Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Anzahl und Beugungsqualität von Proteinkristallen zu verbessern, die aus einem Kristallisations-Screening-Experiment gewonnen wurden. Zu diesem Zweck wird ein kristallines oder gefälltes Material aus einem bestehenden Proteinkristallisations-Screening-Experiment identifiziert, das unter Verwendung eines Zielproteins von Interesse etabliert wurde, das kristalline oder gefällte Material wird geerntet und dann zur Erzeugung eines Kristallsaatguts verwendet. Als nächstes wird eine Reihe von Kristallisationsbildschirmen eingerichtet, die sowohl das Zielprotein von Interesse als auch die Kristallkeime enthalten.

Schließlich werden die ausgesäten Kristallisationsbildschirme auf Kristallbildung überwacht und alle neuen Proteinkristalle charakterisiert. Letztendlich kann die Anwendung dieses Verfahrens zu einer Erhöhung der Anzahl, Größe und Beugungsqualität von Proteinkristallen führen, die aus Kristallisations-Screening-Experimenten gewonnen werden. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, z. B. der traditionellen Mikroaussaat oder der Makroaussaat, bestehen darin, dass sie schnell durchgeführt werden kann, hochgradig skalierbar ist und deutlich mehr Kristallisationsraum beprobt als andere Aussaatverfahren.

Ein weiterer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie keine Verwendung von hochwertigem kristallinem Ausgangsmaterial für die Herstellung von Saatgut erfordert. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da bei der Kristallentnahme und -manipulation ein erhebliches Maß an manueller Geschicklichkeit erforderlich ist. Visuelle Demonstration der kritischen Methode, da das Mikroseeding der zufälligen Matrix erheblich von anderen Kristallseeding-Methoden abweicht.

Die Feinheiten dieser Methode sind der Schlüssel zum Erfolg, und einige davon sind schwierig in Textform zu kommunizieren. Beginnen Sie diesen Vorgang nur mit einem sitzenden Kristallisationstablett unter Verwendung eines binokularen Mikroskops oder Kristallbildgebungssystems. Überprüfen Sie das Tablett in der ersten Woche jeden Tag.

Notieren Sie sich danach einmal pro Woche die Kristallgröße. Sobald es keine Anzeichen für weiteres Wachstum gibt, wählen Sie eine oder mehrere geeignete Vertiefungen aus der Schale, aus denen kristallines Material entnommen werden soll. Für die Herstellung von Saatgut kann jedes Material verwendet werden, einschließlich feiner Nadeln, Spial Lights, Mikrokristalle und unregelmäßiger, schlecht geformter Kristalle.

Älteres Material ist mit größerer Wahrscheinlichkeit teilweise vernetzt und weniger geeignet für den Einsatz in Aussaatexperimenten. Verwenden Sie am Tag der Ernte ein entzündetes Brötchen, um aus einer Weidepipette aus Glas eine abgerundete Sonde herzustellen. Erhitzen Sie dazu die Pipette in der Nähe der Mitte, bis sie weich wird.

Dann schnell von der Flamme nehmen und durch Auseinanderziehen der Enden herausziehen. Versuchen Sie, das Glas an der Stelle, an der es etwa 0,25 Millimeter beträgt, auf einen Durchmesser von weniger als 0,25 Millimetern herunterzuziehen. Zerschlage das Glas und tauche das abgebrochene Ende kurz in die Flamme.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sich am Ende eine Halbkugel aus Glas mit einem Durchmesser von etwa 0,75 Millimetern bildet. Legen Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Rocailles auf Eis. Öffnen Sie anschließend die ausgewählte Kristallisationswanne.

Nun, für 24 gut hängende Tropfschalen. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Deckglas zu entfernen. Drehen Sie dann den Deckglas um und legen Sie ihn auf eine stabile, saubere Oberfläche.

Für 96 gut sitzende Tropfschalen. Schneiden Sie mit einem Skalpell um die Kunststoff-Deckenfolie auf der Oberseite der ausgewählten Vertiefung herum und entfernen Sie dann den herausgeschnittenen Teil der Deckenfolie mit einer Pinzette. Entfernen Sie 50 Mikroliter der Reservoirlösung und geben Sie diese Flüssigkeit in das Mikrozentrifugenröhrchen mit der Samenperle, wobei Sie sicherstellen, dass das Röhrchen die ganze Zeit auf Eis bleibt. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Vorbereitung des Saatguts.

Es ist wichtig, dies genau wie beschrieben und so schnell wie möglich durchzuführen. Achten Sie darauf, das Samenmaterial mit der Sonde gründlich zu zerkleinern und so viel wie möglich zurückzugewinnen, während Sie die Probe unter einem Mikroskop betrachten. Verwenden Sie die zuvor vorbereitete Glassonde, um die Kristalle auf der Abdeckung gründlich zu zerkleinern.

Rutschen fällt. Es kann mehrere Minuten dauern, bis kleine Kristalle vollständig zerkleinert sind. Kristalle, die leicht zu zerkleinern sind, sind nicht vernetzt und sind keine Salzkristalle.

Während Salzkristalle ein unverwechselbares Klicken erzeugen, das man hören und fühlen kann, wenn sie zerkleinert werden. Als nächstes nehmen Sie fünf Mikroliter der Reservoirlösung aus dem Saatperlenröhrchen und überführen sie in die entsprechende Vertiefung für ein sitzendes Tropfenexperiment oder in einen Deckglas für ein hängendes Tropfenexperiment, das das zu erntende kristalline Material enthält. Pipettieren Sie diese Flüssigkeit fünf- bis sechsmal auf und ab, um so viel wie möglich von dem Inhalt der Vertiefung oder des Deckglases zu resuspendieren.

Geben Sie die Suspension wieder in das Saatperlröhrchen und wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal, um sicherzustellen, dass so viel kristallines Material wie möglich geerntet wird. Vortex, die Saatperle für zwei Minuten, und stoppt alle 30 Sekunden, um das Rohr auf Eis abzukühlen. In 1,5 Milliliter-Röhrchen mit Reservoirlösung.

Erstellen Sie eine Verdünnungsreihe zur Archivierung, indem Sie das Saatgut in der Reservoirlösung in jeder Phase um den Faktor vier bis 10 verdünnen. Wenn das Saatgut, die Brühe und die Verdünnungen nicht sofort verwendet werden, legen Sie 10 bis 20 Mikroliter Aliquots zur Lagerung in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius. Nach dem Einfrieren können die Saatgutbestände bis zum Bedarf unbegrenzt aufbewahrt werden.

Das RMMS-Kristallisationsscreening kann entweder mit 24-Well-Tabletts unter Verwendung der Hanging-Drop-Dampfdiffusionsmethode oder mit 96-Well-Tabletts mit der Sitztropfendampfdiffusionsmethode durchgeführt werden. Um unser MMS-Screening in 24 gut hängenden Tropfschalen durchzuführen, verwenden Sie eine Pipette, um 300 Mikroliter jeder Bedingung manuell von einem Kristallisationssieb mit 96 Bedingungen in 10 Milliliter zu übertragen. Einzelröhrchenformat für jede Vertiefung von 4 24.

Gut vorgefettete Kristallisationsschalen aus jedem 300-Mikroliter-Reservoir übertragen einen Mikroliter jeder Kristallisationsbedingung auf die Oberfläche eines entsprechenden Kunststoff-Deckglases, von dem sowohl die vorderen als auch die hinteren Schutzstreifen auf den einen Mikroliter entfernt wurden. Auf dem Deckglas einen Mikroliter Proteinlösung und dann 0,5 Mikroliter Kristallsamenbrühe hinzufügen. In der ersten Runde von RMMS ist es wichtig, die verdünnte Saatgutlösung nicht zu verwenden.

Denn je höher die Konzentration der Samen, desto mehr Kristallisationstreffer werden erzielt. Drehen Sie jeden Deckglas so um, dass der Flüssigkeitstropfen nach unten zeigt, und positionieren Sie ihn über dem entsprechenden Schiebe. Drücken Sie den Deckglas gut nach unten, drücken Sie das Deckenfett zusammen und bilden Sie eine sichere Versiegelung.

Sobald alle 96 Tropfen etabliert sind, stellen Sie das Tablett zur Lagerung entweder in einen Inkubator bei vier bis 18 Grad Celsius oder in einen Raum mit konstanter Temperatur. Zur Durchführung unseres MMS-Screenings in 96 gut sitzenden Tropfschalen. Verwenden Sie einen Kristallisationsroboter oder eine Achtkanalpipette, um 20 bis 50 Mikroliter jeder Bedingung von einem Kristallisationssieb mit 96 Bedingungen im Deep-Well-Blockformat in die entsprechende Vertiefung der Kristallisationsschale zu übertragen.

Als nächstes geben Sie 1,0 Mikroliter Proteinlösung, 1,0 Mikroliter Kristallisationsbedingung und 0,5 Mikroliter Saatgut in die Tropfen. Verschließen Sie das Tablett mit einer transparenten Deckenplatte und bringen Sie es in einen Inkubator bei vier bis 18 Grad Celsius oder konstanter Temperatur. Der Raum für die Lagerung Die Experimente sollten fünf Tage lang alle 24 Stunden nach der Einrichtung und anschließend alle sieben Tage bis zu vier Wochen lang mit einem binokularen Mikroskop oder einem Kristallbildgebungssystem inspiziert werden. Untersuchen Sie jedes Unterloch oder jeden Deckglas nacheinander und notieren Sie alle Anzeichen von Kristallbildung.

Vergleichen Sie die Ergebnisse unserer MMS-Screening-Experimente mit denen von Nicht-ED-Screenings und notieren Sie eventuelle Unterschiede. Beobachtete Mehrfachzyklen von RMMS können erforderlich sein. Vor der optimalen Beugungsqualität werden Kristalle für weitere Zyklen hergestellt.

Verwenden Sie die archivierten verdünnten Saatgutbestände nach Bedarf, um die Anzahl der Kristalle pro Vertiefung zu kontrollieren. Um die Wirksamkeit von RMMS zu demonstrieren. Screening-Methoden wurden auf die Kristallisation von Henna, weißem Lysozym und Rinderleberkatalysator für jede Protein-3-96-Bedingung angewendet.

wurden Kristallisationsbildschirme verwendet: J-C-S-G-P-A-C-T und Morpheus. Nach fünf Tagen wurde dann eine einzelne Bedingung aus jeder Schale ausgewählt, die das Wachstum von kristallinem Material unterstützte, und für die Erzeugung von Saatgut verwendet. Nach fünf Tagen wurden die Kristallisationsschalen inspiziert und die Anzahl der Tropfen mit Kristallen erfasst.

Diese Abbildung fasst die Ergebnisse dieses Experiments zusammen und bietet eine quantitative Analyse für Hühnerei-Eiweiß-Lysozym. Eine vier- bis zehnfache Steigerung der Kristallisationserfolgsrate im Vergleich zu Nicht-ED-Trays wurde beobachtet, wenn RMMS auf dieses Protein angewendet wurde. Bemerkenswert für die Rinderleberkatalase war, dass nur eine einzige Bedingung im Morpheus-Screening Kristalle lieferte, verglichen mit 55 Erkrankungen, die nach der Anwendung von RMMS identifiziert wurden.

Darüber hinaus gab es in allen Fällen eine drei- bzw. zweifache Steigerung der Erfolgsrate der Kristallisation von Rinderleberdosen mit JCSG- bzw. PACT-Screenings, und unabhängig vom verwendeten Kristallisationssieb ergab unser MMS-Screening eine signifikant größere Gesamtzahl von Kristallen als das Nicht-RMMS-Screening. Wir kommen zu dem Schluss, dass unser MMS ein einfacher, aber leistungsstarker Ansatz ist, der die Erfolgsrate von Proteinkristallisations-Screening-Experimenten erheblich erhöhen kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein zufälliges Screening-Experiment mit Mikrosaatmatrix durchführen, von der Identifizierung und Ernte von kristallinem Material über die Vorbereitung von Kristallsaatgut bis hin zur Etablierung der ausgesäten Kristallisation Sobald Sie es gemeistert haben.

Diese Technik kann in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Für Random-Matrix-Micro-Seeding-Screening-Experimente, die mit einem Liquid-Handling-Roboter durchgeführt werden, oder in etwa drei Stunden für Experimente, die von Hand durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist darauf zu achten, dass alle ausgesäten Kristallisationssiebe vor der Lagerung gut verschlossen sind.