Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von Arabidopsis thaliana Fahrwerk Zellkulturen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, verschiedene Membranunterkompartimente zu trennen und ihre unterschiedliche Proteinzusammensetzung zu untersuchen. Dies wird durch die Markierung stabiler Isotope von Zellen unter verschiedenen Bedingungen erreicht, um eine Differenzierung der Behandlungen zu ermöglichen. Bei der massenspektrometrischen Analyse wird in einem zweiten Schritt das Zellmaterial aus den beiden Behandlungen gemischt, was eine gemeinsame Verarbeitung gewährleistet und die Variation von Probe zu Probe reduziert.

Anschließend werden die Unterkompartimente der Plasmamembran gereinigt und durch Saccharose in sterile, reichhaltige und sterile abgereicherte Unterkompartimente getrennt. Es werden Gradientenzentrifugationsergebnisse erhalten, die unterschiedliche Proteinhäufigkeiten in den Unterkompartimenten unter verschiedenen Behandlungen auf der Grundlage von Daten aus der quantitativen Massenspektrometrie zeigen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. Western Blotting, besteht darin, dass wir die Subkompartimentverteilung von Tausenden von Proteinen quantitativ erfassen und so neue Kandidaten für Signalprozesse entdecken können.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Reinigung eines Zweiphasensystems schwer zu erlernen ist. Der Grund dafür ist, dass es sich um viele Arbeitsschritte handelt und die genaue Steuerung und gründliche Handhabung sehr wichtig ist. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Signalbereich zu beantworten, indem sie neue Proteinkandidaten als Regulatoren von Membranprozessen entdeckt. Beginnen Sie mit der Züchtung markierter und unmarkierter Arabidopsis-ANA-Zellsuspensionskulturen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Homogenisierte Zellen aus etwa einem Liter sieben Tage alter Zellsuspensionskulturen in flüssigem Stickstoff mischen die gleichen Mengen markierter und unmarkierter gefrorener Zellkulturen, bezogen auf das Frischgewicht, in ein Becherglas und fügen zwei Volumen Puffer H hinzu, stellen das Becherglas sofort auf einen Schüttler und schütteln es, bis das Material geschmolzen und ohne Eis ist. Kristalle filtrieren das Homogenat durch eine Schicht Spiegeltuch in 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, nachdem die Proben acht Minuten lang mit einer Puffer-H-Zentrifuge bei 10.000 g ausbalanciert wurden. Nach der Zentrifugation wird die Snat in vorgekühlte Ultra-Zentrifugenröhrchen mit einem Volumen von etwa 32 Millilitern geladen.

Nach dem Ausbalancieren der Proben mit dem Puffer h pelletieren Sie die Mikrosomen, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 100.000 g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt, der Überstand enthält lösliche Proteine. Eine kleine Menge dieser Fraktion kann für weitere Proteinfällung aufbewahrt werden, und die nachfolgende Analyse löslicher Proteine resuspendiert das Membranpellet jeder Probe in der jeweiligen Menge an Puffer R, wie im Textprotokoll beschrieben, und laden Sie es auf die Oberseite des U-Eins-Zweiphasensystems.

Wenn das zweiphasige Sechs-Gramm-System verwendet wird, laden Sie genau zwei Gramm resuspendiertes Membrangranulat mit dem gleichen Volumen an reinem Puffer R wie für die Probenreanimationssuspension auf U2. U, 1 und U2 Röhrchen werden langsam gemischt, indem sie 30 Mal mit etwa einer Inversion pro Sekunde umgedreht werden, und die Proben 10 Minuten lang bei 1500 G und vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie nach der Zentrifugation die obere Phase von U2. Die obere Phase von U eins auf U2 übertragen, bevor die Zentrifugation mit den gleichen Parametern wiederholt wird. Als nächstes wird die obere Phase von U2 in die Ultra-Ultrazentrifugenröhrchen überführt, mit fünf Volumina Puffer R verdünnt und gründlich gemischt, die Proben eine Stunde lang bei 200.000 G und vier Grad Celsius zentrifugiert.

Und schließlich wiederverwenden. Suspendieren Sie das Membranpellet in einer kleinen Menge T- und E-Puffer, um reinigungsmittelbeständige Membranen zu isolieren. Nachdem Sie die Konzentration der Plasmamembranfraktion durch den Bradford-Assay überprüft haben, fügen Sie Triton X 100 zur Plasmamembranfraktion bei einem Detergens-Protein-Verhältnis zwischen 13 und 15 und einer endgültigen Detergenzkonzentration zwischen 0,5 und 1 % hinzu. Schütteln Sie die Proben 30 Minuten lang bei etwa 100 U/min und vier Grad Celsius.

Fügen Sie dann drei Volumina 2,4 molare Saccharose zu einem Volumen der behandelten Plasmamembran hinzu, um eine Endkonzentration von 1,8 molaren Saccharose zu erhalten. Bereiten Sie den Saccharosegradienten in Ultrazentrifugenröhrchen vor, indem Sie die jeweiligen Saccharoselösungen auf die 1,8-molare Fraktion laden. Zentrifugieren Sie die Proben bei 250.000 GS und vier Grad Celsius für 18 Stunden. Entfernen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen vorsichtig vom Rotor, um eine Störung der Bande mit geringer Dichte zu vermeiden, die an der Grenzfläche von 0,15 molar und 1,4 molar Saccharose als milchiger Ring sichtbar sein kann.

Manchmal ist nichts zu sehen, aber die waschmittelresistente Proteinfraktion ist immer noch da. Entfernen Sie einen Teil des Volumens von 0,75 Millilitern vom oberen Rand des Gradienten, die Fraktionen zwei und drei, die das Volumen von etwa 1,5 Millilitern oberhalb des Interphasenrings abdecken. Und 0,5 Milliliter unterhalb des Interphasenrings.

Stellt die detergensresistente Membranfraktion dar. Sammeln Sie diese Fraktionen in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Die Fraktionen neun und 10 enthalten die waschmittellösliche Membranfraktion und können auch zum Vergleich gesammelt werden.

Um mit der Extraktion von Proteinen aus der waschmittelresistenten Fraktion zu beginnen, fügen Sie den gesammelten Fraktionen vier Volumen Methanol hinzu und v-Wirbel gründlich. Fügen Sie dann ein Volumen Chloroform hinzu, bevor Sie erneut gründlich vortexen. Zum Schluss fügen Sie drei Volumen Wasser hinzu und zentrifugieren Sie die Proben gründlich bei 2000 g für fünf.

Entfernen Sie mit einer Tischzentrifuge die wässrige Phase über der Proteinschicht in der Interphase. Fügen Sie als nächstes drei Volumen Methanol hinzu und wirbeln Sie es vortexen. Entfernen Sie den S-Überstand gründlich, bevor Sie das Pellet ziehen Zur Vorbereitung des Insolution-Aufschlusses.

Beginnen Sie mit dem Aufschluss in Lösung, indem Sie die Probe in einem kleinen Volumen von sechs molaren Harnstoff, zwei molaren Schilddrüsen-pH-Werten und acht abgekürzten UTU auflösen. Verwenden Sie ein möglichst geringes Volumen, das mit der Probe kompatibel ist. Nach dem Schleudern der Proben und der Durchführung des Aufschlusses, wie im Textprotokoll beschrieben, wird die Probe mit vier Volumina von 10 millimolaren Tris HCL PH acht verdünnt.

Fügen Sie dann einen Mikroliter Trypsin pro 50 Mikrogramm Probenprotein hinzu, inkubieren Sie es über Nacht bei Raumtemperatur und ständigem Schütteln bei 700 U/min und zentrifugieren Sie die Proben bei 4.000 GS für 10 Minuten. Zum Schluss säuern Sie die Proben auf eine Endkonzentration von 0,2 % TFA an, um einen pH-Wert von zwei zu erreichen, indem Sie etwa ein 10. Volumen von 2 % Trifluoressigsäure hinzufügen. Zur Herstellung von C 18-Spitzen legen Sie eine Mour-Scheibe C 18 auf eine ebene, saubere Oberfläche, z. B. eine Einweg-Petrischale aus Kunststoff.

Stanzen Sie eine kleine Scheibe mit einer stumpfen Injektionsnadel mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern aus. Die Scheibe steckt in der Nadel und kann in eine Pipettenspitze übertragen werden. Schieben Sie die Scheibe aus der Nadel und fixieren Sie sie in der Verjüngung einer Pipettenspitze mit einem Stück Quarzglas oder einem Schlauch, der in die Innenseite der Nadel passt, konditionieren Sie eine C 18-Tischspitze, indem Sie 50 Mikroliter Lösung B auf die vorbereitete Tischspitze geben.

Drehen Sie die Spitze in der Zentrifuge bei 2000 U/min für zwei Minuten. In einer Tischzentrifuge äquilibrieren Sie die Tischspitze mit 100 Mikrolitern Lösung a. Drehen Sie die Spitze bei 5.000 GS in einer Tischzentrifuge. Wiederholen Sie die Äquilibrierung und drehen Sie sie.

Laden Sie die Probe auf die Scheibe, indem Sie die Probe vorsichtig mit der Scheibe in die Pipettenspitze pipettieren. Die Spitzen in der Zentrifuge drehen, bis das gesamte Probenvolumen durch die C 18-Scheibe fließt. Waschen Sie die Tischspitzen zweimal mit 100 Mikrolitern Lösung A. Nachdem Sie die Spitzen in der Zentrifuge gedreht haben, sammeln Sie die EIT in einem frischen 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen bei 40 Mikrolitern Lösung B und zentrifugieren Sie.

Auch hier ist die Probe unter idealen Bedingungen im Speedvac zu konzentrieren. Stoppen Sie den Dehydratisierungsprozess, wenn nur noch etwa ein oder zwei Mikroliter Flüssigkeit übrig sind. Geben Sie in einem letzten Schritt ein Endvolumen von neun Mikrolitern Resus-Suspensionslösung in die Probe und überführen Sie es zur Massenspektrometrie auf die Mikrotiterplatte.

Die Anreicherung von Plasmamembranproteinen kann durch proteomische Analyse von kleinen Eloqua der Plasmamembran, Fraktionen und Proteinen in der unteren Phase des Zweiphasensystems nachgewiesen werden. Die untere Phase enthält die inneren Membranen der Zelle. Zum Beispiel zeigten typischerweise bekannte Plasmamembranproteine, wie z. B. Rezeptorkinaseproteine, eine hohe Abundanz in der Plasmamembranfraktion und eine geringe Abundanz in der unteren Phasenfraktion, die die internen Membranen enthält.

Bekannte Proteine des endoplasmatischen Retikulums weisen wiederum eine hohe Häufigkeit in der inneren Membranfraktion auf und wurden in der Plasmamembranfraktion nicht beobachtet. Die anschließende Anreicherung von detergensresistenten Membranfraktionen führt im Idealfall zur Bildung eines milchigen Rings aus Membranvesikeln niedriger Dichte. Bei etwa einem Fünftel der Röhrchenhöhe wurde erwartungsgemäß die höchste Häufigkeit an Restprotein in den detergensresistenten Membran- oder DRM-Fraktionen gefunden.

Umgekehrt zeigen Proteine, die nicht in der Membran vorhanden sind, Mikrodomänen wie ein A b, C Transporter keine erhöhte Häufigkeit in der DRM-Fraktion. Auch typische Kontaminanten wie ein mitochondriales Protein aus dem A TPAs F Null-Komplex und ribosomale Proteine aus dem 60 s Ribosom zeigen keine angereicherte Häufigkeit in der DRM-Fraktion. Obwohl nach der massenspektrometrischen Analyse noch minimale Mengen identifiziert werden können, können die Proteinhäufigkeitsverhältnisse des Proteinphosphorylierungsstatus in der Plasmamembran, Fraktionen von markierten und unmarkierten Zellkulturen quantitativ unterschieden werden.

Typische Ergebnisse aus dem MS-Quantifizierungsfenster sollten für die meisten der identifizierten Peptide ein Ionenintensitätsverhältnis von eins zu eins zeigen. Diejenigen Peptide mit einem signifikant von eins zu eins abweichenden Ionenintensitätsverhältnis gelten als differentiell reguliert zwischen der markierten und der unmarkierten Zellkultur und sind Kandidaten für die Anpassung an Proteine, die von der angewendeten Behandlung betroffen sind. Eine gute Qualitätskontrolle für eine erfolgreiche metabolische Markierung ist die Koalition von sowohl markierten als auch unmarkierten Peptidversionen als ein einziger Peak in der Nano-HPLC-Trennung, wie hier gezeigt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen vom Beginn der Extraktion bis zum Laden der Probe in das Massenspektrometer durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Western Belt durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Supplikation spezifischer Zielproteine zu beantworten. Nachdem wir uns dieses Video angesehen haben, sollten wir ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit stabilen Isotopen markierte Pflanzenzellkulturen mischt, wie man eine Plasmamembranreinigung über ein Zweiphasensystem durchführt und wie man sterile reiche von sterilen abgereicherten Membransubkompartimenten trennt.