Name: A Human Ex Vivo Atherosklerotischen Plaque Modell zur Läsion Biologie studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Erfahren Sie ein ex vivo Modell zur Untersuchung frischer menschlicher atherosklerotischer Plaques aus Karotis- oder Koronararterien. Diese Methode ermöglicht die Analyse inflammatorischer Prozesse in Gefäßläsionen für kardiovaskuläre Forschung.

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Wir danken Nadine Wambsganss für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) ER 682/2-1 und ein Forschungsstipendium der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie zu C. Erbel, sowie einem Forschungsstipendium des Deutschen Akademischen Service-Heidelberg L. Zhao unterstützt.

1. Bereiten Medium wie folgt <ol><li> Kulturmedium: RPMI-Medium. </li><li> Werden 10% fötalem Kälberserum (FCS). </li><li> Mit 100 U / ml Penicillin G und 100 g / ml Streptomycin. </li></ol> 2. Lagerung von frischen Plaque Zylinder bis zur Verwendung <ol><li> Die Karotis-Endarteriektomie Betrieb von Patienten mit oder ohne ischämische Symptome (Schlaganfall, transitorische ischämische Attacke) mit einer signifikanten Karotisstenose werden von Gefäßchirurgen und koronare Herz Endarteriektomie bei koronaren Bypass-Operationen von Herzchirurgen durchgeführt werden. Karotis / koronare Plaques müssen en bloc entfernt werden, um die Plaque Struktur zu erhalten wie zuvor 5 beschrieben. </li><li> Nach Plaque Ausrottung Ort die Probe in einem Medium gefüllten Schlauch und speichern Sie es auf Eis (Plaque muss komplett mit Medium bedeckt sein) bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Plaque Verarbeitung <ol><li> Verwenden Sie eine ausreichende Zellkulturschale (zB 60 mm)und mit 5 ml RPMI-Medium. </li><li> Legen Sie das Plaquegewebe in der Kulturschale (Plaque sollte komplett mit Medium bedeckt sein). </li><li> Halten Sie die Plaquegewebe sorgfältig an den Kanten des Gewebes unter Verwendung einer sterilen Pinzette. </li><li> Abschneiden der Ränder des Plättchens Probe mit einem sterilen Skalpell. </li><li> Teilen Sie Plaquegewebe in der Hälfte. </li><li> Bewerten Sie die Läsion makroskopisch Morphologie (verkalkt, lipidreichen, gebrochen, Thrombus, Fibrose). </li><li> Analysieren Sie die genaue Plaquemorphologie nach dem Ex-vivo-Experiment durch Immunhistochemie. Verwenden Sie den AHA Klassifizierung 10. </li><li> Entsorgen Plaques mit schwerer Verkalkung oder Fibrose. </li><li> Schneiden Sie das Plaquegewebe in homologe kleine Stücke (3 x 3 x 3 mm). </li><li> Schock einfrieren zwei Stücke Plaque und speichern sie in flüssigem Stickstoff für die Grundwerte der Läsion bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 48-Well-Platte. </li><li> Gib 500 ul RPMI-Medium zu jeder Vertiefung für den Versuch verwendet. </li><li> Bitte verwenden Sie eint mindestens zwei Plaquestücke für jede Gruppe. </li><li> In die Substanz von Interesse (zB bestimmte Zytokine und Chemokine). </li><li> Verwenden Sie nicht stimulierten Plaque Stücke als Kontrollen. </li><li> Die Anzahl der Plaque eignet Stücke zufällig pflanzen in die Vertiefungen. </li><li> Kultur die Plaque-Stücke für angegebenen Zeitpunkten. </li><li> Für die Plaquegewebe Stimulationsversuch mit Lipopolysaccharid (LPS) <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Zeitpunkten: 3 Stunden, 8 Stunden und 24 Stunden. </li><li> Anwendung 2. Plaquestücke für die LPS und zwei für die nicht-stimulierten Gruppe für jeden Zeitpunkt sind. </li><li> 1 ug / ml Lipopolysaccharid. </li></ol></li><li> Während der Inkubation Aufrechterhaltung der 48-Well-Platte bei 37 ° C in befeuchteter Luft mit 5% CO 2. </li></ol> 4. Nach angegebene Zeit der Ernte Plaque Gewebestücke <ol><li> Schock Einfrieren der Plaque Stücke für die mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese (detaillierte Informationen siehe Proto-col Abschnitt 5). </li><li> Die überstehende Flüssigkeit und gelagert bei -20 ° C für die ELISA-Analyse. </li><li> Für Western-Blot, smash und Lyse Plaquegewebe. Filtern Sie die Lysat durch einen 0,65 um und 0,1 um Kreiselfiltereinrichtung. </li><li> Embed Plaquegewebe im Gewebe-tec oder Paraffin für die Immunhistochemie Färbungen. </li></ol> 5. RNA-Extraktion aus kultivierten Plaquestücke <ol><li> Verwenden Sie einen TissueLyser zur Homogenisierung. </li><li> Isolieren Sie die RNA durch Verwendung des Kits (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bestimmen Sie die RNA-Menge und Qualität der Proben mit Spektralphotometer. </li><li> Verwenden der Boehringer cDNA Kit zur reversen Transkription nach Herstellerangaben. </li><li> Für die quantitative PCR, verwenden Sie zum Beispiel die Roche Echtzeit-PCR-Kit mit SYBR Green. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Konflikte offen zu legen.

Hier präsentieren wir eine Ex-vivo-Plaque-Kultur-Modell, um den Einfluss der potenziell relevanten Substanzen auf atherosklerotische Läsion Biologie zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser ex vivo-Verfahren ist die Möglichkeit, den Einfluß der genannten Stoffe auf Entzündungszellen und ihre Wechselwirkung zellulärer sowie Entzündungswege und Kaskaden innerhalb der menschlichen atherosklerotischen Läsionen zu beurteilen. Mehrere nutzbare Methoden (zB RT-PCR, Western-Blot, Immunhistochemie, Durc...

Atherosklerose als eine chronische entzündliche Krankheit ist eine der Haupttodesursachen in den Industrienationen 02.01. Komplikationen der Arteriosklerose, insbesondere akutem Koronarsyndrom, haben zum Bruch der gefährdeten Läsionen in Verbindung gebracht worden, was zu Atherothrombose und Gefäßverschluss 3. Angeborenen und erworbenen Immunität scheint bei allen Schritten von 2,4-5 Atherogenese beteiligt sein. Obwohl bedeutende Fortschritte in der Behandlung von Herzinfarkt, eine wirksame Prävention von Arteriosklerose und kardiovaskulären Nebenwirkungen gemacht worden sind noch ungelöst. So studieren läsionaler Biologie ist wichtig für die Erhöhung unserer Kenntnisse über die Pathophysiologie der Atherosklerose und die Identifikation neuer therapeutischer Targets und Entwicklung neuartiger Therapien zu ermöglichen. In vielen Fällen werden murine Modelle verwendet, um die Pathophysiologie von spezifischen Krankheiten zu untersuchen. , Studium der Atherogenese mit Maus-Modellen ist jedoch accodurch mehrere Einschränkungen mpanied: (1) In der Regel erhalten atherosklerotischen Mäusen einen hohen Cholesterin-Diät. Der Cholesterinspiegel in diesen Modellen nicht mit denen bei Patienten mit erhöhten Cholesterin-Serumspiegel 6 verglichen werden. (2) Es gibt erhebliche Unterschiede zwischen den murinen und humanen Immunsystem; somit Foxp3 ist ein spezifischer Marker für Maus-regulatorischen T-Zellen, wohingegen menschliche Foxp3-Expression in humanen T-Zellen nicht unbedingt eine regulatorische Phänotyp verleihen 7. Auch die Th1/Th2 Paradigma wie beim Menschen ist nicht definiert, um Maus-T-Zellen vollständig übertragbar. (3) Eine Reihe von Markern, die verwendet werden, um murine Monozyten und Makrophagen, wie F4/80 und Markierungen der klassischen (M1) zu identifizieren vs Alternative (M2) Aktivierungsmuster nicht in der menschlichen myeloischen Zellen 8 vorhanden. (4) Gene Expression des murinen und humanen Monozyten im peripheren Blut wurde gefunden, wesentlich 9 sein. So, um unser Verständnis von erhöhenchronische Entzündungsprozesse im menschlichen Atherosklerose, müssen wir den Einsatz von Modellen der Arbeit mit menschlichen Gewebe, Blut oder Zellen zu machen. Hier beschreiben wir ein Modell der menschlichen Plaquegewebe Kultur, die Untersuchung möglicher neuer Substanzen in das Konzept der menschlichen Entzündungs ​​läsionaler Biologie ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>RPMI medium</td><td>Gibco</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Kulturschale (60 mm)</td><td>Orange Scientific</td><td>5550200</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>Zelle Kulturplatten 48-well</td><td>Greiner</td><td>677102</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel - zum Einmalgebrauch</td><td>Feder</td><td>FEA200130011</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser</td><td>Precellys 24 Dual</td><td>Cat. Nein. EQ03119.200.RD010.0</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy (Mini) Bausatz&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>Kat. Nr. 74104</td><td></td></tr><tr><td>Boehringer cDNA-Kit&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>Kat. Nr. 11483188001</td><td></td></tr><tr><td>Nanotropfen-Spektralphotometer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a human<em&gt; ex vivo</em&gt; atherosklerotischen plaque modell zur läsion biologie studieren

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosklerose ist eine chronische entzündliche Erkrankung der Blutgefäße. Es gibt verschiedene Methoden, um die Entzündungs ​​Verbindung in atherosklerotischen Läsionen zu studieren. Mausmodelle sind ein wichtiges Instrument, um entzündliche Prozesse in der Atherogenese zu untersuchen, aber diese Modelle leiden unter der phänotypischen und funktionellen Unterschiede zwischen der murinen und humanen Immunsystems. In-vitro-Zellexperimenten verwendet werden, um gezielt auswerten Zelltyp-abhängigen Veränderungen durch eine Substanz verursacht Interesse, aber kulturabhängigen Schwankungen und die Unfähigkeit, den Einfluss von spezifischen Molekülen im Rahmen der Entzündungs ​​Verbindung in atherosklerotischen Läsionen zu analysieren begrenzen die Auswirkungen der Ergebnisse. Zusätzlich Messen der Werte eines Moleküls von Interesse in menschlichen Blut hilft weiter zu untersuchen ihrer klinischen Relevanz, aber dies stellt keine systemische und lokale Entzündungen. Deshalb beschreiben wir eine Gedenktafel Kulturmodell der menschlichen atherosklerotischen Läsion Biologie studierenex vivo. Kurz, frisch Plaques aus Patienten, die Endarteriektomie oder koronaren Bypass-Operation erhalten und in RPMI-Medium auf Eis bis zur Verwendung gelagert. Die Proben werden in kleine Stücke, gefolgt von statistischer Verteilung in eine 48-Well-Platte geschnitten, enthaltend RPMI-Medium zusätzlich eine Substanz von Interesse, wie Cytokine oder Chemokine, allein oder in Kombination für definierte Zeiträume. Nach der Inkubation können die Plaquestücke Schock für die mRNA-Isolierung eingefroren werden, in Paraffin oder Oktober für die Immunhistochemie Färbung eingebettet oder zerschlagen und Western-Blot-lysiert. Ferner können Zellen, die aus der Tafel für die Durchflußzytometrie-Analyse isoliert werden. Darüber hinaus können die Überstände für die Protein Messung durch ELISA gesammelt werden. Abschließend öffnet sich das vorgestellt ex vivo-Modell die Möglichkeit, entzündliche läsionaler Biologie, die bei der Identifizierung von Krankheitsmechanismen und neue therapeutische Ziele führen kann weiter studieren.

Hier präsentieren wir eine Reihe von Figuren, die Ergebnisse der Ex-vivo-Plaque Kultivierung demonstrieren. Änderungen in der entzündlichen Umgebung in Reaktion auf das Mittel von Interesse in der ex-vivo-Modellexperiment beurteilen, messen wir verschiedene Moleküle, die bekannt sind in erster Linie in der Atherogenese beteiligt werden. Als Vertreter pro-atherogenen Zytokine wir wählen TNFa, IL-6 und IFNg 2,11. Darüber hinaus verwenden wir von-Willebrand-Faktor und Gewebefaktor pro-thromboti...

Atherosklerose ist ein chronischer Entzündungsprozess. Diese Handschrift veranschaulicht eine einfach zu ex-vivo-Modell verwenden, um frische carotis oder koronare Herz Plaques zu untersuchen. Die ex vivo-Modell erlaubt die Untersuchung möglicher Substanzen auf die entzündlichen Milieu in menschlichen arteriosklerotischen Läsionen und die Ergebnisse können mit verschiedenen Verfahren untersucht werden.

A Human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Atherosklerotischen Plaque Modell zur Läsion Biologie studieren

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein einfach anzuwendendes ex-vivo-Modell zur Untersuchung frischer Plaques der Arteria carotis oder der Koronararterien darzustellen. Dies wird erreicht, indem frische Plaques von Patienten gewonnen werden, die sich einer Endarteriektomie oder einer Bypass-Operation an der Koronararterie unterziehen. Der zweite Schritt besteht darin, die Probe in kleine Stücke zu schneiden.Anschließend erfolgt die zufällige Verteilung der Plaque-Stücke in eine 48-Loch-Platte, die RPMI-Medium enthält. Im letzten Schritt werden interessierende Substanzen wie Zytokine oder Chemokine allein oder in Kombination über definierte Zeiträume hinweg zugegeben. Abschließend können RNA-Isolierung, QPCR, Immunhistochemie und EISA zur Analyse des Plaque-Kulturversuchs eingesetzt werden.Die hier vorgestellte Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der vaskulären Entzündung zu beantworten, beispielsweise unser Wissen über die Pathophysiologie der humanen Atherosklerose zu erweitern. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Diagnose und Therapie der Atherosklerose. Dies ist die einzige Methode, um die Rolle interessanter Moleküle im ent

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Forschung

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Medizin

Wir Detail eines neuen Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) Katheter für die 2-dimensionale intravaskulären molekulare Bildgebung von Plaque...

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) intravaskuläre Molecular Imaging von entzündlichen Plaque, einen multimodalen Ansatz, um Imaging der Atherosklerose

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