Name: Isolation von sensorischen Neuronen von Aplysia californica Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Isolation sensorischer Neuronen von Aplysia californica für Patch-Clamp-Studien glutamaterger Ströme. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung spannungs- und agonistengesteuerter Ionenströme in kurzzeitiger Kultur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gefördert durch NIH P40 OD010952 die Korein Foundation, einer von der Universität Miami Stipendium für SLC und ein Stipendium für Maytag ATK. Die Autoren danken den Mitarbeitern der nationalen Ressource für Aplysia sowie Lauren Simonitis und Hannah Peck, die Aufnahmen für eine Figur zur Verfügung gestellt.

1. Zellpräparation <ol><li> Am Tag 1, wiegen und betäuben Tier. <ol><li> Wiegen eine 30 g-1 kg Tier. Anesthetize in 5-10 Tier Volumen von 1:1 Meerwasser: isotonische MgCl. 6H 2 0 1 h mit Belüftung wie eine elektrische Luftpumpe Aquarium mit angeschlossenem airstone. </li></ol></li><li> Bereiten Dissektion liefert. <ol><li> Montieren sauber Dissektion Tablett mit Edelstahl Stecknadeln, wie Stoff-Pins. Montieren Sie mehrere Petrischalen mit künstlichem Meerwasser (ASW, siehe Tabellen 1 und 3) + Penicillin / Streptomycin (P / S). </li><li> Haben Sie bereit eine Low-Power-Mikroskop. Haben sauber Dissektionsinstrumente bereit, wie z. B. gerippte Nase und feine chirurgische Pinzette und feine und große chirurgische Schere. Sprühen Sie die Geräte mit 70% Isopropylalkohol vor der Verwendung und trocknen lassen. </li></ol></li><li> Position Tier auf Dissektion Fach. <ol><li> Position Tier Bauchseite nach unten in der Präparation Fach. Pin Tierdurch Kanten des Körpers Wand und parapodial Grenzen, aber vermeiden Schwanz und Kopf, um die dorsale Oberfläche freizulegen und den Genitalbereich Nut </li><li> Spülen Sie die Dorsalfläche in langsam laufenden kaltem Leitungswasser. Tragen Sie eine dünne Strom von 70% Isopropylalkohol von einem Squeeze-Flasche entlang der genitalen Nut und über die Oberseite des Kopfes. </li></ol></li><li> Machen Sie den ersten Schnitt. <ol><li> Mit einem Low-Power-Mikroskop (siehe Tabelle 2) und das reflektierte Licht auf den Punkt, wo die genitale Nut stammt aus der vorderen Schale Marge beobachten, straff mit gerippten Nase-Zange eine Falte des Gewebes auf der linken Seite dieser Herkunft zu halten, während eine flache snipping Hole Alle den Weg durch die glatte, ebene Fläche des Körpers Wand gleich rechts von der genitalen Nut mit feinen abgewinkelte Schere. </li><li> Hämolymphe beobachtet werden, um aus dem Loch gießen, manchmal mit sich trägt, die Abdominalganglion und Magen. </li></ol></li><li> Erweitern Sie den Einschnitt. <ol><li> Verwenden Sie große Schere th erweiterne Einschnitt vorne zu einem Punkt zwischen den Rhinophoren, um beim Ziehen nach oben mit dem unteren Messer zu vermeiden nicking den Darm. Die inneren Organe werden beobachtet zu verschütten aus dem Einschnitt werden. </li></ol></li><li> Entfernen Sie den Ganglien. <ol><li> Positionieren Sie das Fach, und konzentrieren das Mikroskop auf den Kopfbereich. </li><li> Mit sauberen Pinzette und einer feinen Schere, entfernen Sie den Kopf Ganglien durch Abtrennen an einem Punkt die Nerven, die den Kopf Ganglien bilden in einem Ring um die Speiseröhre zu Pleura-Pedal und Cerebralganglien als Gruppe zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die bukkale Ganglion, das der Bauchseite des Ösophagus hält. </li><li> Entfernen Sie die Abdominalganglion indem die 4 großen Nerv Konnektive dass Problem von diesem Ganglion. </li></ol></li><li> Isolieren Ganglien des Interesses. <ol><li> Trim Kopf Ganglien auseinander, so dass eine Länge von Verknüpfungen an jedem Ganglion von Interesse, die in Höhe von mindestens dem Durchmesser des Ganglion ist, dies wird über verzögern Enzym-Verdauungvon den Zellen von Interesse in dem nächsten Schritt. </li><li> Setzen Sie jedes Ziel Ganglion durch 2 Spülungen ASW + P / S, die sich zwischen Spülungen mit sauberen Pinzette. </li><li> Wenn gezielt die PVC Zellen, lassen Sie den rechten Pleura hemiganglion an das rechte Pedal hemiganglion, und in ähnlicher Weise lassen Sie die linke Pleura hemiganglion an der linken Pedal hemiganglion. </li><li> Entsorgen Sie unerwünschte Ganglien und den Rest des Tieres nach akzeptierten Forschungspraxis. </li></ol></li><li> Enzymatisch verdauen die Ganglien. <ol><li> Für jedes Ganglion Herstellung von 1 ml Enzymlösung, bestehend aus 3,75 mg Dispase, 1 mg Hyaluronidase und 0,3 g Collagenase Typ XI pro ml ASW + P / S in einem 15 ml konischen Röhrchen aus Polypropylen. </li><li> Platz gespült Ganglien in Enzymlösung und befestigen Sie den Deckel fest. Legen Sie das Rohr auf seiner Seite auf einem Schüttler (siehe Tabelle 2) bei niedriger Geschwindigkeit für 13-5 h über Nacht bei ca. 23 ° C (Raumtemperatur). </li></ol></li><li> Bereiten Sie dasKulturschalen. <ol><li> Vor Mikrodissektion (Tag 2), bereiten Poly-D-Lysin (PDL)-beschichteten Kulturschalen in einer Gewebekultur Kapuze. In ~ 0,5 ml PDL (0,2 mg / ml sterilem Wasser) in die Mitte eines 35-mm-Schale für ~ 25 min. </li><li> Spülen PDL 3x mit sterilem Wasser. Trocknen lassen. UV-Sterilisation der Platten. </li></ol></li><li> Tag 2 Isolieren Neuronen. <ol><li> Füllen Sie das Zentrum von 35 mm Gerichte, die PDL-beschichteten und UV mit ca. 0,5 ml ASW + P / S sterilisiert, um eine Insel der Medien innerhalb der ansonsten trockenen Gericht zu schaffen waren. Dies kann auf der Bank durchgeführt werden, außerhalb der Gewebekulturabzug. Ein Gericht sollte für jede Zelle, die von einem Cluster hemiganglion hergestellt werden. </li><li> Haben Sie bereit eine 100 mm Durchmesser Dissektion Gericht durch Sylgard-Beschichtung und Härten einer 5 mm tiefen Dissektion Oberfläche, mit feinen Sezierung Pins von mehreren Größen als Stifte und Sonden verwendet werden (siehe Tabelle 3) ausgestattet. Spülen Sie dieses Gericht mit 70% Isopropylalkohol, dann mit ASW + P / S, und schließlich fill sie mit ASW + P / S. </li></ol></li><li> Bereiten Mikrodissektion verdaut Ganglien. <ol><li> Gießen Sie die Lösung, die das Enzym verdaut Pleura-Pedal und Buccalganglien in die Dissektion Gericht. </li><li> Legen Sie die Schüssel auf dem Tisch des Mikroskops gegen eine schwarze Fläche unter reflektierte Licht. </li><li> Mit dem beigefügten Bindegewebe, festzunageln jedes Pleura-Pedal hemiganglion dorsalen Seite nach oben. Die Gewebe wird weich und intolerant von Stretching. </li></ol></li><li> Microdissect PVC Neuronen. <ol><li> Mit 2 Paar sauberen feinen Pinzette, und hält einen feinen Sezierung Stift in eine Pinzette als Sonde, isolieren die Zellen aus einem PVC Pleura hemiganglion. Enzyme Verdauung wird entfernt haben oder neben das Bindegewebe Mantel für den PVC-Cluster gebrochen, aber die Zellen aneinander haften. </li><li> Verwenden Sie die Sonde, um diese Zellen aus dem Pedal-Pleura Binde 18 lösen, dann lassen Sie die Zelle Cluster fallen auf den Boden der DissektionGericht. </li></ol></li><li> Übertragen Neuronen Kulturschale. <ol><li> Übertragen Sie die Zelle Cluster auf eine vorbereitete 35 mm Kulturschale durch leichtes Ansaugen der Cluster in der Spitze eines leicht feuerpolierten Einweg-Glas-Pasteur-Pipette, dann Abgeben es langsam in den Medien Insel in einer Kulturschale, wobei darauf zu vermeiden Einführung Luftblasen in die Pipette. Wiederholen Sie die Isolierung des PVC-Cluster der anderen hemiganglion und in einen separaten Kulturschale. </li></ol></li><li> Microdissect und übertragen BSC Neuronen. <ol><li> Merken Sie sich die bukkalen Ganglion Bauchseite up, mit Sorgfalt, um die Zellen von Interesse zu ersparen. Wiederholen Sie Schritt 2 1.12 mit den BSC Zellhaufen der bukkalen Ganglion 10. </li><li> Isolation von PVC und BSC Neuronen produzieren 4 Kulturschalen mit Neuronencluster: 2 Schalen mit BSC-Cluster und 2 Schalen mit PVC-Clustern. Entsorgen Sie den Rest der Ganglien und beiseite stellen die 100 mm Dissektion Gericht. </li></ol></li><li> Dissociate die Zellhaufen. <ol><li> Legen Sie eine Kulturschale mit Zellen auf der Stufe der Low-Power-Mikroskop und den Deckel abnehmen. </li><li> Dissociate die PVC-Cluster durch leichtes Ausklopfen den Boden der Kulturschale neben dem Zellverband mit einem feinen Stift in Dissektion Zange gehalten. Flicking gräbt die Spitze des Stiftes in den Kunststoff der Boden der Schale als versuchte heraus zu graben ein Fleck aus Kunststoff. Wenn die Reibung mit dem Kunststoff der Stift Punkt gibt, wird eine Stoßwelle durch das Medium, die auseinander bricht die Nähe Klumpen von Zellen produziert. </li><li> 5-10 Flicks erforderlich sein, um fast vollständig distanzieren die Zellen werden, aber es ist besser, kleine Gruppen von Zellen eher verlassen als zu viel streichen damit die Zellen durch mechanische schiere zerstört werden. </li><li> Deckel aufsetzen und wiederholen mit anderen Kulturschalen. </li></ol></li><li> Bewahren Zellkulturen. <ol><li> Legen Sie die Kulturschalen mit Medien Inseln in ihren Zentren mit dissoziierten Zellen inein großer Container, der Luftzirkulation, zB ein 150 x 25 mm rund Kunststoff-Petrischale erlaubt, und legen Sie dieses Gericht in einem Inkubator-Set bis 17 ° C. </li><li> Installieren Sie in der Kammer eine offene Schale mit Wasser als Quelle von Feuchtigkeit. Lassen Sie über Nacht ungestört. Die Zellen werden auf die Poly-D-Lysin-Beschichtung in der Mitte der Schale zu halten. </li></ol></li><li> Flood Kulturschalen. <ol><li> Am Tag 3, vorsichtig überschwemmen die Gerichte mit 2,5 ml ASW + P / S. Untersuchen und zählen Sie die Zellen mit einem inversen Mikroskop Zellkultur. Shop in der 17 ° C-Inkubator. </li></ol></li></ol> 2. Elektrophysiologie Die Methode ist Standard Patch-Clamp-das hat in zahlreichen Texten beschrieben worden (z. B. Sakmann und Neher, 1995) 16. Dieses Protokoll wird auf Zellen arbeiten ≤ 100 pF Kapazität oder Zellen &lt;60 Mikrometer Durchmesser während der Tage 3 und 4 des Protokolls. Zellen ohne Prozesse sind optimal für die Aufnahme. Die folgenden speziellen PRÜFUNGIonen gelten: <ol><li> Größere Zellen können mit der Konfiguration Einstellung auf dem Axopatch 200B Verstärker auf β = 0,1 untergebracht werden. Aktivierung sehr große Ströme verursachen Zellen Spannungsklemme entkommen. ASW Lösungen für Salzgehalt substituiert (z. B. ein Bruchteil des NaCl mit undurchlässigen N-methyl-D-Glucamin Chlorid substituiert ist) verwendet werden, um Gesamtzellstrom Amplitude zu reduzieren. </li><li> Fasergefüllte Borosilikatglas Patch-Pipetten auf einer Pipette Abzieher gezogen und auf halbem Weg mit intrazellulären Lösung (ICS), bestehend aus 450 mM KCl und andere Salze (siehe Tabelle 1) verfüllt sind geeignet und sollte Widerstand von ca. 0,5-1 MOhm haben. Wenn Isolierung spezifischer Ionenströme erwünscht ist, beispielsweise Na +-Ströme in Abwesenheit von K Ströme, K + in dieser Lösung mit anderen Ionen, wie Cs + ersetzt werden. Cl - Austausch von ICS mit einem impermeant Anion ist auch dann gerechtfertigt, wenn eine natürliche ICS erwünscht9. </li><li> Die Zellen sind mit&gt; 1 hr-lange Aufnahmen möglich bei Raumtemperatur stabil. Die Aufnahme ist optimal an den Tagen 3 und 4 des Protokolls, entsprechend 24-48 h in Kultur. Nach 48 Stunden gibt es Schwierigkeiten bilden Gigaohm Dichtungen, vielleicht wegen der Ausarbeitung eines Glykokalyx auf der Zelloberfläche und Raum Klemme Probleme Prozess Auswuchs verursacht. Die Zellen sind nützlich, aber für nicht-Patch-Clamp-Untersuchungen wie Toxikologie, die bei &lt;14 d abgeschlossen werden kann. </li><li> ASW und andere Lösungen von der Schwerkraft Lösung Gerät verzichtet werden, sowie intrazelluläre Lösung sollte durch eine Spritze gefiltert werden montiert 0,2 um Acrodisk Filter (Tabelle 3), um feine Partikel, die mit Gigaohm Dichtung Bildung stören zu beseitigen. </li><li> Desensibilisierung tritt bei der Verwendung von Agonisten, wie zB D-Aspartat (D-Asp), deshalb ~ 1-2 min zwischen Anwendungen von Agonisten empfohlen. Umgekehrt wird oft mit schnellen Potenzierung wiederholt Anwendung beobachtetKation-Agonisten, wie L-Glutamat (L-Glu). </li><li> Agonist aktiviert Ströme wie L-Glu durch Anlegen Agonisten mit der Pipette Picospritzer untersucht werden. Diese Pipette ist der gleiche wie der Patch-Pipette gezogen und enthält Agonist in ASW. Wenn die Spitze dieser Pipette ist unterhalb der Abflussleitung der Schwerkraft Lösung positioniert und in einem 45 ° Winkel von der Abflussleitung (2F), Agonisten schnell weggewaschen werden aus der Zelle und Desensibilisierung minimiert. Der Agonist Pipette schaffen einen Winkel von 90 ° oder mehr relativ zu der Patch-Pipette. </li></ol>

<ol><li>Buttner, N., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+modulation+of+a+hyperpolarization-activated+Cl%28-%29+current+in+Aplysia+sensory+neurons+by+SCP%28B%29+and+FMRFamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide.</a> J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).</li>
<li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).</li>
<li>Carlson, S. L., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).</li>
<li>Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Behav%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).</li>
<li>Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Na%2B+and+Ca2%2B+currents+in+bag+cells+of+sexually+immature+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).</li>
<li>Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+D-Aspartate+ion+currents+in+the+Aplysia+nervous+system+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging.</a> Br. Res. 1343, 28-36 (2010).</li>
<li>Glansman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+in+Aplysia%3A+The+Cheshire+Cat+of+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).</li>
<li>Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cellular+Mechanism+of+Classical+Conditioning+in+Aplysia%3A+Activity-Dependent+Amplification+of+Presynaptic+Facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%2C+New%22%5BJournal%5D)">A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation.</a> Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).</li>
<li>Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acetylcholine+on+ventrocaudal+sensory+neurons+in+the+pleural+ganglia+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia.</a> Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Cellular+basis+of+behavior%22">Cellular basis of behavior</a>. , W.H. Freeman. New York. (1976).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialog+between+nerves+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li>
<li>Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+correlates+of+habituation+and+habituation+of+the+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).</li>
<li>Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+an+Aplysia+bag-cell+neuron+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+A+and+a+protein+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase.</a> J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).</li>
<li>R, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transcriptome+of+Aplysia%3A+neuronal+compartments+and+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry.</a> Cell. 127, 1453-1467 (2006).</li>
<li>Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+underlying+developmental+regulation+of+repetitive+firing+in+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).</li>
<li>Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+Ca2%2B+current+contributes+to+a+prolonged+depolarization+in+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).</li>
<li>Schacher, S., Proshansky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+regeneration+by+Aplysia+neurons+in+dissociated+cell+culture%3A+modulation+by+Aplysia+hemolymph+and+the+presence+of+the+initial+axonal+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment.</a> J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).</li>
<li>Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoafferent+neurons+innervating+tail+of+Aplysia.+I.+Response+properties+and+synaptic+connections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections.</a> J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).</li>
<li>Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Ca%282%2B%29-sensitive+nonspecific+cation+channel+underlying+prolonged+repetitive+firing+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons.</a> J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).</li>
<li>White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+regulates+a+vesicular+class+of+calcium+channels+in+the+bag+cell+neurons+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).</li>
<li>Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+a+calcium-sensitive+nonspecific+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+and+phosphatase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J. Vis. Exp. (28), e1355(2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Dissoziation hier beschriebenen Techniken ergeben sensorischen Neuronen Kulturen mit 50-100 isolierten Neuronen mit einer kleinen Anzahl von Gliazellen und anderen nicht identifizierten Zellen durchsetzt. Die wichtigsten Schritte in dem Protokoll sind die Zeit die Ganglien in Enzym Lösung bleiben, und schnippen, die Dissoziation der verdauten Zellhaufen auseinander zu brechen das Cluster in einzelne Zellen. Enzyme Verdauung (Schritt 1.8) muss bei der Temperatur zur Verfügung optimiert werden. Bei 23 ° C unter langsa...

Die marine opistobranch Weichtier, Aplysia, ist ein nützliches neurobiologischen Modell für viele Jahrzehnte. Es ist am besten als ein Modell der Gewöhnung und klassische Konditionierung 7, 8 bekannt. Studien über Lernen und Gedächtnis in diesem Modell gewann den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin im Jahr 2000 für Eric R. Kandel, in einem Preis, den er mit Arvid Carlsson und Paul Greengard 10 geteilt. Studien mit elektrischen Aufnahmen von reduzierten Zubereitungen, in denen Elemente des Nervensystems des wirbellosen aus dem Tier seziert Nerven und Muskeln belassen wird, haben dazu beigetragen, erläutern die Rollen der einzelnen Neuronen in Aplysia. Identifizierung der genauen molekularen Mechanismen, die das Lernen in Aplysia bilden aber oft eine andere Technik eingesetzt, langfristige Co-Kulturen von einer sensorischen Neuronen und Motoneuronen, erhalten eine nach der anderen von den einzelnen Tieren und Spender erlaubt, eine Synapse in der Kulturschale 21 bilden . Wir und andere 1, 3, 6, 14, 15, 16 haben die Leichtigkeit, mit der Neuronen in diesem Modell kann gezielt sowie ihre Ausdauer werden in langfristige Experimente dissoziiert kurzfristig Kulturen von Clustern aus nominell homogenen Neuronen identifiziert machen genutzt in denen wir studieren Ionenströme unter Voltage-Clamp in der Patch-Clamp-Konfiguration. Viele Aplysia aufstehen, um wiederholte Runden der Patch-Clamp-Zeit für dauerhafte experimentelle Manipulationen zu ermöglichen. Das Verfahren ist nützlich für die Neuronen wie die neurosecretory Tasche Zellen des Abdominalganglion und der sensorischen Neuronen der Pleura und Buccalganglien deren Dissoziation hier beschriebenen, nicht aber für sehr große Neuronen&gt; 60 um Durchmesser, wie L7 oder R2 die Abdominalganglion. Wir beschäftigen keine Aplysia Serum in unseren Kulturen, im Gegensatz zu den sensorisch-Motoneuronen Co-Kulturen an anderer Stelle beschrieben. Die meisten Neuronen erhalten mit diesem Verfahren wird ohne Prozesse für ter zunächst 48 h in Kultur, Erleichterung ganze Zelle Spannung Aufnahme, aber dann sprießen und erarbeiten Axone und andere Prozesse für etwa 14 Tage vor dem Sterben aus Mangel an Nährstoffen und / oder Wachstumsfaktoren. Diese Technik erzeugt primären Kulturen von 50-100 Neuronen pro Schale aus physiologisch dokumentiert Regionen der bukkalen und Pleuralganglien. Dieses Protokoll ist für die Forscher studieren Aspekte der einzelnen Zelle Physiologie in Experimenten, die zahlreiche Experimentwiederholungen pro Tier erforderlich. Es entsteht ein passendes Paar von Kulturen aufgrund der anatomischen Trennung der Zielzellen in linke und rechte hemiganglia, ermöglicht Untersuchungen, die Nutzen aus abgestimmten Behandlung und Kontrollkulturen. Das Protokoll zielt bukkalen S-Cluster (BSC) Neuronen des Ganglion bukkalen und Pleura ventrokaudal (PVC) Neuronen des Ganglion Pleura. Diese Zellen sind eine geeignete Größe für die gesamte Zellspannung Aufnahmen und Display robust glutamatergen Antworten. Die diskutierten Methodik ist für die meisten Ganglien in der Aplysia Nervensystem.

<table><tbody><tr><td>Künstliches Meerwasser ASW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>sortiert (</td><td>mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7,6</td></tr><tr><td>Intrazelluläre Lösung</td><td>Sigma</td><td>sortiert</td> <td>(mM): 450 KCl, 2,9 CaCl2 (2 H2O), 2,5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA und 40 HEPES-KOH, pH 7,4</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin zu ASW um 1:100 hinzugefügt</td><td>Lonzo Walkersville, Inc.</td><td>17-603E</td><td>5.000 Einheiten/ml Penicillin plus 5.000 mg/ml Streptomycin</td></tr><tr><td>Neutrale Dispase II</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10165859001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamat (L-Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Aspartat (D-ASP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11200-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N-Methyl-D-aspartat (NMDA)</td><td>Biomol</td><td>100002-268</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-ASP</td><td>Sigma</td><td>A6683-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alpha-Amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazol-propionsäure (AMPA)</td><td>Sigma</td><td>A6816-5MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glu R Antagonisten,</td><td>verschiedene</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>agar</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>kynurenate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DL-2-Amino-5-phosphonopentansäure (NMDAR-Antagonist)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWRSP</td><td>BDH1133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloridlösung</td><td>Sigma</td><td>sortiert</td><td>25 g FeCl3 + 25 ml konzentriertes HCl + 50 ml H2O</td></tr><tr><td>Sylgard Silikon 2-Komponenten-Polymer</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYL184</td><td>Bietet Pin-Out-Oberfläche für kleine Präparierschalen</td></tr><tr><td>0-40-fache Zoomvergrößerung Mikroskop für Dissektionen</td><td>Wild</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Techniquip 150 Watt faseroptische Beleuchtung</td><td>Mikrooptik von Florida</td><td>TQ FOI-150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RotoMix 50800 Orbitalmischer</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot inverses Phasenkontrastmikroskop mit 4x, 20x (optional) & 40x Objektiven</td><td>SR Research Ltd.</td><td>Ösenlink II&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Digitales Oszilloskop von Tektronix</td><td>SR Research Ltd.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pClamp 10 Datenerfassungs- und Analysesoftware</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PC mit Betriebssystem Windows XP oder höher</td><td>PC-Lösungen</td><td></td><td>Thinkserver mit Solid-State-Festplatten (80 GB) und geräuscharmen Monitoren</td></tr><tr><td>Flaming/Brown P87 Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Axon Instruments Axopatch 200B Zangenverstärker mit einem Kapazitätskompensationsbereich von 1-1000 pF; Vorverstärker</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon instruments Elektrodenhalter-Baugruppe für Axopatch 200B Vorverstärker</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV203BU</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1200 A/D-Wandler</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer, powered by N2 einstellbar in Druck und Dauer</td><td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TMC Micro-G Schwingungsisolationstisch</td><td>Ametek</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig,</td><td></td><td></td><td>kundenspezifische Anfertigung</td></tr>, <tr><td>Burleigh Piezoelektrische Clamshell-Mikromanipulatoren</td><td>, Burleigh Instruments; Thorlabs</td><td></td><td>derzeit PCS-5000; -6000 Serie + Halterungen</td></tr><tr><td>Narishige M-152 manuelle Manipulatoren (für Perfusionssystem und Picospritzer)</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filamentpipettenglas, 1,5 mm AD, 0,84 mm ID -</td><td>WPI</td><td>1B150-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3 Zoll Länge</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ag/AgCl Halbzelle</td><td>WPI</td><td>EP4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen, 35-2097 BD Falcon* Zentrifugenröhrchen</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td>&<td>nbsp;</td></tr><tr><td>Abgewinkelte Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumostar Feine Pinzette</td><td>Feine Wissenschaft Werkzeuge</td><td>11295-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm Falken-Gewebekulturschalen</td><td>VWRSP</td><td>25382-064</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 150 x 25 mm Gewebekulturschalen; 1013</td><td>VWRSP</td><td>1013</td><td>kann auch zu kleinen Präparierschalen verarbeitet werden</td></tr><tr><td>mit sylgard sylgard</td><td>WPI</td><td>SYL184</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Seziertablett für Tiere</td><td>verschiedene</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen, 35-2097 BD Falcon</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>Für 6-Loch-Perfusionssystem mit Schwerkraftzufuhr</td></tr><tr><td>Aluminiumclips mit Schraubenlochenden</td><td>Baumarkt</td><td></td><td>Für Perfusionssystem</td></tr><tr><td>23 Gauge-Nadeln (manuell abfeilen Punkte)</td><td>VWRSP</td><td></td><td>Für Perfusionssystem</td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch 0,022" ID x 0,042" OD; 427411</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>für Perfusionssystem</td></tr><tr><td>H-7 Pipettenständer/-halter für Microcap-Perfusionsarray</td><td>Narishige Deutschland</td><td></td><td>Für Perfusionssystem</td></tr><tr><td>Einwegventile</td><td></td><td></td><td>Für Perfusionssystem</td></tr><tr><td>Drummond Microcaps 1 &mu; l</td><td>VWRSP</td><td></td><td>Für Perfusionssystem</td></tr><tr><td>18 Gauge-Nadeln für die Absaugung (abgefeilte Punkte)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch</td><td>Cole Parmer</td><td>4.27436E+11</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>feine Sezierstifte</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapillarrohre</td><td>Kimble 71900-100</td><td></td><td>feuerpoliert und U-förmig in einer Bunsenbrennerflamme gefüllt und gefüllt mit 3% Agar in ECS</td></tr><tr><td>Modelliermasse</td><td>Bastelgeschäft</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Schalenhalter für Mikroskoptisch mit isoliertem Bodenbad</td><td></td><td></td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>VWRSP</td><td>14672-412</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipettenbirnen</td><td>VWRSP</td><td>53283-911</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>acrodisk Spritzenvorsatzfilter</td><td>VWRSP</td><td>28144-040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>dickwandiges Borosilikat-Filamentglas mit 1,5 mm Durchmesser</td><td>WPI</td><td>1B150F-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hochreiner Stickstoffzylinder und gabelbarer Regler</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tabellen 1-3. Listen von Reagenzien, Materialien und Geräten.</td></tr></tbody></table>

isolation von sensorischen neuronen von<em&gt; aplysia californica</em&gt; für patch-clamp-recordings von glutamaterge currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Die Meeresschnecke Aplysia californica Weichtier hat eine traditionsreiche Geschichte als Modell für die Funktion des Nervensystems, mit besonderer Bedeutung in den Studien von Lernen und Gedächtnis. Die typischen Vorbereitungen für solche Studien sind solche, bei denen die sensorischen und Motoneuronen intakt gelassen werden in einem minimal seziert Tier oder eine technisch aufwendige neuronalen Co-Kultur der einzelnen sensorischen und Motoneuronen. Weniger häufig ist das isolierte neuronale Vorbereitung, in denen kleine Gruppen von Neuronen sind nominell homogen dissoziiert in einzelne Zellen in kurzfristige Kultur. Solche isolierten Zellen sind für die biophysikalischen Charakterisierung Ionenströme mit Patch-Clamp-Techniken, und gezielte Beeinflussung dieser Leitwerte. Ein Protokoll für die Herstellung solcher Kulturen beschrieben. Das Protokoll nutzt die leicht identifizierbaren glutamatergen sensorischen Neuronen des Pleura-und Buccalganglien, und beschreibt deren Dissoziation und minimale Wartung in Kultur für mehrere Tage ohne Serum.

Die Positionen der sensorischen Neuronen im Ganglien, die in diesem Protokoll ausgerichtet sind, sind die BSC und PVC Neuronen in Abbildung 1 dargestellt. Die BSC Neuronen in 2 symmetrische oval Cluster auf der Bauchseite des bukkalen Ganglion, die Oberfläche, die abgewandt von der bukkalen Masse im intakten Ganglion (1A) angeordnet ist. Die PVC Neuronen bilden bilateralen, V-förmigen Cluster, die sich um die dorsale Oberfläche der Pleura Ganglion in Richtung der Mittelachse (1B...

Wir beschreiben die Dissektion des Nervensystems der Meeresumwelt Seehasen<em&gt; Aplysia</em&gt; Nach der Narkose, die Isolierung von Neuronen für kurzfristige-Gewebekulturen, und Aufnahmen von einzelnen Zelle Ionenströme über die Patch-Clamp-Technik.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Sinnesneuronen von Plegia für eine kurzzeitige Kultur zu isolieren. Für Patch-Clamp-Studien wird dies erreicht, indem zunächst die Ganglien, die Sinneszellen enthalten, von einem anesthetisierten Tier disseziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Ganglien über Nacht in einer Enzymlösung zu verdauen. Anschließend werden die gewünschten Sinnesneuronen aus den verdauten Ganglien präpariert. Der letzte Schritt ist die Dissoziation der vorbereiteten Kulturschalen, um sie über Nacht an das Kultursubstrat anzulagern. Abschließend wird die Spannungs-Clamp-Technik verwendet, um die in diesen Neuronen exprimierten spannungs- und agonistenabhängigen Ionenströme zu untersuchen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der in-situ-Zellaufzeichnung, liegt darin, dass die Isolierung der Neuronen die Anwendung einer Einzel-Elektroden-Voltage-Clamp-Technik ermöglicht. Diese Methode kann helfen, wichtige Unbekannte im Bereich der Aplysia-Neurobiologie zu identifizieren, beispielsweise die Identität von Ionenströmen, die durch Neurotransmitter aktiviert werden, die an Lern- und Gedächtnisprozessen beteiligt sind. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Empfindlichkeit der Neuronen gegenüber enzymatischer Verdauung und Verteilung auf Kulturschalen Schwierigkeiten. Die Idee zu dieser Methode entstand, als uns bewusst wurde, dass bestimmte glutamaterge Ströme, die für Lernen und Gedächtnis wichtig sind, von der Zellisolierung profitieren würden, die diese Methode ermöglicht. Die Durchführung der Prozedur demonstrieren die Doktoranden Andy Kesel und Justin Greer. Beginnen Sie die Prozedur damit, dass Sie ein anästhesiertes Tier mit der Bauchseite nach unten in das Präparationsfeld legen.Fixieren Sie das Tier durch die Ränder der Körperwand und die parapodalen Ränder, vermeiden Sie jedoch Kopf und Schwanz, um die dorsale Fläche der Genitalfurche freizulegen. Spülen Sie anschließend die dorsale Fläche mit langsam fließendem kaltem Leitungswasser ab. Tragen Sie danach einen schwachen Strahl von 70 % Isopropylalkohol aus einer Druckflasche entlang der Genitalfurche und über die Oberseite des Kopfes auf.Um den ersten Schnitt vorzunehmen, halten Sie mit der Rippen-Spitze-Zange eine Gewebefalte links von der Basis der Genitalfurche straff, während Sie mit einer feinen gekrümmten Schere ein flaches Loch vollständig durch den glatten, flachen Bereich der Körperwand direkt rechts von der Genitalfurche schneiden. Erweitern Sie dann den Schnitt nach anterior bis zu einem Punkt zwischen den ROF-Vieren, wobei Sie mit der unteren Klinge nach oben ziehen, um die Eingeweide nicht zu verletzen. Verwenden Sie anschließend saubere Pinzette und feine Schere, um die Kopfganglien zu entfernen, indem Sie die Stelle durchtrennen, an der sich die Nerven, die die Kopfganglien bilden, zu einem Ring um die Speiseröhre herum verbinden, um so die pleurale Platte und die cerebralen Ganglien gemeinsam zu entfernen.Entfernen Sie danach das Buccalganglion, das an der ventralen Seite der Speiseröhre haftet. Um die gewünschten Ganglien zu isolieren, trennen Sie die Kopfganglien voneinander ab und lassen Sie an jedem gewünschten Ganglion eine Verbindung von mindestens dem Durchmesser des Ganglions hängen. Dies verhindert, dass das Enzym im nächsten Schritt die Zellen von Interesse übermäßig verdaut.Anschließend spülen Sie jedes Zielganglion zweimal in Schalen mit künstlichem Meerwasser mit Penicillin-Streptomycin aus. Wenn die PVC-Zellen gezielt werden sollen, belassen Sie das rechte pleurale Hemiganglion mit dem rechten Petal-Hemiganglion verbunden, und ebenso das linke pleurale Hemiganglion mit dem linken Petal-Hemiganglion. Danach geben Sie die gespülten Ganglien in die Enzymlösung und verschließen die Kappe fest.Anschließend das Reagenzglas seitlich auf einen Rüttler stellen und über Nacht 13 bis 15 Stunden lang bei langsamer Geschwindigkeit bei etwa 23 Grad Celsius inkubieren. Füllen Sie in diesem Verfahren die Mitte der mit PDL beschichteten und UV-sterilisierten 35-Millimeter-Dishs mit etwa 0,5 Millimetern künstlichem Meerwasser und Penicillin-Streptomycin, um eine Insel aus Medium im Inneren zu erzeugen. Um die Mikrodissektion der digerierten Ganglien vorzubereiten, gießen Sie die Enzymlösung, die die digerierte pleurale pedale und bukkale Ganglien enthält, in die Dissektionschale.Als Nächstes stellen Sie die Petrischale auf den Mikroskoptisch gegen eine schwarze Oberfläche unter Reflexlichtbeleuchtung. Anschließend fixieren Sie mit Hilfe des anhängenden Bindegewebes jedes pleurale Petalen-Hemiganglion mit der dorsalen Seite nach oben; das Gewebe wird weich sein und mechanischer Dehnung nur gering standhalten. Isolieren Sie dann die PVC-Zellen aus einem pleuralen Hemiganglion unter Verwendung zweier Pinzettenpaare, wobei Sie eine feine Präparationsnadel mit einer der Pinzetten als Sonde halten. Verwenden Sie die Sonde, um diese Zellen von der Blütenblatt-, Plural-, Verbindungszelle zu lösen. Lassen Sie dann den Zellverband auf den Boden der Präparierschale sinken. Überführen Sie den Zellverband in eine vorbereitete 35-Millimeter-Kulturschale, indem Sie den Verband vorsichtig mit der Spitze einer leicht angeschmolzenen, sterilen Glas-Pasteurpipette aufsaugen.Dann langsam auf die Medieninsel in einer Kulturschale pipettieren, wobei darauf geachtet werden sollte, Luftblasen in der Pipette zu vermeiden. Wiederholen Sie die Isolation des PVC-Clusters des anderen Hemi-Ganglions und geben Sie diesen in eine separate Kulturschale. Hier ist eine Fotomikrografie des V-förmigen, dunkelorangefarbenen PVC-Zellclusters des rechten Pleural-Hemi-Ganglions.Um die BSC-Neurone zu präparieren, fixieren Sie zunächst das bukkale Ganglion mit der ventralen Seite nach oben, wobei Sie sorgfältig darauf achten, es zu schonen. Isolieren Sie anschließend die gewünschten BSC-Zellen mit zwei Pinzettenpaaren, wobei Sie eine feine Präparationsnadel als Sonde in einer der Pinzetten halten.Verwenden Sie anschließend die Sonde, um diese Zellen vom bukkalen Ganglion zu lösen. Lassen Sie dann die Zellen auf den Boden der Präparierschale absinken. Diese Fotomikrografie zeigt die Lage der glutamatergen Zellen des bukkalen Ganglions.Die BSC-Neuronen sind an ihrer dunkelorangefarbenen Färbung erkennbar. Die Isolierung von PVC- und BSC-Neuronen ergibt vier Kulturschalen mit Neuronenclustern: zwei Schalen mit BSC-Clustern und zwei Schalen mit PVC-Clustern.Entsorgen Sie den Rest der Ganglien und stellen Sie die 100-Millimeter-Dissektionschale beiseite, um die Zellklumpen zu dissociieren. Stellen Sie eine Kulturschale mit Zellen auf den Objekttisch des Mikroskops mit niedriger Vergrößerung und entfernen Sie die Abdeckung. Klopfen Sie vorsichtig auf den Boden der Kulturschale in der Nähe des Zellklumpens.Mit einem feinen Dissektionspinzettenstift, der mit einer Pinzette gehalten wird, können fünf bis zehn Flicks notwendig sein, um die Zellen vollständig zu dissociieren. Wiederholen Sie den Vorgang anschließend mit anderen Kulturschalen. Danach stellen Sie die Kulturschalen, die Medieninseln mit den dissociierten Zellen enthalten, in einen großen Behälter, der Luftzirkulation ermöglicht, beispielsweise eine runde, plastische Petrischale mit 150 mal 25 Millimeter.Und stellen Sie diese Schale in einen Inkubator, der auf 17 Grad Celsius eingestellt ist. Danach stellen Sie eine offene Schale mit Wasser als Feuchtigkeitsquelle in die Kammer und lassen Sie die Schalen über Nacht ungestört, damit die Zellen an der Polylysin-Beschichtung in der Mitte der Schale haften können. Am nächsten Tag überspülen Sie die Schalen vorsichtig mit 2,5 Milliliter künstlichem Meerwasser und Penicillin-Streptomycin, untersuchen und zählen Sie die Zellen mithilfe eines invertierten Zellkultur-Mikroskops.Hier sind lebende BSC-Neuronen nach einem Tag in Kultur; die BSC-Zellen sind im Allgemeinen größer als PVC-Zellen mit 40 Mikrometern. Gezeigt ist hier ein lebendes PVC-Neuron nach einer Woche in Kultur mit Auswuchs von Fortsätzen. Hier handelt es sich um einen erregenden Strom, der von Natriumionen getragen wird und als Reaktion auf einen Puls von AL-Glutamat auftritt, und hier um einen Strom als Reaktion auf D-Aspartat.Die durch NMDA aktivierten Ströme sind im Allgemeinen geringer in der Amplitude als die durch die anderen Agonisten aktivierten Ströme. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Neuronen während der Dissoziation nicht zu beschädigen. Ein Vorteil dieser Technik besteht darin, dass aus jedem Ganglion zwei Kulturen erzeugt werden, sodass eine als passende Kontrolle zur experimentellen Kultur verwendet werden kann.Mithilfe dieser Technik können Primärkulturen von Neuronen aus Plegia oder anderen marinen Wirbellosen erstellt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man sensorische Neuronen von Plegia durch enzymatische Verdauung der Ganglien und anschließende sorgfältige Dissoziation der gewünschten Zellen isoliert.

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen

Eine Technik ist für die Implantation vier...

Electrode Herstellung und Implantation in Aplysia californica Für Multi-Channel-Neuro-und Muskel-Recordings in Intact, Frei Behaving Tiere

Wir zeigen, wie Veränderungen in der intrazellulären freien Calciumkonzentration und synaptische Wirksamkeit gleichzeitig in einem Ganglion Herstellung...

Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel<em&gt; Aplysia</em

Wir beschreiben eine Technik, um extrazellulär erfassen und zu stimulieren von Nerven, Muskeln und einzelnen identifizierten...

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Vorbereitung zur Auslösung und Aufzeichnung Feeding Motor Programme mit Physiologische Bewegungen in<em&gt; Aplysia californica</em

Die Herstellung von akuten Hirnschnitten aus isolierten hippocampi, sowie die gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten und Neuronen...

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Kartierung synaptischer Verbindungen durch Sichern eines Gehirnschnitts, Positionieren von Pipetten, um Ganzzellkonfigurationen zu erreichen, und Stimulierung präsynaptischer Neuronen, um postsynaptische Reaktionen aufzuzeichnen, wodurch die neuronale Konnektivität aufgeklärt wird.

Gepaarte Patch-Clamp-Aufzeichnung der neuronalen Verbindungen in akuten Hirnschnitten

Bei Tieren mit großen identifizierten Neuronen...

Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

Die Aufzeichnung von Ca2+-Strömen an der präsynaptischen Freisetzungsgesichtsmembran ist der Schlüssel zu einem präzisen Verständnis des Ca2+-Eintritts und der Neurotransmitterfreisetzung. Wir präsentieren eine akute Dissoziation des Neunauge-Rückenmarks, die funktionelle isolierte retikulospinale Axone liefert, die eine Aufzeichnung direkt von der Freisetzungsgesichtsmembran einzelner präsynaptischer Endungen ermöglichen.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Patch-Clamp-Aufzeichnungen und gleichzeitige intrazelluläre Biocytin-Füllung von synaptisch gekoppelten Neuronen in akuten Hirnschnitten ermöglichen eine korrelierte Analyse ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Ziel dieses Protokolls ist es, die wesentlichen technischen Schritte der elektrophysiologischen Aufzeichnung von neuronalen Mikroschaltkreisen und deren anschließende morphologische Analyse zu beschreiben.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Erfahren Sie die Isolation sensorischer Neuronen von Aplysia californica für Patch-Clamp-Studien glutamaterger Ströme. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung spannungs- und agonistengesteuerter Ionenströme in kurzzeitiger Kultur.

Isolation von sensorischen Neuronen von

Weitere Videos entdecken