anordnung der Segmente Terminal Zelle ist abweichend von anderen Segmenten. Wir analysieren nur Terminal Zellen in Segmente Tr2-Tr9. Dorsal Terminal Zellen haben eine stereotype Verzweigungsmuster als andere tracheal Terminal Zellen. Dies kann auf zusätzliche, nicht-Zell-autonome Signale ab, und dies sollte bei der Entscheidung, ob sie in der Analyse erweitert werden. </li><li> Sobald ein Terminal Zelle von Interesse identifiziert worden ist, ein Bild aufzunehmen mit der gewünschten Vergrößerung; typischerweise 10X oder 20X besten ist (Abbildung 2A). Hinweis: Aufgrund der variablen Verzweigung Muster, versuchen Sie, so viele Bilder, die Äste und Zweigspitzen wie möglich zu erfassen sind. </li><li> Ohne sich zu bewegen auf die Bühne, schalten Sie die Fluoreszenz und schalten Sie den Durchlicht Hellfeld, ein Bild von der gleichen Zelle und Bildebene (2B) zu erfassen. Das Lumen wird man sich als dunkel abgesetzte innerhalb des Terminals Zellraum. Wenn die Planung auf quantifizieren Endzelle Filialen und Lumen, sammeln mehrere Bilder in verschiedenen Fokusebenen jedem Endgerät Zelle. </li></ol> 5. Analyse und Quantifizierung des Terminal Zellmorphologie mit ImageJ <ol><li> Öffnen Sie die Leuchtstoff-und Hellfeld Bilder mit dem ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) Plug-in NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Mit dem &quot;Add-Kurs&quot; Werkzeug manuell verfolgen die Zweige und das Lumen des gesamten Terminal Zelle. </li><li> Mit dem &quot;Label-Kurven&quot;-Werkzeug, umbenennen und recolor um jede Zeile in der Spur eine spezifische Bezeichnung zuordnen. </li><li> Mit dem &quot;Set Parameter&quot;-Werkzeug, stellen Sie die Linienbreite 6-10 Pixel (für 512x512 Bilder von der Digitalkamera mit dem zusammengesetzten Mikroskop erhalten. Für höhere oder niedrigere Auflösung Kameras, die Pixel-Breite sollte entsprechend skaliert werden), mit allen anderen Standardeinstellungen, und wählen Sie &quot;OK&quot;. Dann nutzen Sie die &quot;Make Momentaufnahme&quot; Werkzeug, um ein Bild aufzunehmen. Wählen Sie &quot;Zeichnen Spur&quot;, um eine Momentaufnahme der Spur, die Side-by-side gezeigt kann mit dem originalen werden erhalten. </li><li> Wählen Sie das &quot;Measure Kurven&quot;-Werkzeug und wählen Sie das Tracing-Typ (dh, die Zweige zu messen über die spezifischen Bezeichnungen in Schritt 5.3 zugewiesen basierend). Als nächstes wählen Sie &quot;Display Tracing Messungen&quot; und &quot;Clear früheren Messungen&quot;, dann auf &quot;Ausführen&quot;. Dies erzeugt eine Tabelle, die den Namen, Label, Länge (in Pixeln) und andere Daten für das Bild enthält. Diese Daten können dann als Microsoft Excel-Tabelle zur weiteren statistischen gespeichert werdenAnalyse. </li></ol>

<ol><li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li>
<li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li>
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<li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+GFP%2F%C3%9F-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li>
<li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila%3A+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanzielles Interesse haben.

Die Wärmefixierung hier beschriebene Technik ist eine schnelle und bequemes Werkzeug für Imaging Drosophila Larven tracheal Terminal Zellen. Hier verwenden wir diese Technik, um die Verzweigung und Lumen Muster von Wildtyp-Zellen zu untersuchen. Tracheal-Zellen, die GFP durch die Luftröhre Promotor atemlos angetrieben, können leicht sichtbar durch die Larvencuticula nach Wärmefixierung. Die spezifischen Verzweigungsmustern einzelnen Terminal-Zellen, sowie die von den mit Luft gefüllten Hohlraum, kann s...

Zellform ist entscheidend für die Funktion der einzelnen Zellen in einem Organismus, sowie Zellen, die als Teil eines Gewebes oder Organs. Wir verwenden Drosophila tracheal Terminal-Zellen, eine Komponente des Insekts Atmungsorgane, um die molekularen Mechanismen, die bei der Kontrolle zwei konservierte Arten von zellulären Morphologie teilnehmen zu untersuchen: Verzweigung und tube formation (lumenogenesis). Terminal-Zellen an den Spitzen eines Netzes von verzweigten Rohren angeordnet ist, daß Funktionen, um Sauerstoff zu inneren Gewebe 1 zu liefern und eine aufwendige verzweigten Morphologie, die auf einer FGF Signalweg, der durch lokale Sauerstoffgehalt im Zielgewebe 2 gesteuert abhängt. Terminal-Zelle Zweige sind dünne Röhren, mit einem gasgefüllten subzellulären Lumen, die durch jeden Zweig. Die unterschiedlichen zellulären Architekturen Terminal Zellen zusammen mit der Leichtigkeit, mit der genetischen Analyse in Drosophila durchgeführt werden kann, um diese Zellen ein ausgezeichnetes Modell foder die Untersuchung der zellulären Mechanismen Auswuchs, Verzweigung und intrazellulären tube formation. Terminal-Zellen haben ein nützliches Modell für das Verständnis einige der Signalwege, die zu verzweigten Zelldifferenzierung, Auswuchs und Reifung 2-4 bewiesen. Mit diesem System unvoreingenommene, haben uns genetischen Screens für Zellmorphogenese Mutanten durchgeführt, wodurch Einblicke in Mechanismen, die Zellform 5,6. Zum Beispiel haben diese Bildschirme enthüllt, dass ein bestimmtes RabGAP für Zytoskelett Polarität und Vesikeltransport in Lumenbildung und Positionierung 7 erforderlich ist; dass Integrin-vermittelte Adhäsion für Zweig Stabilität 8 gefordert wird, und dass die epithelialen PAR-Proteine ​​regulieren Polarität polarisierter Membran Menschenhandel erforderlich sowohl für Verzweigung und Lumenbildung 9. Andere Studien in Terminal Zellen haben gezeigt, dass asymmetrische Aktin Akkumulation und Organisation der Mikrotubuli für die Zell-Dehnung und lumenogenesis erforderlich <sbis&gt; 10. So tragen diverse, konservierten zellbiologischen Mechanismen der Klemme Zellmorphogenese. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um schnell beheben intakt dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zur Analyse der Endzelle Verzweigung und Lumenbildung. Dieses Protokoll kann auch auf beide ersten und zweiten Larvenstadium Tieren durchgeführt. Der Schlüssel zu dieser Technik ist die Fähigkeit, Zellen, die gentechnisch Terminal durch fluoreszierende Protein-Expression direkt durch die Larvencuticula von intakten Tieren gekennzeichnet visualisieren. Da dieses Verfahren benötigt keine Postfixierung Manipulationen, wie z. B. Antikörper-Färbung, um die Zellen zu beobachten, ist es gut für das Hochdurchsatz-Analyse geeignet, einschließlich genetischer oder Wirkstoff-Screening. Fluorescent Protein-Expression zeigt die Struktur der zytoplasmatisch gefüllten Ästen. Rohr-Bildung kann in parallel mit Hellfeld den gasgefüllten Lumen, die mit der umgebenden Flüssigkeit zu füllen kontrastiert identifizieren überwacht werdened Gewebe. Inbegriffen in diesem Protokoll ist das Verfahren zur Erzeugung von genetischen Mosaiken an der MARCM System 11, um homozygote Mutante Terminal Zellen mit fluoreszierenden Proteinen in ansonsten unmarkierten Tieren markierten Produkten. Dies ist notwendig, da nur Zellen Terminal erarbeiten ihren komplexen Strukturen relativ spät in der Entwicklung; genetischen Mosaiken ermöglichen Bypass Gen Anforderungen in anderen Geweben früher in der Entwicklung. . Um MARCM Klone erzeugen, Luftröhre sind beschriftet mit der Tracheal-spezifische Treiber atemlos (BTL) 12 Beschrieben ist hier das Protokoll für die Drosophila X-Chromosom, bei anderen Chromosomen, ein ähnliches Verfahren verwendet, mit genetischen Reagenzien werden, die dem Chromosom ist untersucht. Hier werden Luftröhre durch Expression einer cytoplasmatisch lokalisierten GFP-markierten, aber das Verfahren funktioniert genauso gut mit der Expression anderer fluoreszierende Proteine ​​wie DsRed. Darüber hinaus haben wir ein Verfahren zur Verzweigung Muster und Lumenbildung im Terminal Zellen quantifiziert, basierend auf Methoden zur Charakterisierung neuronalen Verzweigungsmustern 13 entwickelt enthalten. Diese Art von quantitativen Daten kann kritisch sein in der anspruchsvollen genaue Rolle von Genen bei der Verzweigung oder lumenogenesis Prozess, sowie die Möglichkeit für direkte Vergleiche zwischen verschiedenen Mutanten 9.

<table><tbody><tr><td>Student Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 Präpariermikroskop (oder gleichwertig)</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>AxioImager M1 Verbundmikroskop (oder gleichwertig)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Ausgestattet mit AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filterset 38HE</td></tr><tr><td>100% Glycerin</td><td>BioExpress</td><td>M152-4L</td><td></td></tr><tr><td>Genotyp</td><td></td><td></td><td>: mit FRT19A Wanne:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td></tr><tr><td>Fliegenschaft</td><td></td><td></td><td>Genotyp: y w FRT19A</td></tr></tbody></table>

prüfung der<em&gt; drosophila</em&gt; larven tracheal terminal-cells durch lichtmikroskopie

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Zellform ist entscheidend für die Zellfunktion. Doch trotz der Bedeutung der Morphologie der Zellen, ist wenig darüber, wie einzelne Zellen erzeugen spezifische Formen bekannt. Drosophila tracheal Terminal Zellen haben sich zu einem mächtigen genetisches Modell zu identifizieren und erläutern die Rolle von Genen benötigt zur Erzeugung von zellulären Morphologie. Terminal-Zellen sind eine Komponente eines verzweigten röhrenförmigen Netzes, die Tracheen, dass Sauerstoff zu liefern inneren Geweben dient. Terminal-Zellen sind ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Fragen der Zelle Form, wie sie zwei unterschiedliche zelluläre Architekturen besitzen. Zuerst müssen Klemme Zellen eine aufwendige verzweigten Morphologie ähnlich komplexen Neuronen, zweitens Endzelle Zweige als dünne Rohre ausgebildet und enthalten eine membrangebundene intrazellulären Lumen. Quantitative Analyse von Zell-Terminal Zweig-Nummer, Branchenverband und einzelne Zweig Form kann verwendet werden, um Informationen über die Rolle von spezifischen genetischen mech liefernnismen in der Herstellung eines verzweigten Zelle. Analyse tube formation in diesen Zellen zeigen konservierten Mechanismen Tubulogenese gemeinsam mit anderen rohrförmigen Netzwerke wie das Wirbeltier Gefäßsystem. Wir beschreiben Techniken, die verwendet werden, um schnell zu beheben, Bild werden kann und zu analysieren und sowohl Verzweigungsmustern tube formation in Terminal Zellen in Drosophila-Larven. Diese Techniken können verwendet werden, um Zellen Terminal in Wildtyp-und mutierten Tiere, oder genetische Mosaike zu analysieren. Aufgrund der hohen Effizienz des Protokolls ist es auch gut für genetische, RNAi-oder Drogen-Bildschirme in der Drosophila Tracheensystem geeignet.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. Eine einzelne seitliche Gruppe (LG) Endzelle umfaßende subzellulären Verzweigung (visualisiert GFP, A) und einem gasgefüllten subzellulären Lumen, die durch jeden der Zweige (visualisiert Hellfeld; B). Diese Bilder wurden von einem Mosaik L3 Larve gesammelt, unter Verwendung der MARCM System in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben, und Wärme fixiert und abgebildet wird, wie in den Abschnitten 3 und 4 beschrieben. Panels C &amp; D zeigen eine NeuronJ erzeugt...

Hier präsentieren wir eine Methode für die Lichtmikroskopie Analyse der Luftröhre Terminal Zellen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Prüfung der Branche und Lumen Morphologie in ganzen Tieren und wäre nützlich für die Analyse der einzelnen Mutanten oder Bildschirme für Mutationen, die Terminal-Zell-Entwicklung.

Prüfung der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Tracheal Terminal-Cells durch Lichtmikroskopie

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, intakte Drosophila-Larven schnell zu fixieren, um die Morphologie von Verzweigungen und Röhren in terminalen Tracheenzellen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst homozygote, mit einem fluoreszierenden Protein markierte terminale Zellen in genetisch mosaikartigen Tieren erzeugt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, mosaikartige Larven zu sammeln und sie durch Hitze zu fixieren.Der dritte Schritt ist die Abbildung markierter terminale Zellen in fixierten Tieren mittels GFP-Expression zur Beobachtung der Verzweigungen und mittels Hellfeldmikroskopie zur Beobachtung der R&ouml;hrchen. Der letzte Schritt besteht in der Quantifizierung der Morphologien terminale Zellen. Letztendlich k&ouml;nnen die Ergebnisse genutzt werden, um unterschiedliche zellul&auml;re Morphologien von Wildtyp- und Mutanten-Zellen zu unterscheiden und einzuordnen.Der einzige Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der chemischen Fixierung besteht darin, dass diese Technik äußerst schnell ist und daher für die Analyse trachealer Endzellen mit hohem Durchsatz verwendet werden kann. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Auswählen von L3-Larven und deren schnelle Fixierung zur Erhaltung der Morphologie Sorgfalt und Aufmerksamkeit erfordert. Um Mosaikfliegen herzustellen.Verwenden Sie die Mark-M-Methode mit Weibchen, die die zu untersuchende Mutation tragen. Stellen Sie die Kreuzungen in Vorrang-Gelegenr&ouml;hrchen mit einem Tupfer frischer Hefepaste her und lassen Sie die Fliegen eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius Eier legen. Anschlie&szlig;end transferieren Sie die Fliegen aus dem Vorrang-Gelegenr&ouml;hrchen in ein frisches R&ouml;hrchen mit frischer Hefepaste und lassen Sie sie sechs Stunden lang bei 25 Grad Celsius Eier legen.Nach sechs Stunden die erwachsenen Fliegen zurück in Vials mit frischem Medium überführen, um sie für die Lagerung und unmittelbare Verwendung in nachfolgenden Experimenten bereitzustellen. Die gesammelten Gelege-Vials für 45 Minuten bei 38 Grad Celsius in ein Umlaufwasserbad geben; dabei sollte die Oberfläche des Nährbodens unterhalb des Wasserstandes liegen, um sicherzustellen, dass alle Embryonen angemessen hitzeschockiert werden. Danach die hitzeschockierten Vials vier bis fünf Tage bei 25 Grad Celsius inkubieren, bis sich Larven des dritten Instars entwickelt haben.Beginnen Sie damit, mithilfe feiner Pinzette zu wandern. Heben Sie vorsichtig wandernde Larven des dritten Instars von den Seiten des Gefäßes ab und legen Sie sie in eine kleine Kunststoffschale mit gekühltem 100 % Glycerin. Untersuchen Sie die Larven unter einem Auflichtmikroskop mit Fluoreszenzoptik bei 10×- oder 20×-Vergrößerung. Identifizieren Sie die Larven mit mosaikartiger Expression fluoreszenzmarkierter trachealer Zellen. Anschließend wählen Sie diese Tiere vorsichtig mit feiner Pinzette aus und platzieren sie in einen Tropfen frischem 100 % Glycerin auf einem weißen Glasobjektträger. Mehrere Tiere können in demselben Tropfen im gleichen Raum wie das Mikroskop platziert werden.Legen Sie den Objektträger auf einen Wärmesammler mit 70 Grad Celsius, bis die Tiere sich gerade nicht mehr bewegen, was innerhalb von 20 Sekunden der Fall ist. Anfangs zucken die Tiere, doch sie werden daraufhin starr und gestreckt. Ein zu langes Verweilen führt nach dem Tod zu Hitzeschäden an den terminalen Ästen sowie zu Schäden an den Lumina.Das GFP-Signal wird schwach und diffus. Der Zeitpunkt der Hitzefixierung ist entscheidend, da eine Überfixierung die Zellen beschädigen und zu irreführenden oder schwierigen Analysen führen kann. Die Proben sollten daher in den Wärmeblock gegeben und fixiert werden, bis sie sich gerade nicht mehr bewegen, jedoch nicht länger.Ordnen Sie nun mithilfe einer feinen Pinzette alle fixierten Larven vorsichtig parallel zueinander aus. Legen Sie dann vorsichtig ein Mikro-Deckglas auf die Larven und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Es ist kein Problem, wenn das Deckglas nicht exakt flach liegt.Binnen der nächsten 30 Minuten die Larven abbilden. Da die Hitze-fixierten terminalen Zellen schnell abbauen und die GFP-Signale sehr diffus werden. Anschließend das Objektträger auf dem Stativ eines zusammengesetzten Stereomikroskops platzieren.Suchen Sie mit einem 5x-Objektiv die beiden parallelen dorsalen Stämme, die von anterior nach posterior auf der dorsalen Oberfläche des Tieres verlaufen. Anschließend lokalisieren Sie die beiden dorsalen Endzellen direkt zwischen den beiden dorsalen Stämmen. Dies hilft dabei, das geeignete Segment für die Analyse zu identifizieren.Nach der Ausrichtung drehen Sie die Tiere, um die gewünschten terminalen Zellen abzubilden, indem Sie vorsichtig mit der Pinzette an den Rand der Deckglasplatte drücken. Dies senkrecht zur Längsachse des Tieres rollt die Larven langsam. Die Auswahl geeigneter terminaler Zellen ist entscheidend für konsistente Ergebnisse und Vergleiche zwischen Mutanten.Die terminalen Zellen des Fettk&ouml;rperzweigs finden sich leicht benachbart zum dorsalen Stamm, lateral zur Mittellinie. Die terminalen Zellen der lateralen Gruppe G sind leicht auffindbar und liegen direkt lateral zur ventralen Mittellinie in den am st&auml;rksten anterioren und posterioren Segmenten. Die Anordnung der terminalen Zelle unterscheidet sich von der in anderen Segmenten.Diese Segmente sollten nicht untersucht werden, stattdessen ist der Fokus auf Zellen und Segmente zu legen. Die TR-Zellen zwei bis neun der dorsalen Terminalzellen weisen ein stärker stereotypisiertes Verzweigungsmuster auf als andere tracheale Terminalzellen. Dies könnte von zusätzlichen nichtzellautonomen Signalen abhängen, was bei der Entscheidung, ob sie in die Analyse einbezogen werden sollen, berücksichtigt werden sollte.Wenn eine terminale Zelle von Interesse identifiziert wurde, erfassen Sie ein Bild mit 10x- oder 20x-Vergrößerung aufgrund variabler Verzweigungsmuster. Versuchen Sie, Bilder aufzunehmen, die möglichst viele Verzweigungen und Verzweigungsspitzen enthalten, ohne den Objekttisch zu bewegen. Schalten Sie die Fluoreszenz aus und schalten Sie das Durchlicht ein.Um ein Hellfeldbild derselben Zelle und Fokusebene aufzunehmen, erscheint das Lumen innerhalb des terminale Zellraums stark kontrastiert. Um die Verzweigungen und Lumina der terminalen Zellen zu quantifizieren, sammeln Sie mehrere Bilder in verschiedenen Fokusebenen jeder terminalen Zelle. Einige Zellen erfordern nur ein einzelnes Bild, um ausreichende Daten zu erhalten, während andere bis zu drei Einzelbilder in unterschiedlichen Fokusebenen benötigen.Um alle Äste zu erfassen, öffnen Sie die fluoreszierenden End-Brightfield-Bilder in ImageJ mit installiertem NeuronJ-Plugin. Verwenden Sie das Werkzeug „Tracings hinzufügen“, um die Äste und das Lumen der gesamten terminale Zelle manuell nachzuzeichnen, und benennen und färben Sie die Nachführungen mit dem Werkzeug „Tracings kennzeichnen“ um, um jeder Linie innerhalb der Nachzeichnung eine spezifische Bezeichnung für fünf 12 mal fünf 12 Pixel große Bilder zuzuweisen. Nutzen Sie das Werkzeug „Parameter festlegen“, um die Linienbreite von sechs auf 10 Pixel anzupassen.Passt die Skalierung entsprechend für Bilder mit höherer oder niedrigerer Auflösung an. Lasst die übrigen Einstellungen auf den Standardeinstellungen und drückt auf OK. Verwendet anschließend das Werkzeug „Make Snapshot“.Um ein Bild aufzunehmen, wählen Sie die Funktion „Spur zeichnen“, um eine Momentaufnahme der Spur zu erhalten, die nebeneinander mit dem Originalbild angezeigt werden kann. Wählen Sie das Werkzeug zur Messung von Spuren und selektieren Sie die entsprechende Spur. Geben Sie die zu messenden Verzweigungen basierend auf den spezifischen Bezeichnungen ein.Als Nächstes wählen Sie die Anzeige der Spurmessungen aus. Löschen Sie dann die vorherigen Messungen und klicken Sie anschließend auf „Ausführen“. Dadurch wird eine Tabelle erstellt, die den Namen, die Bezeichnung, die Länge in Pixeln sowie weitere Daten für das Bild enthält, das für die statistische Analyse gespeichert werden soll.Das beschriebene Protokoll wurde befolgt, um mutierte Trachealzellen in Mosaic L drei Larven, die mittels GFP sichtbar gemacht wurden, zu analysieren. Die einzeln liegende terminale Zelle der seitlichen Gruppe, bezeichnet als LG, weist unter Hellfeldmikroskopie umfangreiche subzelluläre Verzweigungen auf. Ein gasgefüllter subzellulärer Lumen, der sich durch jede der Verzweigungen zieht, ist mittels NeuronJ erkennbar. Es wurde eine Nachzeichnung der Verzweigungen sowie eine Nachzeichnung des Lumens angefertigt. Bei diesem nicht-mosaikartigen Tier wird die terminale Zelle des Fettkörpers, FB, identifiziert.Beachten Sie, dass GFP im gesamten Tracheensystem exprimiert wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man schnell Bilder fixiert und eine quantitative Analyse an terminalen Trachealzellen in intakten Tieren nach ihrer Entwicklung durchführt. Diese Technik ebnete den Weg dafür, dass Forscher Software nutzen, um terminale Trachealzellen als entscheidendes Modell zur Erforschung von Aspekten der Zellmorphogenese unter Verwendung terminaler Trachealzellen zu verwenden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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