Name: Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung von subkutanen und intrahepatischen humanen Hepatozellulären Karzinom-Xenografts in immundefizienten Mäusen. Diese Methode ermöglicht realistische Tumorbiologie-Studien und Therapieuntersuchungen.

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Diese Arbeit wurde von einem kanadischen Institutes of Health Research Phase 1-Kliniker Scientist Award (AG) und einen Betriebskostenzuschuss aus dem Krebsforschungsgesellschaft (AG) unterstützt. Die Autoren danken Dr. John Dick für seine Unterstützung dieses Projektes.

Eine schematische Übersicht des Protokolls ist in Fig. 1 dargestellt. 1. Die Verarbeitung der Menschen HCC Proben Erhalten primären humanen HCC Proben mit schriftlicher Zustimmung des Patienten und mit Zustimmung der institutionellen Forschungsethik Bord. Diese Protokolle wurden an unserer Hochschule mit Zustimmung des University Health Network Research Ethics Board im Einklang mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für die menschliche Wohlfahrt durchgeführt. Sammeln Sie frische HCC Proben so schnell wie möglich nach der Operation einmal geeignete Proben für klinische Zwecke entnommen. Idealerweise sollte dies innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme des Gewebes aus dem Patienten zu nehmen. Wie in Fig. 2 dargestellt, ist eine Probe von mindestens 1 cm 3 aus der Peripherie des Tumors erhalten optimal, da der zentrale Teil des Tumors Nekrose sein.Tumoren, die keine Behandlung vor der Resektion, wie Bestrahlung, Chemotherapie oder Ablation erhalten haben, um die Möglichkeit, dass die Tumorzellen lebensfähig sind, zu maximieren, bevorzugt. Griff primären menschlichen Geweben in Übereinstimmung mit Standard-Protokolle für persönliche Schutz biologisches Material. Führen Sie alle Labor Manipulationen von Tumorgewebe und Zellpräparate in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank unter aseptischen Bedingungen. <ol><li> Legen Sie die neue HCC Probe in 10-25 ml Serum-freiem Dulbecco modifiziertem Eagle Medium / Ham &#39;s F12 bei 4 ° C und übertragen auf Eis ins Labor für die sofortige Verarbeitung und Herstellung von Gewebefragmente und / oder Zellen für xenografting in Mäuse. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie das Tumorprobe in einem 100 mm x 20 mm Petrischale oder andere geeignete sterile Arbeitsfläche. Teilen Sie die Tumorprobe in Fragmente von etwa 2-3 mm 3 mit einem chirurgischen Skalpell No.10. An dieser Stelle betrachten Snap-Gefrier-oder Formalin-Fixierung some Tumorfragmente für andere Versuche oder Analysen erforderlich. </li><li> Für xenografting von Tumorfragmenten, setzen einige der HCC-Fragmenten in einen oder mehrere Mikrozentrifugenröhrchen mit Matrigel genug, damit die Fragmente untergetaucht bleiben. Bewahren Sie diese Röhrchen auf Eis. </li><li> Zur Herstellung eines Tumorzellsuspension, verwenden die chirurgische Skalpell, um die verbleibenden HCC Gewebe Hackfleisch so viel wie möglich zu mischen und mit 5-10 ml DMEM-F12 in einem 50 ml konischen Röhrchen in Abhängigkeit vom Volumen des zerkleinerten Gewebes. </li><li> Hinzufügen Collagenase Typ IV und Dispase II in Endkonzentrationen von 200 Einheiten / ml bzw. 0,8 Einheiten / ml. Pipettieren Sie die Mischung auf und ab und mit einer 25 ml Pipette. </li><li> Abdichten des Rohres und Inkubation der Mischung aus Schritt 1.6 bei 37 ° C in einer 5% Kohlendioxid-Inkubator für 30-60 min in Abhängigkeit von der Weichheit des Tumorgewebes. Pipettieren Sie die Mischung nach oben und unten ein paar Mal alle 10 min, um die Fortschritte der enzymatischen Verdauung zu beurteilen. </li><li> Nach digestion abgeschlossen ist, passieren die Tumor-Lösung durch einen 100 um Zellsieb. Brei vorsichtig das verbleibende Gewebe auf der Zell Sieb mit einer 25-ml-Pipettenspitze, die maximale Anzahl von Tumorzellen ermöglichen, passieren. Sammeln Sie die angespannte Zellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren der Tumorzellsuspension bei 1.200 Upm für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand vorsichtig dekantieren. Je nach Größe des Pellets, fügen Sie 2-5 ml eiskaltem 1x roten Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer und sanft Pipette auf und ab, um das Pellet zu resuspendieren. Halten auf Eis für 5 min. </li><li> Hinzufügen DMEM-F12 auf ein Gesamtvolumen von 15 ml und zentrifugiert bei 1000 Upm für 5 Minuten bei 4 ° C zum Auswaschen des RBC-Lyse-Puffer. </li><li> Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren RBC freie Tumorzellpellet in DMEM-F12. </li><li> Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau-Ausschluss entweder manuell oder mit einem automatisierten Zellzähler. </li><li> Centrifuge Tumorzelle Aliquots, die das gewünschte number von Zellen für die Injektion, wie oben beschrieben, zu resuspendieren die resultierende Zellpellet in 30 ul eiskaltem Matrigel und auf Eis aufbewahren. </li></ol> Optional: Nach Schritt 1.11, führen wir routine humanen CD45 +-Zellen (Leukozyten) von der Haupttumorzellsuspension und / oder zu reinigen Gruppen von Tumorzellen unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder immunmagnetische Kügelchen. Detaillierte Protokolle für diese Verfahren sind von den Herstellern der entsprechenden Antikörper, Perlen und Durchflusszytometer beschrieben. Anmerkung: Die oben beschriebene Protokoll kann auch verwendet werden, um menschliche Tumor-Xenotransplantate von Mäusen, um serielle Transplantation durchführen geerntet verarbeiten, Ersetzen des Xenotransplantatgewebe für die primären humanen HCC-Gewebe in Schritt 1.1. In diesem Fall wird nach Schritt 1.11, führen wir routineInfiltrations murine Zellen aus der Zellsuspension unter Verwendung eines Antikörpers gegen Maus-Histokompatibilitäts-Antigen H2k. 2.Xenografting Führen Sie alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit Protokollen, die von der institutionellen Tierpflege Ausschuss genehmigt. Die hier beschriebenen Verfahren sind unter einem bestimmten Tier Verwenden Protokolls durch die University Health Network Animal Care Ausschuss nach und die Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Agenturen, Vorschriften und Richtlinien zugelassen ist abgeschlossen. Ausrüstung für die Lieferung von Lungen flüchtigen Anästhetika, um kleine Tiere sollten nach Standardverfahren der Tierhaltung und Forschungsinstitut genutzt werden. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffen unter aseptischen Bedingungen und sterile Instrumente in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank. Nutzen nicht-übergewichtigen Diabetiker schwerer kombinierter Immundefizienz (NOD / SCID) oder NOD / SCID / Interleukin-2-Rezeptor-gamma-Kette null (NSG) Stämme von Mäusen beiderlei Geschlechts bei 6-8 Wochen alt (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. DieseMäuse müssen untergebracht und gehalten werden, in einer Anlage, in der Lage, pathogenfreien Bedingungen für immundefizienten Tieren. Mäuse Vorbereitung für die Operation in einer Kammer, Zuführen von 5% (v / v) eingeatmet Isofluran in 1 l / min Sauerstoff. Aufrechterhaltung einer Narkose, bis ein Verlust der Hornhaut-und Zehenreflex im Tier (en). Für die subkutane xenografting, rasieren eine oder mehrere kleine Bereiche auf dem Rücken des Tieres (n) und reinigen die Haut mit 70% Ethanol. Für intrahepatischen xenografting, rasieren ventralen Thorax und Abdomen des Tieres (n) von den Achselhöhlen bis in die Leistengegend und reinigen die Haut mit 70% Ethanol. 2.1 Die subkutane Implantation von Tumorfragmenten <ol><li> Setzen Sie den narkotisierten Maus anfällig, die Aufrechterhaltung inhalative Isofluran Anästhesie (2% (v / v) in 1 l / min O 2) mit einem Mundstück. Bewerben Reiß Gel auf die Augen des Tieres von traumatischen Verletzungen zu schützen. </li><li> Sterilisieren Sie die Rücken rasierte Fläche (n) mit Betadinechirurgischen Scheuer von 70% Ethanol, gefolgt und schließlich mit Povidon-Jod-Lösung. </li><li> Machen Sie einen 5 mm Hautschnitt unter Verwendung von sterilen scharfen Schere. </li><li> Legen Sie eine stumpfe Schere geschlossen sanft in den subkutanen Raum und verbreiten vorsichtig, um eine Tasche groß genug, um einen Tumor zu entwickeln Fragment zubringen. </li><li> Legen Sie die Tumor-Fragment in Schritt 1.3 in das subkutane Tasche mit sterilen feinen Pinzette vorbereitet. </li><li> Schließen Sie den Hautschnitt mit Nähten oder Klammern. </li><li> Bereitzustellen postoperativen Versorgung der Maus, wie nachstehend beschrieben. </li></ol> 2.2 Die subkutane Injektion von Tumorzellen <ol><li> Bereiten Sie das Tier wie in den Schritten 2.1.1 und 2.1.2 beschrieben. </li><li> Laden der Suspension der Tumorzellen in Matrigel in Schritt 1.13 in einer Insulinspritze mit einer 29 G 1/2 in Nadel hergestellt. </li><li> Legen Sie die Nadel in den subkutanen Raum und entladen Sie den Inhalt der Spritze. Vorschieben der Nadel mehrere Millimeter entlang der subkutanen Ebene weg from die Haut Einstichstelle verhindert eine Leckage des Tumorzellsuspension aus der Punktionsstelle nach dem Herausziehen der Nadel. </li><li> Bereitzustellen postoperativen Versorgung der Maus, wie nachstehend beschrieben. </li></ol> 2.3 Intrahepatische Implantation von Tumorfragmenten <ol><li> Verwendung einer 27 G 1/2 in Nadel auf eine 1 ml Spritze verabreichen 350 ul steriler physiologischer Kochsalzlösung subkutan in den Rücken des Halses des betäubten Tieres für intraoperative Flüssigkeitsverluste auszugleichen. Für Analgesie zu verabreichen 350 ul steriler normaler Salzlösung, enthaltend Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan in die Flanke der Tiere unter Verwendung einer 27 G Nadel 1/2-in an einer 1 ml-Spritze. </li><li> Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf einem vorgewärmten Pad mit Nase und Mund innerhalb des Mundstücks positioniert, um Wartung zu liefern inhalative Isofluran Anästhesie (2% (v / v) in 1 l / min O 2). </li><li> Verlängern Sie die Gliedmaßen und sichern Sie sie mit Klebeband an der Bedienoberfläche, um die Exposition zu optimierendas ventrale Abdomen und Thorax. </li><li> Führen Sie das Verfahren unter einem Vergrößerungslampe, um die Visualisierung zu optimieren. </li><li> Sterilisieren der rasierten Haut auf der ventralen Abdomen und des Thorax mit Betadine chirurgischen Scheuer gefolgt von 70% igem Ethanol und schließlich mit Povidon-Jod-Lösung. </li><li> Mit einer sterilen scharfen Schere, einen Quer bilateralen subkostalen Hautschnitt und teilen die Muskelschichten, um die Bauchhöhle geben, um eine ausreichende Belichtung der gesamten Leber zu ermöglichen. </li><li> Legen Sie einen Stich in der Haut über dem Schwertfortsatz und sichern Sie es mit dem Mundstück mit Klebeband, um eine bessere Belichtung der Leber und der umgebenden Strukturen zu ermöglichen. </li><li> Verwenden Sie zwei Wattestäbchen neben und hinter der Leber, um es zu stabilisieren. </li><li> Einen Einschnitt von 3 mm in der Länge und Tiefe auf der Oberfläche der Leber unter Verwendung einer sterilen Skalpellklinge Nr. 10. </li><li> Unmittelbar gelten Surgicel und sanften Druck auf der Einschnittstelle zur Blutstillung zu erreichen, nach 60-90 sec entfernenund fahren nur, wenn vollständige Blutstillung erreicht worden ist. </li><li> Legen Sie eine Tumor Fragment Schritt 1.3 in die Leber Schnitt mit sterilen feinen Pinzette oder mit einem 18-G-Nadel. </li><li> Eine kleine Stück Surgicel über die Leber Einschnitt, um eine Verschiebung des Tumors Fragment zu verhindern und sicherzustellen Fortsetzung Blutstillung. </li><li> Schließen Sie den Schnitt mit Nähten oder Klammern. </li><li> Geben postoperative Betreuung, wie unten beschrieben </li></ol> 2.4 Intrahepatische Implantation von Tumorzellen durch direkte Injektion in die Leber <ol><li> Bereiten Sie die Maus wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.7 oben beschrieben. </li><li> Laden der Tumorzellsuspension (hergestellt in Schritt 1.13) in einer Insulinspritze mit einer 29 G 1/2 in der Nadel. </li><li> Mit Hilfe eines Baumwollspitze Applikator stabilisiert die Leber, legen Sie die Insulin-Spritzennadel in die Leber und vorab die Spitze einige Millimeter über der Einstichstelle entlang einer subkapsuläre-Ebene. </li><li> Vorsichtig den Inhalt der Spritze und t entladenHenne entfernen Sie die Nadel aus der Leber. </li><li> Platz Surgicel über der Einstichstelle und sanften Druck mit einem Wattestäbchen, um ein Auslaufen der Tumorzellsuspension zu verhindern und die komplette Blutstillung zu erreichen. </li><li> Schließen Sie den Schnitt mit Nähten oder Klammern und bieten Nachsorge wie unten beschrieben. </li></ol> 2,5 Intrahepatische Xenografting von Tumorzellen über Injektion in die Milz <ol><li> Bereiten Sie die Maus wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.5 oben beschrieben. </li><li> Mit einer sterilen scharfen Schere, stellen eine 1 cm links subkostalen Einschnitt in die Bauchhöhle gelangen. </li><li> Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Magen kranial und zur rechten Seite des Tieres, um die Milz aussetzen reflektieren. </li><li> Durch den Umgang mit den umliegenden Fettgewebe mit sterilen feinen atraumatischen Pinzette, liefern die Milz in den Schnitt und setzen Sie ein Wattestäbchen hinter der Milz, um es zu stabilisieren. </li><li> Mit 5-0 Seidenfaden, Orteine lose Vor-gebundenen Knoten rund um die Milz über dem unteren Pol. </li><li> Laden der Tumorzellsuspension (hergestellt in Schritt 1.13) in einer Insulinspritze mit einer 29 G 1/2 in der Nadel. </li><li> Legen Sie die Insulin-Spritzennadel in den unteren Pol der Milz und voran es über das Niveau des Vor-lose gebundenen Knoten. </li><li> Langsam Entladen der Inhalt der Spritze, entfernen Sie die Nadel aus der Milz, und ziehen Sie die Knoten, um ein Auslaufen der injizierten Tumorzellsuspension zu verhindern. </li><li> Ersetzen Sie die Milz in die Bauchhöhle. </li><li> Schließen Sie den Schnitt mit Nähten oder Klammern und bieten Nachsorge wie unten beschrieben. </li></ol> 2.6 Teilhepatektomie zu Intrahepatische Verpflanzung von menschlichen Tumorgewebe Erleichterung <ol><li> Bereiten Sie die Maus wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.7 beschrieben. </li><li> Mit sterilen scharfen Schere, teilen Sie die Lig. falciforme zur mittleren Leberlappen angebracht. </li><li> Mit einem Wattestäbchen, mobilisierender linke Leberlappen und die Position einer losen Pre-gebundenen Knoten von 5-0 Seidenfaden um den linken Leberlappen. Schieben Sie den lockeren Knoten so nah wie möglich in Richtung der bilio-Gefäßstiel des linken Lappens und ziehen Sie den Knoten. </li><li> Verbrauchsteuern die linke Lappen distal der Ligatur mit sterilen Schere, so dass eine kleine Baumstumpf, um ein Rutschen des Knotens und die anschließende Blutung zu verhindern. </li><li> Verwendung einer ähnlichen Technik, zu ligieren und zu resezieren die Mehrheit der Mittellappen der Leber, die Gallenblase zu vermeiden. </li><li> Verwenden Surgicel und sanften Druck mit einem Wattestäbchen an den Schnittflächen des Leberparenchyms, komplette Blutstillung zu erreichen. </li><li> Für intrahepatischen xenografting Fragment eines Tumors oder Tumorzellen, fahren Sie mit Schritte 2.3.8 bis 2.3.11 oder 2.4.2 auf 2.4.5 wie oben beschrieben. </li><li> Für intrahepatischen xenografting von Tumorzellen über Milz-Injektion, nutzen Wattestäbchen sanft spiegeln den Magen kranial und zur rechten Seite des Tieres, exposing der Milz. Fahren Sie mit Schritt 2.5.4 bis 2.5.9 wie oben beschrieben. </li><li> Schließen Sie den Schnitt mit Nähten oder Klammern und bieten Nachsorge wie unten beschrieben. </li></ol> 2.7 Postoperative Behandlung <ol><li> Entfernen Sie die Maus von der Inhalationsanästhesie Mundstück. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einem Käfig unter einer Wärmelampe für ca. 20 Minuten, bis aus der Narkose erholt und voll mobilisiert. </li><li> Wiederholen Sie die Buprenorphin-Dosis alle 8 bis 12 Stunden während der ersten 2-3 Tage nach der Operation. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir haben eine Reihe von Techniken beschrieben, um subkutane und intrahepatische menschlichen HCC-Xenotransplantaten in immundefizienten Mäusen, die mit einer Vielzahl von experimentellen Fragen und Assays angewandt werden können herzustellen. Während subkutane Xenotransplantate wurden allgemein verwendet, um verschiedene Aspekte der Biologie HCC zu untersuchen, werden intra-Xenotransplantaten in der Literatur kaum beschrieben. Darüber hinaus haben die meisten Studien, die den Einsatz von Fremdtransplantaten diese von e...

Das Leberzellkarzinom (HCC) ist die fünfthäufigste Krebserkrankung weltweit und der am schnellsten zunehmenden Krebstodesursache in Nordamerika. Die häufigste Risikofaktor für HCC ist Leberzirrhose, am häufigsten auftretenden durch chronische Virushepatitis, Alkoholmissbrauch, Autoimmunerkrankungen oder erbliche Stoffwechselstörungen ein. Trotz der schweren Krankheitslast durch HCC auf Populationen weltweit verhängt wird die Pathophysiologie der HCC relativ schlecht im Vergleich zu anderen häufigen Krebsarten wie Darm-, Brust-, oder Prostatakrebs zu verstehen. Beispielsweise spezifische molekulare und zelluläre Ereignisse Antriebs Tumorigenese bleiben klar definiert werden 2. Wie die meisten anderen soliden epithelialen Tumoren wurden genomische Ansätze Heterogenität der Aberrationen mit HCC 3 zugeordnet enthüllt. Eine Reihe von Studien haben ungeordneten Aktivität einer Vielzahl von Signalwegen im Zellproliferation beteiligt sur ergabÜberleben, Differenzierung und Angiogenese 4. Darüber hinaus bleibt die Rolle der Krebsstammzellen in HCC Pathobiologie geklärt werden 5. Mit einer begrenzten Verständnis der Pathophysiologie HCC hat das Rüstzeug von wirksamen Therapien für HCC blieb auch relativ begrenzt. Frühstadium Patienten mit Tumoren auf die Leber beschränkt sind kurative Therapie mit Tumorablation oder chirurgische Resektion, wenn Wiederholung ist üblich. Bei Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung, Chemotherapie und Bestrahlung sind von begrenzter Wirksamkeit und sind vor allem für Krankheitskontrolle mit palliativer Absicht 6 verwendet. Hohe Qualität in-vivo-Versuchsmodellen menschlicher HCC damit eine wertvolle Plattform für die dringend benötigte Grundlagenforschung in der Pathophysiologie des menschlichen HCC sowie zur Bewertung von Therapien. Verglichen mit der Verwendung von Zell-Linien oder hoch definiert Mausmodellen Xenotransplantate primary menschlichen Tumoren in immungeschwächten Mäusen haben als wertvolle Instrumente für solche Studien entstanden, da sie in der Lage, rekapituliert die menschliche Krankheit mit hoher Wiedergabetreue, während auch die Erfassung der Heterogenität, die innerhalb und zwischen verschiedenen Patienten 7,8 vorhanden ist, sind. Zu diesem Zweck haben wir eine Vielzahl von Methoden, um menschliche HCC Xenografts in immundefizienten Mäusen zu etablieren entwickelt. Während die Mehrheit der veröffentlichten Studien mit HCC Xenografts beschreiben die Verwendung von etablierten menschlichen HCC Zelllinien zu diesem Zweck haben wir uns auf die Optimierung unserer Tests zur Heterotransplantate aus primären HCC Proben sofort nach der chirurgischen Resektion von Patienten erhalten generieren konzentriert. Verschiedene Techniken können xenografting für verschiedene Forschungsanwendungen erforderlich. Zum Beispiel sind subkutane Xenografts aus Tumor-Fragmente erzeugt schnell erzeugt werden, leicht zu überwachen, und kann mehr für die lokale Verwaltung neuartiger Therapeutika mit bequemen angemessen seinÜberwachung von Tumorantwort. Intrahepatischen Xenotransplantate kann für Studien in Bezug auf die Rolle der Lebermikro in HCC Biologie relevanter. Xenotransplantate aus Tumorzellsuspensionen erzeugt sind für die Identifizierung und Charakterisierung von Tumor-initiierende Zellen-Untergruppen oder für Experimente in vitro-Manipulationen von Tumorzellen vor der Xenotransplantation erfordern erforderlich. Damit haben wir entwickelt und validiert die folgenden Protokolle zur subkutanen oder intra-Heterotransplantate aus Zellsuspensionen oder Tumorfragmente aus primären humanen HCC Proben abgeleitet etablieren.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#8217; s Mod. Eagle Medium/Ham&#8217; s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) </td><td>WISENT Bioproducts</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td> Kollagenase TypIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td>Stemcell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td> Matrigel Matrix</td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td> 10 % gepufferte Formalinlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % Kochsalzlösung Lösung (NaCl), steril</td><td>Hausmarke</td><td>1011-L8001</td><td></td></tr><tr><td>Betadine chirurgisches Peeling</td><td>Purdue Pharma</td><td>NPN 00158313</td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphin (Temegesic) NR 0,3 mg/ml</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isofluran USP, 99,9 %, Anästhetikum zur Inhalation</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>Tränen-Gel </td><td>Novartis Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schnellschnittmasse </td><td>VWR</td><td>95057-838</td><td></td></tr><tr><td> Cryomold, Tissue -Tek </td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td> Präzisions-Gleitnadel 18G 1 &#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td> Präzisions-Gleitnadel 27G &#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td> Insulinspritze, 3/10 cc U-100, 29G&#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Klinge Nr. 10</td><td>Feder-Sicherheitsrasierer Co.</td><td>08-916-5A</td><td></td></tr><tr><td> #5-0 Chirurgisches Nahtmaterial aus weicher Seide, 3/8" Nadel mit konischer Spitze </td><td>Syneture</td><td>VS-880</td><td></td></tr><tr><td> Transpore chirurgisches Band</td><td>3M Gesundheitswesen</td><td>1577-1</td><td></td></tr><tr><td> Baumwollapplikator </td><td>Medpro</td><td>018-425</td><td></td></tr><tr><td> Surgicel, oxidierte regenerierte Zellulose</td><td>Ethicon</td><td>1951</td><td></td></tr><tr><td> Zellsieb 100 &#956; m Nylon</td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td> Vergrößerungsbeleuchtung mit mobiler Basis</td><td>Benson medical Industries Inc.</td><td>Modell: RLM-CLT-120V</td><td></td></tr><tr><td>Petridish steril 100x20 mm </td><td>Sarstedt</td><td>821474</td><td></td></tr><tr><td> Gewebezange, 1x2 Zähne, 4-1/2"</td> <td>Almedic</td><td>A10-302</td><td></td></tr><tr><td> Adson Abrichtzange 4-3/4"</td> <td>Almedic</td><td>A10-220</td><td></td></tr><tr><td> Augenzange, gezahnt, gerade, 4" </td><td>Almedic</td><td>A19-560</td><td></td></tr><tr><td> Hartman Blutoretizange, gebogen, 3-1/2" </td><td>Almedic</td><td>A12-142</td><td></td></tr><tr><td> Irisschere, gebogen, 4-1/4"</td> <td>Almedic</td><td>A8-690</td><td></td></tr><tr><td> Irischere, gerade, 4-1/2" </td><td>Almedic</td><td>A8-684</td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegan Nadeltreiber, 5-1/2" </td><td>Almedic</td><td>A17-228</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung von subkutanen und intrahepatische menschenleberzellkarzinom xenografts in immundefizienten mäusen

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In-vivo-Versuchsmodellen des hepatozellulären Karzinoms (HCC), der die menschliche Krankheit rekapitulieren eine wertvolle Plattform für die Erforschung der Krankheit Pathophysiologie und für die präklinische Evaluierung neuer Therapien. Wir stellen eine Vielzahl von Methoden zur subkutanen oder orthotopen HCC menschlichen Xenotransplantaten in immundefizienten Mäusen, die in einer Vielzahl von Forschungsanwendungen verwendet werden, erzeugen könnte. Mit einem Fokus auf der Verwendung von Primärtumorgewebe von Patienten, die sich chirurgischen Resektion als Ausgangspunkt beschreiben wir die Herstellung von Zellsuspensionen oder Tumorfragmente für xenografting. Wir beschreiben spezielle Techniken, um diese Gewebe i) subkutane Xenotransplantat oder ii) intrahepatisch, entweder durch direkte Implantation von Tumorzellen oder Fragmente in der Leber, oder indirekt durch Injektion von Zellen in der Milz der Maus. Wir beschreiben auch die Verwendung von partiellen Resektion des nativen Mausleber bei der xenografting als Strategie zurinduzieren einen Zustand der aktiven Leberregeneration in der Empfängermaus, die die intra-Transplantation von primären humanen Tumorzellen erleichtern können. Die erwarteten Ergebnisse dieser Techniken dargestellt. Die beschriebenen Protokolle wurden mit primären humanen HCC Proben und Heterotransplantate, die in der Regel weniger robust durchzuführen als die etablierten menschlichen HCC Zelllinien, die weit verbreitet sind und in der Literatur häufig zitiert validiert. Im Vergleich zu Zelllinien diskutieren wir Faktoren, die auf die relativ geringe Chance primären HCC Anwachsen der Xenotransplantation Modelle beitragen und kommentieren technischen Fragen, die die Kinetik der Xenograft Wachstum beeinflussen können. Wir empfehlen auch Methoden, die eingesetzt werden, sollten sicherstellen, dass Heterotransplantate erhalten genau ähneln Mutter HCC Gewebe werden.

Fig. 3 zeigt das typische Aussehen einer subkutanen humanen HCC Xenotransplantat und die entsprechende histologische Erscheinung des Tumors. Die Entwicklung und das Wachstum der subkutanen Heterotransplantate können leicht durch tägliche Prüfung der Empfängermäuse überwacht werden. Das Zeitintervall zwischen xenografting und die Entwicklung eines Tumors kann stark in Abhängigkeit von der Art des Gewebes (Fragment gegen Tumor-Zellsuspension), Gewebequelle (primäre Patientenprobe, agierte Xenograft oder Z...

Menschen Tumorxenotransplantaten in immundefizienten Mäusen sind wertvolle Werkzeuge, um Krebsbiologie zu studieren. Spezifische Protokolle subkutane und intra-Heterotransplantate aus menschlichen Leberzellkarzinom-Zellen oder Tumorfragmente zu erzeugen, werden beschrieben. Leberregeneration nach partieller Hepatektomie in Empfängermäuse induziert wird, als eine Strategie, um intra-Transplantation zu erleichtern präsentiert.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, subkutane oder intrahepatische humane hepatzelluläre Karzinom- oder HCC-Xenotransplantate in immundefizienten Mäusen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Tumorfragmente oder eine Einzelzell-Suspension aus einer frischen humanen HCC-Gewebeprobe für die Implantation in die Mäuse vorbereitet werden, um subkutane Xenotransplantate zu erhalten. Der nächste Schritt besteht darin, Tumorzellen zu injizieren oder Tumorfragmente in eine subkutane dorsale Tasche zu implantieren, um intrahepatische Xenotransplantate zu erzeugen.Im nächsten Schritt werden Tumorzellen in die Milz oder Leber injiziert oder Tumorfragmente direkt in die Leber implantiert. Die Tiere werden über mehrere Wochen beobachtet, bis sich Tumore entwickeln. Letztendlich können die humanen HCC-Xenotransplantate verwendet werden, um zahlreiche Aspekte der Tumorbiologie zu untersuchen, einschließlich der Mechanismen der Tumorentstehung und der Reaktionen auf neuartige Therapien.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie beispielsweise der ausschließlichen Verwendung von Zelllinien oder subkutanen Xenotransplantaten, liegt darin, dass mit dieser Methode primäre humane Lebertumorgewebeproben und patientenabgeleitete intrahepatische Xenotransplantate ein realistischeres biologisches Modell des humanen hepatzellulären Karzinoms bieten. Die Durchführung der Prozedur demonstriert Sharif Ahmed, ein Postdoktorand aus meinem Labor. Für die subkutane Implantation der Tumorfragmente: Stellen Sie zunächst die anästhetisierte Maus in Bauchlage, wobei die inhalative Isofluran-Anästhesie über eine Schnauzenmaske aufrechterhalten wird.Tragen Sie Tränen-Gel auf, um die Augen des Tieres vor Verletzungen zu schützen, und desinfizieren Sie anschließend den rasierten dorsalen Bereich mit Betadine-Hautantiseptikum, gefolgt von 70 %igem Ethanol und zuletzt von Povidon-Iod-Lösung. Verwenden Sie danach eine scharfe Schere, um einen fünf Millimeter langen Schnitt in die Haut zu machen. Führen Sie die Spitze eines geschlossenen stumpfen Schere in den subkutanen Raum ein und öffnen Sie die Schere vorsichtig, um eine Tasche zu schaffen, die groß genug ist, um ein Tumorfragment aufzunehmen.Verwenden Sie dann eine feine Pinzette, um das Tumorfragment in die subkutane Tasche einzubringen, und verschließen Sie die Inzision mit Clips, nachdem das Fragment platziert wurde, kurz vor der Injektion einer Lotus-Suspension von Tumorzellen in Matrigel in eine mit einer 29-Gauge-½-Zoll-Nadel versehene Insulinspritze. Führen Sie anschließend die Nadel in den subkutanen Raum eines anästhesierten und rasierten Tieres ein, bewegen Sie die Nadel mehrere Millimeter entlang der subkutanen Ebene vom Einstichpunkt weg und injizieren Sie den Inhalt der Spritze, um das Tier auf die Transplantation von menschlichem Tumorgewebe vorzubereiten. Beginnen Sie hierzu, indem Sie 350 µL sterile Kochsalzlösung mit einer 27-Gauge-½-Zoll-Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze subkutan in den Nackenrücken eines anästhesierten Tieres spritzen, um intraoperative Flüssigkeitsverluste vorbeugend auszugleichen.Danach, nachdem die Maus in Rückenlage auf einer vorgewärmten Unterlage anästhesiert wurde, strecken Sie die Gliedmaßen des Tieres aus und befestigen Sie diese mit Klebeband an der Operationsfläche, um die Exposition des ventralen Abdomens und Thorax zu optimieren. Positionieren Sie eine Vergrößerungslampe über dem Tier und desinfizieren Sie die rasierte Haut am ventralen Abdomen und Thorax, wie zuvor gezeigt. Machen Sie mit einer scharfen Schere einen transversalen, beidseitigen subkostalen Hautschnitt und trennen Sie anschließend die Muskelschichten, um die gesamte Leber freizulegen.Setzen Sie einen Faden in die Haut oberhalb des Xiphoidfortsatzes und befestigen Sie ihn mit Klebeband am Mundstück, um eine bessere Sicht auf die Leber und die umgebenden Strukturen zu ermöglichen. Stabilisieren Sie anschließend die Leber mit zwei Wattestäbchen, die neben und hinter dem Gewebe positioniert sind. Trennen Sie dann mit einer scharfen Schere das falciforme Ligament, das mit dem mittleren Leberlappen verbunden ist.Mobilisieren Sie den linken Leberlappen mit einem Wattestäbchen und legen Sie eine lose vorgebundene Schlinge aus einer 5-0-Seidennaht um den Lappen. Ziehen Sie die Schlinge so nah wie möglich an das Hilusgefä&szlig;b&uuml;ndel des linken Lappens heran und ziehen Sie sie dann fest. Schneiden Sie anschlie&szlig;end mit einer Schere den dem Ligatur entfernt liegenden Teil des Lappens ab, wobei ein kleiner Stumpf verbleibt, um ein Verrutschen der Nahtschlinge und nachfolgende Blutung zu verhindern.Mittels einer ähnlichen Technik werden der Großteil des medianen Leberlappens ligiert und reseziert; anschließend wird mit Surgicel und sanftem Druck mittels eines Wattestäbchens entlang der Schnittflächen des Leberparenchyms eine vollständige Hämostase erreicht. Abschließend erfolgt das intrahepatische Xenotransplantat eines Tumorfragments oder von Tumorzellen beziehungsweise die intrahepatische Transplantation von Tumorzellen mittels Injektion in die Milz, wie in den folgenden Abschnitten dargestellt. Für die intrahepatische Implantation von Tumorfragmenten wird zunächst mit einer Skalpellklinge Nr. 10 ein drei Millimeter langer und tiefer Einschnitt an der Oberfläche der Leber vorgenommen.Danach sofort Surgicel und leichten Druck auf die Schnittstelle für 60 bis 90 Sekunden anwenden, um die Blutstillung zu erreichen. Sobald die vollständige Blutstillung erreicht ist, mit einer feinen Pinzette ein Tumorfragment in den Leberschnitt einbringen. Anschließend ein kleines Stück Surgicel über den Schnitt legen, um die hepatische Implantation von Tumorzellen durch direkte Injektion in die Leber zu ermöglichen. Eine mit Tumorzellsuspension beladene Insulinspritze in die freigelegte Leber einführen und die Nadelspitze einige Millimeter jenseits der Einstichstelle entlang der subkapsulären Ebene vorrücken.Entleeren Sie vorsichtig den Inhalt der Spritze und ziehen Sie die Nadel aus der Leber heraus. Anschließend wird der Punktionsstelle mit Surgicel abgedeckt und leichter Druck mit einem Wattestäbchen ausgeübt, um ein Austreten der Tumorzellsuspension zu verhindern und eine vollständige Blutstillung zu erreichen, um intrahepatische Xenotransplantate von Tumorzellen durch Injektion in die Milz vorzunehmen. Positionieren Sie die Mäuse in Rückenlagerung auf der rechten Seite und verwenden Sie eine scharfe Schere, um einen einen Zentimeter langen, linken subkostalen Schnitt zu setzen, um in die Bauchhöhle einzudringen.Verwenden Sie dann einen Wattestäbchen, um den Magen kranial in die rechte Seite des Tieres zu verschieben. Um die Milz freizulegen, behandeln Sie das umgebende Fettgewebe mit einer feinen atraumatischen Pinzette, führen Sie die Milz in den Schnitt ein und platzieren Sie einen Wattestäbchen hinter der Milz, um das Gewebe zu stabilisieren. Bringen Sie nun mit einer 5-0-Seidennaht einen lockeren vorbereitenden Knoten um die Milz oberhalb des unteren Pols an.Führen Sie eine mit Tumorzellsuspension beladene Insulinspritze mit Nadel in den unteren Pol der Milz ein und führen Sie sie weiter, bis sie die Ebene des lockeren Knotens überschritten hat. Entladen Sie dann langsam den Inhalt der Spritze, ziehen Sie die Nadel aus der Milz heraus und ziehen Sie den Knoten fest, um ein Austreten der injizierten Zellsuspension zu verhindern. Schließlich bringen Sie die Milz wieder in die Bauchhöhle zurück.In diesem Bild ist eine Leberresektionsprobe von einem Patienten mit HCC dargestellt, der keine adjuvante Therapie gegen den Tumor erhalten hatte. Der weiße Rahmen markiert einen vitalen Tumoranteil nahe der Peripherie, der für ein Xenotransplantat gewonnen wurde. Die Entwicklung und das Wachstum subkutaner Xenotransplantate können durch tägliche Untersuchung der empfängenden Mäuse leicht überwacht werden.Beispielsweise wird das typische Erscheinungsbild eines subkutanen humanen HCC-Xenotransplantats gezeigt, das sich visuell von dem umgebenden Gewebe unterscheidet, sowie das entsprechende histopathologische Erscheinungsbild des Tumors. Die Histologie des Tumors zeigt die typischen Merkmale eines HCC, einschließlich hepatozytenähnlicher Zellen mit nukleärer AIA und hohem Kern-Cytoplasma-Verhältnis, fehlenden Portalspuren und verzerrten Trabekeln mit erhöhter Dicke der hepatocellulären Platten. Auf diesen Bildern sind die typischen Erscheinungsformen eines intrahepatischen humanen HCC-Xenotransplantats zu sehen, das entweder durch direkte Implantation von Tumorgewebe in die Leber oder durch Injektion von Tumorzellen in die Milz erzeugt wurde, wobei die intraparenchymalen Tumoren in jedem Bild durch den schwarzen Pfeil markiert sind.Dieser histologische Schnitt durch den Rand eines intrahepatischen XOG-Gewebes zeigt die typischen Merkmale eines humanen HCC sowie das angrenzende normale Mauslebergewebe. Die Tabelle fasst die Engraftment-Raten von Tumoren zusammen, die nach der Implantation primärer humaner hepatzellulärer Karzinomgewebe in immundefiziente Mäuse erzielt wurden. Unter Verwendung der zuvor gezeigten verschiedenen Techniken für jede Implantationsmethode spiegelt der Nenner der Tumor-take-Rate eine einzigartige humane HCC-Probe wider.Diese Daten zeigen, dass für primäre humane HCC-Gewebeproben die subkutane Einpflanzungsrate geringer ist als die Rate der intrahepatischen Einpflanzung, die durch intrasplenisches Injizieren von Tumorzellen oder durch implantieren von intrahepatischen Tumorgewebefragmenten erreicht wird, und dass eine partielle Hepatektomie die intrahepatische Einpflanzung zu verbessern scheint. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sterile Technik anzuwenden und eine vollständige Blutstillung zu erzielen, da kleine sechs bis acht Wochen alte immundefiziente Mäuse anfällig für Infektionen sind und möglicherweise nicht einmal eine geringe postoperative Blutung überleben.

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Research

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JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt einen Assay zur Generierung eines humanisierten Xenotransplantat-Mausmodells. Einer immungeschwächten Maus wird Cyclophosphamid injiziert, um eine Depletion der Immunzellen zu verursachen. Vom Patienten stammende Tumorzellen, die mit humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in einem Hydrogel vermischt sind, werden subkutan in die Maus injiziert, wodurch ein Tumor mit infiltrierenden T-Zellen entsteht.

Eine Technik zur Generierung eines humanen PBMC-transplantierten humanisierten Xenotransplantat-Mausmodells

Die Metastasierung von Krebs ist die Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle. Wir bieten eine eingehende Beschreibung der unser Überleben Chirurgie Methodik für die Festlegung eines "Patienten-like" orthotopen syngenen Mausmodellsystem zur Untersuchung der Mechanismen der Metastasierung bei soliden Organtumoren.

Ein &quot;Patient-Like&quot; Orthotope Syngene Maus-Modell der Leberzellkarzinom Metastasen

Hier präsentieren wir ein neuartiges humanisiertes Mauslebermodell, das in Alb-Toxin-Rezeptor-vermittelten Zell-Knockout-Mäusen (TRECK)/SCID-Mäusen nach der Transplantation von unreifen und expandierbaren humanen Leberstammzellen erzeugt wurde.

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

Wir haben ein Protokoll für die Durchführung von teilweise Hepatektomie (PHx) und Zelltransplantation über Milz in NOD beschrieben. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscidj) Mäuse. In diesem Protokoll wird ein Einschnitt gemacht, zu entlarven und den linken Leberlappen folgte ein weiterer Einschnitt für die intrasplenic Transplantation von Zellen zu resezieren.

Intrasplenic Transplantation von Leberzellen nach teilweiser Hepatektomie in NOD. SCID-Mäuse

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine menschliche Leber chimärer Maus-Modell der Familiäre Hypercholesterinämie mit menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten zu generieren. Dies ist ein wertvolles Modell zum Testen neuer Therapien für Hypercholesterinämie.

Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode, um humanisierte Mäuse mit menschlichem Immunsystem und Leberzellen zu etablieren. Dual rekonstituierte immundefizienten Mäuse, die durch intrasplenische Injektion von humanen Hepatozyten und CD34+ hämatopoetischen Stammzellen erreicht werden, sind anfällig für eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 und rekapitulieren Leberschäden, wie in HIV-infizierte Patienten.

Etablierung des dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells für HIV-assoziierte Leberpathogenese

Hier beschreiben wir die Entwicklung eines klinisch relevanten murinen Modells von Leberkrebs, das die typischen Immunmerkmale von hepatozellulärem Krebs (HCC) rekapituliert.

Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht

Orthotopische humane Leber metastasierenuvealmelanom xenograft MausModelle wurden mit chirurgischen orthotopischen Implantationstechniken mit Patienten-abgeleiteten Tumorstück und Nadelinjektionstechniken mit kultivierten menschlichen uvealen Melanom-Zelllinien erstellt.

Generierung einer Leber orthotopischen Human Enuveal Melanom Xenograft Plattform bei immundefizienten Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung orthotoper hepatozellulärer Karzinom-Xenotransplantate mit und ohne Leberarterienligatur vor und führen eine nicht-invasive Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung der Tumorhypoxie unter Verwendung von [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) und [18 F]Fluordesoxyglucose ([18F]FDG) durch.

Nicht-invasive PET/MR-Bildgebung in einem orthotopen Mausmodell des hepatozellulären Karzinoms

Organoide, die aus Patiententumoren erzeugt werden, werden orthotopisch in die Leber der Maus injiziert. Die Resektion von nicht-tumorösem Lebergewebe führt zu einer regenerativen Umgebung im Lebergewebe, in dem sich der Tumor befindet.

Ein von Patienten mit hepatozellulärem Krebs abgeleitetes Organoid-Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Einflusses der Leberregeneration auf das Tumorwachstum

Erfahren Sie die Erzeugung von subkutanen und intrahepatischen humanen Hepatozellulären Karzinom-Xenografts in immundefizienten Mäusen. Diese Methode ermöglicht realistische Tumorbiologie-Studien und Therapieuntersuchungen.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

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