Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt

In diesem Protokoll beginnen wir damit, die Larve des geeigneten Genotyps mit E-basierter Nahrung zu füttern, die all-trans-A-TR enthält. Jede Larve wird fixiert und in normalem Salin präpariert, um das normale Salin durch eine Ringer-Lösung mit zwei Milli Calcium zu ersetzen, und die LABA-Präparation wird auf dem Mikroskopständer platziert. Die Bewegung der präparierten LABA wird mit einer CCD-Kamera aufgezeichnet. Durch lokale Beleuchtung des Nervensystems können wir die neuronale Aktivität einer Teilmenge von Neuronen zu einem bestimmten Zeitpunkt stören, während wir gleichzeitig die Bewegung derselben inaktiven Präparation überwachen.

Hallo, ich bin Tega im Labor von Dr. A. Hallo, ich bin Hi Kosaka, ebenfalls auf der Oph-Ebene im Labor von Dr. A.

Die Fortbewegung ist ein nützliches Modellsystem zur Untersuchung motorischer Schaltkreise. Aufgrund der hochentwickelten genetischen Methoden in diesem Protokoll werden wir eine optogenetische Manipulation von Motoneuronen vornehmen, während wir die Körperebene Bewegung überwachen. Mithilfe von Lasern im konfokalen Mikroskop können eine Untermenge von Neuronen stimuliert werden und die motorischen Reaktionen auf räumlich-zeitliche Störungen der Neuronen analysiert werden.

Beginnen wir also. Halten Sie Fliegenlinien von K six G four US CHR two oder K six G four US NPHR in Plastikgefäßen mit standardmäßigem Lebendfutter. Geben Sie eine TL-Lösung zu Hefe, die in den entsprechenden Konzentrationen angesetzt und gut vermischt wurde. Verteilen Sie die Hefe auf einem Apfelsaftagar.

Entnehmen Sie die zweite oder dritte SLA aus den Gefäßen. Stellen Sie die Kultur auf die Platte mit der Hefemedia, die ein TR enthält. Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab, um das TR im Dunkeln zu halten. Inkubieren Sie die Kultur bei 25 Grad C für einen geeigneten Zeitraum.

Dies ist eine CCD-Kamera zur Visualisierung desselben intakten Labors. Befestigen Sie die CCD-Kamera an einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop mit einer SEMA-Ablösung. Nehmen Sie die A TRA-Lobby auf und spülen Sie sie mit Wasser ab.

Um Nahrungsreste aus dem Körper zu entfernen, legen Sie die Lava auf die kalte Seite der C-Schutzscheibe dorsal ab. Fixieren Sie Kopf und Schwanz mit Insektennadeln. Geben Sie kalziumfreie physiologische Kochsalzlösung hinzu.

Erstellen Sie mit einer Mikroschere einen kleinen Schnitt nahe dem Schwanz. Führen Sie einen Längsschnitt entlang der dorsalen Mittellinie aus. Achten Sie darauf, das ventrale Nervenzentrum und die peripheren Nerven nicht zu beschädigen.

Führen Sie einen kleinen lateralen Einschnitt des Kopfes entlang jeder Ecke der präparierten Körperwand durch. Entfernen Sie die inneren Organe mit Ausnahme des Gehirns und des ventralen Nervenstrangs. Ersetzen Sie den normalen Salzlösung durch 2 Millionen Modell-Calcium-Ringer-Lösung.

Befestigen Sie ein Trockenobjektiv mit voller Vergrößerung am konfokalen Mikroskop und platzieren Sie die Versuchspräparation auf dem Mikroskoptisch. Erstellen Sie mit einem roten Laser ein Transmissionsbild der präparierten Probe mithilfe des konfokalen Mikroskops, um den ventralen Nervenstrang zu lokalisieren. Definieren Sie den interessierenden Bereich auf dem Transmissionsbild; eine Zoombetrachtung ist hilfreich, um den spezifischen Bereich von Interesse festzulegen.

Wechseln Sie den Filter des Mikroskops, um mit Licht von 488 Nanometer oder 559 Nanometer zu beleuchten. Visualisieren Sie die Körperwand, indem Sie die Probe mit der Halogenlampe beleuchten. Überwachen Sie die Probe mit einer an das Konfokalmikroskop angeschlossenen CCD-Kamera.

Beachten Sie die Bewegung der Körperwand und schalten Sie den Laserstrahl nur vorübergehend ein, um neuronale Aktivitäten zu manipulieren, während gleichzeitig die peristaltische Bewegung in derselben intakten Präparation mittels einer CCD-Kamera beobachtet und aufgezeichnet wird. Dieses Labor exprimiert CHL zwei in modernen Neuronen. Die Beleuchtung eines oder zweier Segmente des ventralen Nervenstrangs aktiviert moderne Neuronen in diesen Segmenten, was wiederum Muskelkontraktionen in den entsprechenden Segmenten der Körperwand hervorruft und andere Segmente im ventralen Nervenstrang stimuliert.

Kälte induziert die Kontraktion anderer Körperteile. NPHL wurde in Motoneuronen exprimiert, wenn einige Segmente des ventralen Nervenstrangs mit einem gelben Laser stimuliert wurden. Die fortpflanzende Welle wurde an dem entsprechenden Segment der Körperwand angehalten.

Die Welle setzte sich anschließend aus dem arrestierten Segment fort, sobald die Lasereliminierung abgeschaltet wurde. Dieses Protokoll erläutert das Vorgehen zur Durchführung einer optogenetischen Störung neuronaler Aktivität mittels Lasern auf derselben inaktiven kreisförmigen Ebene in Bewegung. Während dieser Dissektion dürfen weder der ventrale Nervenstrang noch der periphere Nerv beschädigt werden, um eine ausreichende Stimulation zu gewährleisten.

Die Beleuchtungsleistung sollte durch Anpassung der Laserleistung, der Scangeschwindigkeit oder der Anzahl der Wiederholungen im konfokalen Mikroskop eingestellt werden. Dies ist der gesamte Protokollablauf. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.