Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, verschiedene membranäre Subkompartimente zu trennen und ihre unterschiedliche Proteinzusammensetzung zu untersuchen. Dies wird durch stabile Isotopenmarkierung von Zellen unter verschiedenen Bedingungen erreicht, um eine Unterscheidung der Behandlungen zu ermöglichen. Bei der massenspektrometrischen Analyse im zweiten Schritt werden Zellmaterialien aus den beiden Behandlungen gemischt, was eine gemeinsame Verarbeitung sicherstellt und die Variation von Probe zu Probe verringert.

Anschließend werden Unterkompartimente der Plasmamembran mithilfe einer Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und in sterile, reichhaltige sowie sterildeaktivierte Unterkompartimente getrennt. Die Zentrifugationsergebnisse zeigen unterschiedliche Proteinmengen in den Unterkompartimenten unter verschiedenen Behandlungsbedingungen, basierend auf Daten der quantitativen Massenspektrometrie. Der Hauptvorteil dieses Protokolls gegenüber etablierten Methoden wie der Western-Blot-Analyse liegt darin, dass wir die Verteilung von Tausenden von Proteinen auf die Unterkompartimente quantitativ erfassen und dadurch neue Kandidaten für Signalprozesse identifizieren können.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die manuelle Reinigung eines Zweiphasensystems schwer zu erlernen ist. Der Grund dafür liegt darin, dass viele Arbeitsschritte erforderlich sind und eine präzise Kontrolle sowie sorgfältige Handhabung von großer Bedeutung ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Signalübertragung zu beantworten, indem neue Protein-Kandidaten als Regulatoren von Membranprozessen identifiziert werden. Beginnen Sie damit, markierte und unmarkierte Arabidopsis-ana-Zellsuspensionskulturen gemäß dem im Textprotokoll beschriebenen Verfahren anzuziehen.

Homogenisierte Zellen aus etwa einem Liter sieben Tage alter Zellsuspensionskulturen in flüssigem Stickstoff werden mit gleichen Mengen markierter und unmarkierter gefrorener Zellkulturen basierend auf Frischgewicht in einem Becher vermischt; zwei Volumina Puffer H zugeben, den Becher sofort auf einen Schüttler stellen und schütteln, bis das Material geschmolzen ist und kein Eis mehr enthält. Das Homogenat durch eine Lage Mircolentuch in 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen filtrieren; nach dem Auswiegen der Proben mit Puffer H bei 10.000 ×g für acht Minuten zentrifugieren. Nach der Zentrifugation die Überstände in vorab gekühlte Ultrazentrifugenröhrchen mit einem Volumen von etwa 32 Millilitern überführen.

Nach dem Ausgleichen der Proben mit Puffer h pelletieren Sie die Mikrosomen durch Zentrifugation bei 100.000 G und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand; dieser enthält lösliche Proteine. Ein kleiner Teil dieses Bruches kann für eine weitere Proteinfällung aufbewahrt und anschließend zur Analyse löslicher Proteine verwendet werden. Resuspendieren Sie das Membranpellet jeder Probe in der jeweiligen Menge an Puffer R, wie im Textprotokoll beschrieben, und geben Sie es auf die Oberfläche des U-eins-zwei-Phasensystems.

Wenn das sechsgewichtige Zweiphasensystem verwendet wird, pipettieren Sie genau zwei Gramm des resuspendierten Membranpellets und die gleiche Menge reinen Puffer R, die auch für die Resuspension der Probe verwendet wurde, in U2. Mischen Sie die Röhrchen U1 und U2 vorsichtig durch 30-maliges Umstülpen bei etwa einer Inversion pro Sekunde. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1500 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation entfernen Sie die obere Phase aus U2. Überführen Sie die obere Phase aus U1 in U2, bevor Sie die Zentrifugation mit denselben Parametern wiederholen. Danach überführen Sie die obere Phase aus U2 in Ultrazentrifugenröhrchen, verdünnen sie mit dem Fünffachen des Volumens an Puffer R und mischen gründlich. Zentrifugieren Sie die Proben anschließend bei 200.000 G und vier Grad Celsius für eine Stunde.

Schließlich die Wiederverwendung. Das Membranpellet in einer geringen Menge T- und E-Puffer suspendieren, um detergenzresistente Membranen zu isolieren. Nach der Bestimmung der Konzentration des Plasmamembran-Fraktion mittels Bradford-Assay Triton X-100 zur Plasmamembran-Fraktion im Verhältnis von Detergens zu Protein (Gewicht zu Gewicht) zwischen 13 und 15 sowie mit einer endgültigen Detergenskonzentration zwischen 0,5 und 1 % hinzufügen. Die Proben etwa 30 Minuten bei ca. 100 U/min und vier Grad Celsius schütteln.

Dann drei Volumina einer 2,4-molaren Saccharoslösung zu einem Volumen des behandelten Plasmamembrans hinzufügen, um eine endgültige Saccharoskonzentration von 1,8 mol/L zu erhalten. Den Saccharosegradienten in Ultrazentrifugenröhrchen herstellen, indem die jeweiligen Saccharoslösungen vorsichtig auf die 1,8-molare Fraktion aufgeschichtet werden. Die Proben bei 250.000 × g und 4 °C über 18 Stunden zentrifugieren. Die Ultrazentrifugenröhrchen vorsichtig aus dem Rotor nehmen, um eine Störung des bandförmigen Bereichs geringer Dichte zu vermeiden, der als milchiger Ring an der Grenzfläche zwischen 0,15-molarer und 1,4-molarer Saccharoslösung sichtbar sein kann.

Manchmal ist nichts zu sehen, aber die detergentresistente Proteinfraktion ist dennoch vorhanden. Entnehmen Sie eine Fraktion von 0,75 Milliliter Volumen von der Oberseite des Gradienten, den Fraktionen zwei und drei, die die Volumina von etwa 1,5 Milliliter oberhalb des Interphasenrings umfassen. Und 0,5 Milliliter unterhalb des Interphasenrings.

Stellen Sie die detergentresistente Membranfraktion dar. Sammeln Sie diese Fraktionen in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Die Fraktionen neun und 10 enthalten die detergentsoluble Membranfraktion und können ebenfalls zur Vergleichszwecken gesammelt werden.

Um die Extraktion von Proteinen aus der detergentresistenten Fraktion zu beginnen, geben Sie vier Volumina Methanol zu den gesammelten Fraktionen hinzu und wirbeln gründlich durch. Fügen Sie anschließend ein Volumen Chloroform hinzu und wirbeln erneut gründlich durch. Geben Sie abschließend drei Volumina Wasser hinzu, wirbeln erneut gründlich durch und zentrifugieren die Proben bei 2000 Gs für fünf Minuten.

Entfernen Sie mithilfe einer Tischtopfzentrifuge die wässrige Phase über der Proteinlage in der Interphase. Geben Sie anschließend drei Volumina Methanol hinzu und wirbeln Sie die Probe. Entfernen Sie das Überstand-S-Supernatant gründlich, bevor Sie das Pellet zur Vorbereitung der In-Lösung-Verdauung aufnehmen.

Beginnen Sie die In-Lösung-Digestion, indem Sie die Probe in einem kleinen Volumen von sechs molar Harnstoff, zwei molar Thyroid, pH 8 (abgekürzt UTU) auflösen. Verwenden Sie ein möglichst geringes Volumen, das mit der Probe vereinbar ist. Nachdem Sie die Proben zentrifugiert und die Digestion wie im textbasierten Protokoll beschrieben durchgeführt haben, verdünnen Sie die Probe mit dem vierfachen Volumen von 10 Millimolar Tris-HCl, pH 8.

Anschießend ein Mikroliter Trypsin pro 50 Mikrogramm Probenprotein hinzufügen und über Nacht bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln mit 700 U/min inkubieren. Die Proben anschließend 10 Minuten bei 4.000 × g zentrifugieren. Schließlich die Proben durch Zugabe von etwa einem Zehntel des Volumens 2 %iger Trifluoressigsäure auf eine Endkonzentration von 0,2 % TFA ansäuern, um pH 2 zu erreichen. Um C18-StageTips herzustellen, eine C18-Mour-Scheibe auf eine flache, saubere Oberfläche, wie z. B. eine Einweg-Kunststoff-Petrischale, legen.

Stanzen Sie eine kleine Scheibe mit einer stumpfen Kanüle mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern aus. Die Scheibe bleibt in der Kanüle stecken und kann in eine Pipettenspitze übertragen werden. Drücken Sie die Scheibe aus der Kanüle heraus und fixieren Sie sie im sich verjüngenden Bereich einer Pipettenspitze mithilfe eines Stückes aus Quarzglas oder eines passenden Schlauchs, das in das Innere der Kanüle passt. Konditionieren Sie eine C 18-Stage-Spitze, indem Sie 50 Mikroliter Lösung B auf die vorbereitete Stage-Spitze geben.

Zentrifugieren Sie die Spitze zwei Minuten lang bei 2000 U/min. In einer Tischzentrifuge wird die Stage-Spitze mit 100 Mikroliter Lösung a angeglichen. Zentrifugieren Sie die Spitze bei 5.000 ×g in einer Tischzentrifuge. Wiederholen Sie die Äquilibrierung und die Zentrifugation.

Das Probenmaterial wird aufgenommen, indem die Probe vorsichtig mit einer Pipette in die Pipettenspitze mit der darin befindlichen Säule pipettiert wird. Die Spitzen in der Zentrifuge drehen, bis das gesamte Probenvolumen die C18-Säule durchlaufen hat. Die Stage-Tips zweimal mit jeweils 100 µL Lösung A waschen. Nach dem Zentrifugieren der Tips das EIT in einem frischen 1,5-mL-Reaktionsröhrchen mit 40 µL Lösung B sammeln und zentrifugieren.

Konzentrieren Sie die Probe erneut im Speed-Vac unter optimalen Bedingungen. Beenden Sie den Trocknungsprozess, wenn noch etwa ein oder zwei Mikroliter Flüssigkeit verbleiben. Geben Sie abschließend ein Endvolumen von neun Mikrolitern Resus-Aufschlämmungslösung zur Probe hinzu und überführen Sie diese in die Mikrotiterplatte zur Massenspektrometrie-Analyse.

Die Anreicherung von Plasmamembranproteinen kann durch proteomische Analyse kleiner Mengen von Plasmamembran, Fraktionen und Proteinen in der unteren Phase des Zweiphasensystems nachgewiesen werden. Die untere Phase enthält die inneren Membranen der Zelle. Beispielsweise weisen typischerweise bekannte Plasmamembranproteine wie Rezeptorkinasen eine hohe Häufigkeit in der Plasmamembran-Fraktion und eine geringe Häufigkeit in der Fraktion der unteren Phase, die die inneren Membranen enthält, auf.

Entsprechend zeigen bekannte Proteine des endoplasmatischen Retikulums eine hohe Häufigkeit in der Fraktion der inneren Membran und wurden nicht in der Fraktion der Plasmamembran beobachtet. Die anschließende Anreicherung der detergentresistenten Membranfraktionen führt in idealen Fällen zur Bildung eines milchigen Rings aus Membranvesikeln mit niedriger Dichte. Bei etwa einem Fünftel der Röhrenhöhe wurde – wie erwartet – die höchste Häufigkeit des Remn-Proteins in den detergentresistenten Membran- oder DRM-Fraktionen gefunden.

Umgekehrt zeigen Proteine, die nicht in der Membran vorhanden sind, wie beispielsweise mikrodomänenassoziierte Proteine wie ein A b, C-Transporter, keine erhöhte Anreicherung in der DRM-Fraktion. Ebenso weisen typische Kontaminationen wie ein mitochondriales Protein aus dem A TPAs F zero-Komplex und ribosomale Proteine aus dem 60 S-Ribosom keine angereicherte Häufigkeit in der DRM-Fraktion auf. Obwohl minimale Mengen nach der massenspektrometrischen Analyse noch nachweisbar sind, lassen sich die Proteinmengenverhältnisse hinsichtlich des Phosphorylierungsstatus der Proteine in der Plasmamembran sowie die Anteile markierter und unmarkierter Zellkulturen quantitativ unterscheiden.

Typische Ergebnisse im MS-Quant-Qualifizierungsfenster sollten für die meisten identifizierten Peptide ein Ionenintensitätsverhältnis von eins zu eins zeigen. Peptide mit einem Ionenintensitätsverhältnis, das signifikant von eins zu eins abweicht, gelten als unterschiedlich reguliert zwischen der markierten und unmarkierten Zellkultur und kommen als Kandidaten für den Nachweis von durch die Behandlung beeinflussten Proteinen infrage. Eine gute Qualitätskontrolle für eine erfolgreiche metabolische Markierung ist die Koelution beider, der markierten und unmarkierten Peptidvarianten, als einzelner Peak in der nano-HPLC-Trennung, wie hier dargestellt.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie innerhalb von drei Tagen – vom Beginn der Extraktion bis zur Probenapplikation auf das Massenspektrometer – durchgeführt werden. Anschließend an dieses Verfahren können weitere Methoden wie beispielsweise der Western Blot angewandt werden, um zusätzliche Fragestellungen hinsichtlich der Nachweisbarkeit spezifischer Zielproteine zu beantworten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollte ein gutes Verständnis dafür bestehen, wie man stabile Isotopen-markierte Pflanzenzellkulturen mischt, wie man eine Plasmamembran-Reinigung über ein Zweiphasensystem durchführt und wie man steriles reiches von sterilem armem membranösen Subkompartiment trennt.