Name: Mess-Wachstum und Genexpression von Tumor-Dynamics Targeted S. Typhimurium Bakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Genexpression und Wachstum von S. Typhimurium in Tumoren mittels Biolumineszenz-Imaging und Koloniezählung quantitativ messen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse bakterieller Therapien.

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Wir danken H. Fleming für die kritische Durchsicht und Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Postdoc-Stipendium Misrock (TD) und NDSEG Graduiertenstipendium (AP) unterstützt. SNB ist ein HHMI Investigator.

1. Zellpräparation <ol><li> Passage Zelllinien unter Verwendung von Standard-Zellkultur-Techniken. In diesem Experiment verwendeten wir OVCAR-8-Zellen (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Wachsen Zellen zu einem Ziel Konfluenz von 80 - 100%. </li><li> Inkubieren Zellen mit 5 ml Trypsin für 5 min, dann 5 ml RPMI-Medium + FBS Trypsin zu inaktivieren. </li><li> Ernte und Anzahl Zellen auf einer Zählkammer. Resuspendieren in Phenolrot-freiem DMEM auf ein Ziel Konzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml oder etwa 200 ul pro Kolben. </li><li> In 15% reduzierten Wachstumsfaktor Matrigel (BD Biosciences) und halten Sie die Zellsuspension auf Eis bis zur Implantation. </li></ol> 2. Tumorimplantation <ol><li> Anesthetize 4 Wochen alten weiblichen Ncr / Nu-Mäusen unter Verwendung von 3% Isofluran und warten etwa 5 min zu tiefe Narkose zu gewährleisten. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Legen Sie die Zellen (100 ul pro Tumor) in einer 1 ml Spritze eine 27 1/ 2-Gauge-Nadel. </li><li> Für jede der beiden bilateralen hinteren Flanke Injektionsstellen, heben Sie die Haut vorsichtig mit einer Pinzette, um ein Zelt zu machen und injizieren Zellen an der Basis. Achten Sie darauf, nicht zu durchdringen zu tief, wodurch Blut. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Spritze ohne Spritzer. </li><li> Überwachen Tumorwachstum täglich für 10 - 20 Tage, bis ein Tumor Durchmesser von 2 - 4 mm erreicht ist. </li></ol> 3. Bakterien Vorbereitung <ol><li> Starten Sie eine Übernacht-Kultur von Bakterien in 3 ml LB-Medium + Ampicillin aus einer -80 C Gefrierschrank Lager oder gekühlten Teller. Bei diesem Experiment haben wir S. typhimurium Stamm ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-). </li><li> In der Früh, verdünnen die Kultur 1:100 in LB gefiltert und wachsen, um OD600 0.4 - 0.6. </li><li> Abzentrifugieren und wäscht 3 mal in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und in einer endgültigen OD 600 von 0,1 (etwa 1 x 10 7 Zellen / ml). </li></ol> 4. Bakterien Injection <ol><li> Anesthetize das Tier eind Position auf seiner Seite mit der Schwanz zeigte auf Ihrer dominanten Hand. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Dilate die Schwanzvene mit warmem Wasser oder eine Wärmelampe. </li><li> Legen Sie die Bakterien (100 ul pro Maus) in einer 1 ml Spritze und biegen Sie die Spitze etwas weniger als 90 Grad. </li><li> Richten Sie die Spitze der Spritze mit der Schwanzvene, in geringer Tiefe (sollte kein Widerstand zu spüren ist) eindringen, und injizieren Bakterien. Beachten bloodflow Verschiebung für eine erfolgreiche Injektion. </li></ol> 5. Mouse Imaging <ol><li> Anesthetize Tiere in der Induktion Kammer dann platzieren Sie jede Maus auf dem Imaging-Plattform. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Pflegen präzise Positionierung auf quantitative Ergebnisse zwischen den Zeitpunkten zu gewährleisten. </li><li> Bild Tiere mit dem IVIS Spectrum Imaging System (Caliper Life Sciences). Wenn Bildgebung mehr als 1 Tier, Ort Lichtschranken zwischen ihnen zu verhindern Cross-illumung. Tiere zunächst auf der Bauchseite abzubildenden Lokalisierung von Bakterien zu bestätigen. </li><li> Bild Tieren dorsal mit IVIS alle 2 Stunden für die Dauer des Experiments (36 Stunden). Generieren Sie einen zeitlichen Verlauf für einen bestimmten ROI. </li></ol> 6. Quantifizierung Bakterielle Biodistribution <ol><li> Euthanize Tiere mit CO 2 und Platz auf der Rückseite auf einem saugfähigen Windel. </li><li> Schalten Sie das Tier, die beiden hinteren Flanke subkutanen Tumoren freizulegen. Schneiden Sie das umliegende Hautgewebe zu trennen und entfernen Sie die Tumoren. Halten Sie den Tumor mit einer Pinzette aus der Haut mit einer Schere umgekehrte Bewegung. Wenn die Mehrheit der Haut abgetrennt wurde, vollständig zu entfernen den Tumor mit einer Pinzette. </li><li> Legen Sie die Organe in vorgewogenen Mikrozentrifugenröhrchen. Da die Masse dieser Rohre erheblich variieren können, ist es wichtig, vor der gewogen für quantitative Ergebnisse. </li></ol> 7. Quantifizierung Bakterielle Biodistribution <ol><li> Für jeden Zeitpunkt, Verbrauchsteuern und wiegen die Tumoren. </li><li> In 500 ul PBS + 15% Glycerin und homogenisieren mit einem Tissue-Tearor (BioSpec). Spülen Sie die Homogenisator 3 mal mit Ethanol zwischen den Proben. </li><li> Generieren serielle Verdünnungen und Platte für bakterielle Koloniezahlbestimmung. Um Platte mehrere Verdünnungen auf einer einzigen Platte Verwendung pre-geschnittene Platten. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mit diesem Verfahren sind wir in der Lage, Zeit-Verläufe für das Wachstum und die Genexpression Dynamik von Bakterien besiedeln Tumoren zu erzeugen. Während diese Messungen routinemäßig in vitro in Batch-Kultur oder Mikrofluidik-Geräte ausgeführt, sind sie viel schwieriger in vivo durchzuführen. Es gibt verschiedene Modifikationen zu diesen Methoden angewendet werden können. Während wir die OVCAR-8-Zelllinie verwendet, um unsere Mausmodellen zu erzeugen, kann eine Anzahl vo...

Synthetische Biologie hat sich in den letzten zehn Jahren Fortschritte gemacht und ist nun positioniert, um wichtige Probleme in den Bereichen Energie und Gesundheit auswirken. Allerdings hat die Expansion in den klinischen Bereich von Sicherheitsbedenken und einer Abwesenheit von der Entwicklung Design-Kriterien für in vivo genetische Schaltkreise verlangsamt worden. Beschleunigung hohe Schlagzähigkeit medizinische Anwendungen erfordern Methoden verwenden, die eine direkte Schnittstelle mit medizinischen Einrichtung Genetische Schaltkreise, die außerhalb des gesteuerten Testumgebung funktionieren, zu regeln und klinisch akzeptierten mikrobiellen Wirten. Eine Reihe von Stämmen sind zur Krebstherapie aufgrund ihrer Fähigkeit, vorzugsweise wachsen in Tumoren untersucht. Diese haben C enthalten novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, und S. typhimurium 3-8. S. typhimurium ist besonderem Interesse erzeugt, wie sie Sicherheit und Verträglichkeit in einer Reihe von klinischen Studien am Menschen haben gezeigt 9-12. Diese bacteri<html> A wurden gezeigt, Anti-Tumor-Wirkung durch Stimulation des Immunsystems des Wirts und von Nährstoffmangel für Krebs Zellstoffwechsel erforderlich erstellen. Produktion von therapeutischen Ladung wurde später durch genetische Modifikationen aufgenommen. Während diese Studien wichtige Fortschritte bei der Verwendung von Bakterien für die Tumor-Therapien dar, die Mehrheit der bestehenden Bemühungen auf hoher Ebene Ausdruck, führt in der Regel die Lieferung von hohen Dosierungen, Off-Target-Effekte, und die Entwicklung von Host-Widerstand 13-16 berufen . Jetzt können synthetische Biologie programmierbare Ladung Produktion durch den Einsatz rechnerisch ausgelegt genetischer Schaltkreise, die erweiterte Erfassung und Lieferung 17-20 durchführen hinzufügen können. Diese Schaltungen können entworfen, um als Delivery-Systeme, die Tumor-spezifische Stimuli und selbst regulieren Fracht Produktion notwendigen Sinn zu handeln. Allerdings hat die Untersuchung der Funktion dieser Schaltungen in vivo bisher schwierig gewesen. ve_content &quot;&gt; Da Plasmide der gemeinsame Rahmen für synthetische Schaltungen sind, beschreiben wir eine Methode, um die Dynamik von Plasmid-basierte Genexpression in vivo mit einem Maus-Modell zu charakterisieren. Diese Methoden nutzen Zeitraffer Lumineszenz Bildgebung und quantitative Messung der Biodistribution. Gemeinsam Diese Ansätze bieten einen Rahmen für die Untersuchung Plasmid-basierte Netze in vivo für klinische Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>1 ml Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc Insulinspritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Nadel </td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X), flüssig, mit L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Bouillon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani Bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr></tbody></table>

mess-wachstum und genexpression von tumor-dynamics targeted<em&gt; s. typhimurium</em&gt; bakterien

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Das Ziel dieser Versuche ist es, quantitative zeitliche Verlauf Daten über das Wachstum und die Genexpression Dynamik abgeschwächt S. generieren typhimurium wachsenden Bakterienkolonien in den Tumoren. Wir generierte Modell Xenograft Tumoren in Mäusen durch subkutane Injektion eines menschlichen Ovarialkarzinom-Zelllinie, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Wir verwandelt abgeschwächte Stämme von S. typhimurium Bakterien (ELH430: SL1344 phoPQ-1) mit einem konstitutiv exprimierten Luciferase (luxCDABE) Plasmid zur Visualisierung 2. Diese Stämme besiedeln speziell Tumoren während verbleibenden wesentlichen nicht-virulenten der Maus 1. Sobald messbare Tumore wurden hergestellt wurden Bakterien intravenös über die Schwanzvene mit unterschiedlicher Dosierung injiziert. Tumor-lokalisiert wurde bakterielle Genexpression in Echtzeit im Laufe von 60 Stunden unter Verwendung eines überwachtenin vivo Imaging System (IVIS). Zu jedem Zeitpunkt wurden Tumore herausgeschnitten, homogenisiert und ausplattiert, um Bakterienkolonien Korrelation mit Genexpressionsdaten quantifizieren. Zusammen ergibt sich daraus Daten ein quantitatives Maß für die in vivo-Wachstum und die Genexpression Dynamik der wachsenden Bakterien in den Tumoren.

Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, Daten über die in vivo-Wachstum und Genexpression Dynamik der Tumor gezielt Bakterien erzeugen. Der gesamte Workflow wird in Abbildung 1 zusammengefasst. In der ersten Stufe injizieren wir Bakterien (grün) und Bild des Tieres mit IVIS die Genexpression mit Lumineszenz-(Blau) als Reporter zu messen. Dann, in der zweiten Stufe, wir Verbrauchssteuern, zu homogenisieren und die Platte für Tumoren Ko...

Das Ziel dieser Versuche ist es, quantitative zeitliche Verlauf Daten über das Wachstum und die Genexpression Dynamik abgeschwächt erzeugen<em&gt; S. typhimurium</em&gt; Wachsenden Bakterienkolonien in den Tumoren. In diesem Video werden Tumorzelle Vorbereitung und Implantation Bakterien Vorbereitung und Injektion, Ganzkörper-Tier Lumineszenz Imaging, Tumorentfernung und bakterielle Koloniezahlbestimmung.

Mess-Wachstum und Genexpression von Tumor-Dynamics Targeted<em&gt; S. Typhimurium</em&gt; Bakterien

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Dynamik der Genexpression von S tyrian-Bakterien im lebenden Organismus zu untersuchen, während diese innerhalb von Tumoren wachsen. Zunächst werden in einem xenotransplantierten Maus-Tumormodell Bakterien über die Schwanzvene intravenös injiziert. Die Bakterien besiedeln den Tumor und wachsen exponentiell, während die Genexpression mittels lumineszenter Reporter sichtbar gemacht wird.Die biolumineszenzbasierte Ganzkörperbildgebung wird mit dem IVUS-Bildgebungssystem durchgeführt. Über einen Zeitraum von 24 bis 48 Stunden werden zeitlich aufeinanderfolgende IVUS-Aufnahmen angefertigt. Diese Bildserie wird mit Koloniezahlen korreliert, die durch Homogenisierung und Ausplattieren von Tumoren erzeugt wurden.Die Kombination dieser Daten ermöglicht es uns, die Genexpression und Populationsdynamik von tumorzielgerichteten Bakterien in vivo in Echtzeit quantitativ zu messen, basierend auf Zellkulturpassagen und Zelllinien, die mit standardmäßigen Zellkultivierungstechniken vorbereitet wurden. In diesem Experiment verwendeten wir Ocar-Acht-Zellen, die bis zu einer Zielkonfluenz von 80 bis 100 % herangewachsen waren. Die Zellen wurden geerntet und auf einem Hämocytometer gezählt, resuspendiert und in phenolrotfreiem DMEM auf eine Zielkonzentration von fünf mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter, oder etwa 200 Mikroliter pro Kolben, eingestellt. Anschließend wurden 15 % wachstumsfaktorreduziertes Matrigel hinzugefügt, und die Zellsuspension wurde bis zur Implantation auf Eis gehalten.Versuchen Sie vier Wochen alte weibliche Nude-Mäuse mit 3 % Isofluran. Geben Sie die Zellen in einer Menge von 100 Mikroliter pro Tumor in eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie jeweils eine 27½-Gauge-Nadel für zwei bilaterale Injektionsstellen im hinteren Flankengewebe. Heben Sie die Haut vorsichtig mit einer Pinzette an, um ein Zelt zu bilden, und injizieren Sie die Zellen an der Basis.Achten Sie darauf, nicht zu tief einzudringen, um Blutungen zu vermeiden. Entfernen Sie die Spritze vorsichtig mit einer Pinzette, ohne Spritzern zu verursachen. Überwachen Sie das Tumorwachstum täglich für 10 bis 20 Tage, bis ein Tumordurchmesser von zwei bis vier Millimetern erreicht ist. Vorbereitung der Bakterien: Starten Sie eine Übernachtkultur von Bakterien in drei Milliliter LB-Medium mit Antibiotika aus einer Gefrierschrankprobe bei minus 80 °C oder einer gekühlten Platte. In diesem Experiment verwendeten wir den Stamm s tyer ELH vier 30 am Morgen. Verdünnen Sie die Kultur im Verhältnis 1 zu 100 in filtriertes LB-Medium und lassen Sie sie bis zu einem OD 600 von 0,4 bis 0,6 wachsen.Zentrifugieren Sie dreimal und waschen Sie die Probe jeweils mit gepuffertem Phosphat-Salzlösung, anschließend resuspendieren Sie bei einem endgültigen OD 600 von 0,1 oder etwa 1 × 10⁷ Zellen pro ml. Für die Bakterieninjektion betäuben Sie die Tiere und positionieren sie mit dem Schwanz in Richtung Ihrer dominanten Hand. Lokalisieren Sie die Schwanzvene und weiten Sie sie mittels warmem Wasser oder einer Wärmelampe. Geben Sie die Bakterien mit 100 Mikroliter pro Maus in einer Ein-Milliliter-Spritze ab und biegen Sie die Kanüle auf weniger als 90 Grad. Richten Sie die Spritzenöffnung auf die Schwanzvene aus, durchstoßen Sie diese in geringer Tiefe, ohne Widerstand zu spüren, und injizieren Sie die Bakterien. Beobachten Sie eine Blutverdrängung, um eine erfolgreiche Injektion zu bestätigen.Warten Sie etwa 12 bis 18 Stunden, bevor die Bildgebung durchgeführt wird, um eine Kolonisation zu ermöglichen. Betäuben Sie die Tiere zur Bildgebung in der Induktionskammer. Anschließend wird jede Maus auf die Bildgebungsplattform platziert.Beibehalten Sie eine präzise Positionierung, um quantitative Ergebnisse zwischen verschiedenen Zeitpunkten sicherzustellen, und bilden Sie die Tiere mit dem Ibis-Spectrum-Bildgebungssystem ab. Falls mehr als ein Tier abgebildet wird, platzieren Sie Lichtbarrieren zwischen ihnen, um eine gegenseitige Beleuchtung zu verhindern, Tierpräparation, wobei der Tumor mit einer Pinzette gehalten wird. Entfernen Sie die Haut mit einer rückwärtigen Scherenbewegung.Bewegung, wenn der Großteil der Haut vollständig gelöst wurde, entfernen Sie den Tumor mit einer Pinzette. Legen Sie die Organe in vorab gewogene Mikrozentrifugenröhrchen. Da die Masse dieser Röhrchen erheblich variieren kann, ist es wichtig, sie vorab zu wiegen, um quantitative Ergebnisse zu erhalten.Quantifizieren Sie die bakterielle Bioverteilung für jeden Zeitpunkt, indem Sie die Tumore ausschneiden und wiegen, 500 µL PBS mit 15 % Glycerin hinzufügen und mithilfe eines Gewebemixers homogenisieren, erzeugen Sie eine serielle Verdünnung und impfen Sie zur bakteriellen Koloniezählung ab. Mithilfe dieses Protokolls können wir Daten zur in-vivo-Wachstums- und Genexpressionsdynamik von Tumoren gezielten Bakterien gewinnen. Der gesamte Arbeitsablauf ist hier zusammengefasst.In der ersten Phase injizierten wir Bakterien und bildeten das Tier mittels ivus ab, um die Genexpression mit Lumineszenz als Reporter zu messen. Danach entnahmen wir in der zweiten Phase die Tumore, homogenisierten sie und impften sie aus, um die Kolonieanzahl zur Bestimmung der im Tumor wachsenden Bakterienmenge zu ermitteln. Die von den Bakterienstämmen erzeugte Biolumineszenz wird mittels ivus sichtbar; das Signal steigt mit der injizierten Dosis, wobei die minimale Koloniedosis in allen Fällen etwa fünf mal 10 hoch fünf beträgt, bedingt durch Abschwächungen.Die Bakterien besiedeln entweder spezifisch Tumore oder wachsen im Mausmodell nicht signifikant. Das Signal wird in Radiance-Einheiten quantifiziert, um eine Normalisierung bezüglich der Belichtungszeit zu ermöglichen. Typische Werte oberhalb von 10⁶ oder höher deuten auf eine Besiedlung im Rahmen einer gegebenen Infektion hin. Das Signal nimmt im Zeitverlauf über 24 bis 48 Stunden zu. Der maximale Beginn liegt hier etwa 36 Stunden nach der Injektion, wobei die genaue Zeitpunktlage je nach verwendeter Stamm- und Plasmidkombination variieren kann. Stellen Sie sicher, dass die Maus bei jeder Messung exakt in der gleichen Position platziert wird, um quantitative Vergleichbarkeit der Ergebnisse in den folgenden Experimenten zu gewährleisten.Die bakterielle Biodistribution wird quantifiziert, um das Wachstum von Bakterien im Laufe der Zeit in verschiedenen Organen zu messen; lebensfähige Bakterien und Tumore werden durch Ausschneiden und Homogenisieren des Tumors sowie Ausplattieren seiner seriellen Verdünnung quantifiziert. Andere Organe können ebenfalls quantifiziert werden. Hier haben wir analog die Milz verwendet, da das Tumor-Milz-Verhältnis nach Rückrechnung unter Verwendung des Verdünnungsfaktors ein typisches Maß für die bakterielle Spezifität darstellt.Diese Zählungen ermöglichen es uns, die spezifische bakterielle Population über die Zeit hinweg zu messen. Auf der linken Seite ist zu erkennen, wie die Anzahl der Bakterien während des gesamten Experiments stetig ansteigt. Bei einer Verdopplungszeit zwischen einer und drei Stunden, die deutlich niedriger liegt als in Batch-Kultur-Experimenten.Das liegt wahrscheinlich an den ungünstigen Nährstoffbedingungen im Tumormikromilieu. Rechts haben wir das Tumor-Milz-Verhältnis quantifiziert und beobachtet, dass es im Verlauf des Experiments ansteigt. Ziel dieser Experimente ist es, die Dynamik des Wachstums und der Genexpression von Bakterien und Tumorumgebungen mithilfe der IVUS-Bildgebung und der Koloniezählung quantitativ zu überwachen.Wir konnten zeigen, dass Populationen von Bakterien in vivo in Tumorumgebungen charakterisiert werden können. In Zukunft können komplexere Genexpressionsprogramme entworfen und entwickelt werden, um hochentwickelte therapeutische Abgabesysteme in Bakterien zu realisieren.

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Research

Forschung

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Erfahren Sie, wie Sie Genexpression und Wachstum von S. Typhimurium in Tumoren mittels Biolumineszenz-Imaging und Koloniezählung quantitativ messen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse bakterieller Therapien.

Mess-Wachstum und Genexpression von Tumor-Dynamics Targeted

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