Mess-Wachstum und Genexpression von Tumor-Dynamics Targeted S. Typhimurium Bakterien

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die in vivo Genexpressionsdynamik von Styrischen Bakterien, die in Tumoren wachsen, zu untersuchen. Zunächst werden in einem Xenotransplantat-Krebsmodell der Maus Bakterien intravenös über die Schwanzvene injiziert. Bakterien besiedeln den Tumor und wachsen exponentiell, während die Genexpression mit Hilfe von lumineszierenden Reportern sichtbar gemacht wird.

Die Biolumineszenz-Bildgebung des ganzen Tieres wird mit dem IVUS-Spektrum-Bildgebungssystem durchgeführt. Über einen Zeitraum von 24 bis 48 Stunden werden IVUS-Bilder aufgenommen. Diese Bildserie korreliert mit Koloniezahlen, die durch Homogenisierung und Plattierung von Tumoren erzeugt wurden.

Zusammen ermöglichen uns diese Daten, die Genexpression und Populationsdynamik von Tumor-Zielbakterien in vivo in Echtzeit bei der Zellvorbereitung und Zelllinien unter Verwendung von Standard-Zellkulturtechniken quantitativ zu messen. In diesem Experiment verwendeten wir ocar acht Zellen Bruttozellen mit einer Zielkofluenz von 80 bis 100 %Ernte und Zählung von Zellen auf einem Hämo, Zytometer, Reanimation, Suspend und phenolrotfreiem DMEM bei einer Zielkonzentration von fünfmal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter oder etwa 200 Mikroliter pro Kolben. Fügen Sie 15% reduzierten Wachstumsfaktor Matrigel hinzu und halten Sie die Zellsuspension bis zur Implantation des Tumors auf Eis.

Anästhesisten betäubten vier Wochen alte weibliche Nacktmäuse mit 3% Fluor. Laden Sie die Zellen 100 Mikroliter pro Tumor in eine Ein-Mill-Spritze und befestigen Sie eine 27-einhalb-Gauge-Nadel für jede der beiden bilateralen Injektionsstellen an der Hinterflanke. Heben Sie die Haut vorsichtig mit einer Pinzette an, um ein Zelt zu bilden, und injizieren Sie Zellen an der Basis.

Achten Sie darauf, nicht zu tief einzudringen und Blut zu produzieren. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spritze vorsichtig und ohne Spritzer zu entfernen. Überwachen Sie das Tumorwachstum täglich für 10 bis 20 Tage, bis ein Tumordurchmesser von zwei bis vier Millimetern erreicht ist.

Bakterienvorbereitung, starten Sie eine Bakterienkultur über Nacht in einem Medium mit drei mils LB plus Antibiotika aus einem Gefrierlager von minus 80 oder einer gekühlten Platte. In diesem Experiment haben wir den Bindestamm ELH vier 30 am Morgen verwendet. Verdünnen Sie die Kultur eins bis 100 in gefiltertes lb und wachsen Sie auf einen OD 600 von 0,4 bis 0,6.

Schleudern und dreimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen und bei einem End-OD 600 von 0,1 oder etwa einmal 10 auf die sieben Zellen pro Mil resuspendieren. Injektion von Bakterien, Betäubung von Tieren und Positionierung mit dem Schwanz in Richtung Ihrer dominanten Hand. Lokalisieren Sie die Schwanzvene und erweitern Sie sie mit warmem Wasser oder einer Wärmelampe.

Laden Sie die Bakterien 100 Mikroliter pro Maus in eine Ein-mil-Spritze und biegen Sie den Chip um weniger als 90 Grad. Richten Sie die Spritzenspitze auf die Schwanzvene aus, dringen Sie in geringer Tiefe ein, ohne Widerstand zu spüren, und injizieren Sie Bakterien. Beobachten Sie die Verdrängung des Blutflusses für eine erfolgreiche Injektion.

Warten Sie etwa 12 bis 18 Stunden, bevor die Bildgebung durchgeführt wird, bis eine Besiedlung stattfindet. Die Bildgebung von Mäusen betäubt Tiere in der Induktionskammer. Platzieren Sie dann jede Maus auf der Imaging-Plattform.

Behalten Sie die präzise Positionierung bei, um quantitative Ergebnisse zwischen den Zeitpunkten zu gewährleisten, und fotografieren Sie Tiere mit dem Ibis Spectrum Bildgebungssystem. Wenn Sie mehr als ein Tier abbilden, platzieren Sie Lichtbarrieren zwischen ihnen, um eine Kreuzbeleuchtung des Tieres zu verhindern, und halten Sie den Tumor mit einer Pinzette fest. Entfernen Sie die Haut mit einer umgekehrten Scherenbewegung.

Bewegung: Wenn der Großteil der Haut vollständig abgetrennt wurde, entfernen Sie den Tumor mit einer Pinzette. Legen Sie die Organe und die vorgewogenen Mikrozentrifugenröhrchen ein. Da die Masse dieser Röhrchen erheblich variieren kann, ist es wichtig, sie für quantitative Ergebnisse vorzuwiegen.

Quantifizierung der bakteriellen Bioverteilung für jeden Zeitpunkt, Excise und Wiegen der Tumore, Zugabe von 500 Mikrolitern PBS plus 15 % Glycerin und Homogenisierung mit einem Geweberiss, Erzeugung einer seriellen Verdünnung und Platte für die Zählung der Bakterienkolonie, repräsentative Ergebnisse. Mit Hilfe dieses Protokolls sind wir in der Lage, Daten über das in vivo Wachstum und die Genexpressionsdynamik von Tumor-Zielbakterien zu generieren. Der gesamte Arbeitsablauf ist hier zusammengefasst.

In der ersten Phase injizierten wir Bakterien und bildeten das Tier mit ivus ab, um die Genexpression mit Lumineszenz als Reporter zu messen. In der zweiten Phase haben wir dann Tumore herausgeschnitten, homogenisiert und plattiert, um die Anzahl der im Tumor wachsenden Bakterien zu bestimmen. Die durch Bakterienstämme erzeugte Biolumineszenz wird anhand von ivus-Signalanstiegen bei injizierter Dosierung mit einer minimalen kolonisierenden Dosierung von etwa fünf mal 10 bis fünf in allen Fällen aufgrund von Abschwächungen visualisiert.

Die Bakterien besiedelten entweder spezifisch Tumore oder wachsen nicht signifikant in der Maus Das Signal wird mit Hilfe von Radiance-Einheiten quantifiziert, um die Expositionszeit zu normalisieren, oder typische Werte über 10 bis sechs oder mehr weisen auf eine Besiedlung für eine gegebene Infektion hin. Das Signal nimmt mit der Zeit über 24 bis 48 Stunden zu. Der maximale Wirkungseintritt liegt hier etwa 36 Stunden nach der Injektion, aber der Zeitpunkt kann je nach verwendetem Stamm und Plasmid variieren. Achten Sie darauf, die Maus jedes Mal genau gleich zu positionieren, um bei den nächsten Experimenten quantitative Ergebnisse zu erzielen.

Die bakterielle Bioverteilung wird quantifiziert, um das Wachstum von Bakterien im Laufe der Zeit in verschiedenen Organen zu messen, lebensfähige Bakterien und Tumore werden quantifiziert, indem der Tumor herausgeschnitten und homogenisiert und seine serielle Verdünnung plattiert wird. Andere Organe können quantifiziert werden. In ähnlicher Weise haben wir hier die Milz verwendet, da das Tumormilzverhältnis ein typisches Maß für die bakterielle Spezifität nach Rückrechnung mit dem Verdünnungsfaktor ist.

Diese Zählungen ermöglichen es uns, die spezifische Bakterienpopulation im Laufe der Zeit zu messen. Auf der linken Seite sehen wir, wie die Anzahl der Bakterien während der Dauer des Experiments stetig zunimmt. Mit einer Verdopplungszeit zwischen einer und drei Stunden, deutlich geringer als bei Batch-Kulturexperimenten.

Dies ist wahrscheinlich auf die schlechten Nährstoffbedingungen in der Mikroumgebung des Tumors zurückzuführen. Auf der rechten Seite haben wir das Tumormilzverhältnis quantifiziert und beobachtet, dass es im Laufe des Experiments zunimmt. Ziel dieser Experimente ist es, die Dynamik des Wachstums und der Genexpression von Bakterien und Tumorumgebungen mit Hilfe von IVUS-Bildgebung und Koloniezähltechniken quantitativ zu überwachen.

Wir haben gezeigt, dass Bakterienpopulationen in vivo in Tumorumgebungen charakterisiert werden können. In Zukunft können komplexere Genexpressionsprogramme entworfen und konstruiert werden, um ausgeklügelte therapeutische Verabreichungssysteme in Bakterien zu bauen.