Name: Beziehen Proben mit verlangsamt, Beschleunigte und Umge Aging in der Honig-Bienen-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-29T16:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Proben mit verlangsamter, beschleunigter und umgekehrter Alterung bei Honigbienen-Arbeiterinnen gewinnen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Seneszenz in Abhängigkeit von sozialen Aufgaben.

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Wir danken Osman Kaftanoglu für hilfreiche Beratung und Unterstützung während der Dreharbeiten. Wir möchten die anonymen Gutachtern für wertvolle Kommentare. Diese Arbeit wurde von der Research Council of Norway (gewährt 180504, 191699, 213976 und), Marie Curie/FP7 (Projekt-ref. 238665), des National Institute on Aging (NIA Zuschuss AG22500 P01) und den Pew Charitable Trusts unterstützt.

1. Die Entkopplung von Seneszenz chronologischen Alter Dieser Abschnitt beschreibt die Einrichtung von Doppel Kohorte Kolonien, die aus einer Gruppe von Individuen identifiziert, die den gleichen chronologischen Alter (&quot;single Alterskohorte&quot;) und eine Kohorte von Bienen Nest Aktien bestehen. Gleiche Alter Individuen der einzelnen Alterskohorte wird schließlich in verschiedenen Arbeiter-Typen mit unterschiedlichen Alterungsdynamik zu trennen - das sind Krankenschwester Bienen mit verlangsamter und Sammlerinnen mit beschleunigten Funktionsabnahme. Alle Verfahren sind für eine experimentelle Kolonie beschrieben. Wir empfehlen jedoch Experimente für mindestens zwei Kolonie durch repliziert, so dass Kolonie Effekten kann (zwei Replikat-Design) gesteuert werden. <ol><li> Vorbereiten Bienenstock-Boxen für den Doppel Kohorte Kolonien: Bereiten Sie eine regelmäßige Struktur ein, die zwei Lebensmittel Kämme mit Honig erhält, einen anderen Lebensmittelkamm mit Pollen, und zwei leere Kämme. Achten Sie auf eine gepaart Königin sowie ein Spender Kolonie mit mehr als 3.000 lokalisierenNest Bienen. (1.3) beide später eingeführt werden. </li><li> Beziehen und Kennzeichnung Individuen mit ähnlichen chronologischen Alter: Sammeln Kämme mit verdeckelten Brut, die im Entstehen ist. Für ein Replikat erwarten, Kämme mit insgesamt 3.000-5.000 verdeckelten Brutzellen zu sammeln. Für jede Wiederholung verwenden eine ausgewogene Menge an Brut aus mindestens drei verschiedenen Quellen, um Bienenstock schiefen Verteilungen von Genotypen (Bienenstock Herkunft) zu vermeiden. <ol><li> Zeigen Brutwaben in einem Inkubator auf 34 ° C mit 60 bis 70% relative Feuchte eingestellt. Achten Sie darauf, Kämme in einer Weise, dass die Schwellen Brut nicht entweichen kann speichern. </li><li> Lassen Bienen entstehen für zwei Tage und markieren diese Bienen mit einer kleinen Lack-Tag auf den Brustkorb (zB Uni POSCA, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.) Die Farbmarkierung ermöglicht die Identifizierung der Bienen der einzelnen Altersjahrgangs (Tag der Entstehung) und um sie von anderen Replikat-Kolonien zu unterscheiden. </li></ol></li><li> Einrichten einer Doppel Kohorte Kolonie, die die Kohorte von i enthältdentified, single Alter Bienen: An dem Tag, jungen Bienen markiert wurden, sammeln etwa 2.500-3.000 Nest Bienen von einem Spender Kolonie (vgl. Abschnitt 1 in Diskussion.) und fügen Sie diese nicht markierten Bienen in den Bienenstock-Box, die vor vorbereitet wurde (siehe Schritt 1.1). Letztere wird den nicht identifizierten Personen Nest Biene Kohorte bilden. <ol><li> Fügen Sie die Königin, die zunächst zu einem Doppelkäfig (im Handel erhältlich) beschränkt wird. Verschließen Sie den Käfig mit essbaren Süßigkeiten (zB Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Deutschland), um Arbeitsbienen geben langsam die Königin. </li><li> Fügen Sie die neu entstandenen und markierte Bienen, die die einzelnen Altersjahrgangs darstellen wird. Diese Bienen sind die einzigen markierten Individuen, und sind die Fokusgruppe für alle folgenden Schritte. </li></ol></li><li> Überwachung der Nahrungssuche Beginn und Kennzeichnung Sammlerinnen: Zur Entstehung und Dynamik der Krankenschwester-to-Häcksler Übergang in eine einzige Alterskohorte zu bewerten, überwachen die demographische Entwicklung der Sammelaktivität esehr anderen Tag für jeden Kolonie. Beginnen Zählen fünf Tage nach Kolonien wurden (Abbildung 1) gesetzt. <ol><li> Zählen Sie die Anzahl der Bienen Rückkehr aus Futtersuche Flüge (Eingang zählt) innerhalb von 3 x 20 min Beobachtungszeiträume zu festen Zeiten. Achten Sie darauf, die Bienen in Zeiten der Orientierung Flüge zählen nicht (siehe Diskussion). </li><li> Als Eingang zählt zeigen erhebliche Futtersuche zu beginnen (&gt; 100 Eingang counts / Tag), beginnen Kennzeichnung Häcksler. Um dies zu tun, Sammlerinnen der einzelnen Alterskohorte (Einzel markierten Individuen) erhalten eine zweite Farbmarkierung nach der Rückkehr von ihrer ersten Flüge Nahrungssuche. Diese Farbmarkierung wird der Tag der Futtersuche Beginn anzugeben, und wird es ermöglichen, später identifizieren die Nahrungssuche für jedes Alter Häcksler. </li><li> Täglich wiederholen Markierungen, bis eine ausreichende Anzahl von Bienen wurde markiert. Für die Abschätzung einer ausreichenden Anzahl von markierten Sammlerinnen, erwarten eine Wiederfindungsrate von nicht mehr als 5-10%, nachdem diese Bienen war gealtert worden, in der Regel nach 14 TagenFuttersuche. </li></ol></li><li> Sampling: Da alle ursprünglich markierten Bienen haben eine ähnliche chronologische Alter kann altersgleichen Gruppen von Krankenschwestern und alte Sammler gleichzeitig gesammelt werden, als Sammlerinnen haben für ≥ 14 Tage Futter gesucht. <ol><li> Einzel deutliche Krankenschwester Bienen im Bienenstock gesammelt und werden von Pflegeverhalten (Fütterung und Reinigung der Larven mit Kopf nach unten in offenen Brutzellen setzen) identifiziert. </li><li> Doppel markiert Sammlerinnen sind auch in den Bienenstock gesammelt vor der täglichen Futtersuche beginnt. </li><li> Bienen sammeln in Käfigen (Tuben, Schachteln), die eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten, halten und dunkel bis zur Weiterverarbeitung. Alternativ zur Transkriptom-, Proteom-oder epigenetische Studien direkt Snap Bienen Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Sammeln ausgewogene Zahl von Personen aus allen Testgruppen und zu replizieren Kolonien. </li></ol></li></ol> 2. Umkehr der Arbeiter mit Rapid auf Arbeitnehmer mit Verlangsamte Aging durch Ändern der Hive Demographie &lt;/ P&gt; Dieser Abschnitt enthält Details, wie die Umkehrung von Arbeitnehmern mit beschleunigten Alterung (Häcksler) Arbeitnehmer mit verlangsamter Alterung (Krankenschwester Bienen) durchgeführt wird. Solche Verhaltensumkehr induziert wird, als Sammlerinnen erleben einen Mangel an Ammen, die normalerweise in der Brutpflege zu engagieren. Die Reversion Verfahren wird getrennt eine einzelne Kolonie in zwei Bienenstöcke zu replizieren: Bienenstock mit der Krankenschwester Biene Fraktion (&quot;Krankenschwester-abgeleitete&quot;), und eine andere mit dem Häcksler Fraktion (&quot;Häcksler abgeleitete&quot;). Nach der erfolgreichen Umkehr, mögliche Symptome von Kunststoff-und umgekehrt Alterung in der einzigen Alterskohorte mit rückgängig Arbeiter, weiterhin Sammlerinnen, Weiterbildung Krankenschwester Bienen und neu eingestellten Sammlerinnen untersucht werden. Nach wie vor identifiziert Bienen der einzelnen Altersjahrgangs, nicht die Kohorte von nicht identifizierten Nest Bienen bilden die experimentellen Fokusgruppe. <ol><li> Zubereitung: Replizieren Nesselsucht mit Krankenschwestern (Einzel markiert) und Häcksler (Doppel markiert) zur Verfügung gestellt werden, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Achten Sie darauf, nicht anfangen Reversion mit weniger als 500 markierte Sammler pro Wiederholung Kolonie, um eine ausreichende Abruf nach der Rückkehr abgeschlossen ist sicherzustellen. <ol><li> Für die sichere Identifikation von Testgruppen nach Umkehr ist es entscheidend, dass die gesamte Bevölkerung in den Häcksler ursprünglichen Bienenstock wurde, bevor Reversion markiert. Das folgende Verfahren ist für ein Replikat beschrieben. </li><li> Am Tag vor der Rückkehr, bereiten eine weitere Bienenstock-Box für den Häcksler-abgeleitete Struktur (siehe Schritt 1.1). Suchen Sie zwei Damen und zwei Brutwaben aus Spendernesselsucht. Vor der Übergabe an den experimentellen Kolonien Pinsel entfernt alle erwachsenen Bienen aus diesen Kämme. Ein Käfig Königin (siehe Schritt 1.3) und eine Brutwaben wird Königin und Brutwaben in der ursprünglichen Struktur ein ersetzen. Die andere Gruppe von Königin und Brutwaben werden am nächsten Tag für den neuen Bienenstock-Box verwendet werden. Ähnliche Zuteilung neuer Brutwaben und Alien-Königinnen für beide, das Original und die neue Bienenstock wird empfohlen, um sicherzustellen, dass getrennte Sammlerinnen und Krankenschwesters gleichermaßen Erfahrung verändert Bienenstock Cues (&quot;hive Geruch&quot;). </li></ol></li><li> Reversion: Morgens, kurz vor der Rückkehr, fügen Sie den Käfig Königin und die Brut Kamm zu der neuen Box, die die Häcksler-abgeleiteten Fraktion erhalten wird. Warten Sie, bis der Spitzennahrungssuche beginnt. Dann bewegen Sie die ursprüngliche Kolonie markiert mit Häcksler und Krankenschwester Bienen mindestens 100 m entfernt von der ursprünglichen Position. <ol><li> Am ursprünglichen Standort, Einrichtung der neuen Box für den Häcksler-abgeleiteten Bienenstock mit Brut und nur Königin. </li><li> Foragers verlassen die dislozierten ursprünglichen Struktur ein, und zurück an den ursprünglichen Speicherort. Lassen Sie den Häcksler an den ursprünglichen Speicherort für 2 Stunden, um zu erreichen neben Trennung der Häcksler Bevölkerung von Bienen Nest vervollständigen zurückzukehren. </li><li> Dann, um die Trennung zu beenden, schließen Sie das Original, jetzt &quot;Krankenschwester-abgeleitete&quot; Bienenstock, und es auf dem Bienenstand mindestens 3 km entfernt. </li></ol></li><li> Hive Wartung und Überwachung für erfolgreiche gesellschaftliche AufgabeAuflösung: Überprüfen Sie die experimentelle Bienenstöcke regelmäßig für gesunde, offene Brut. <ol><li> In den ersten Tagen nach der Kolonie Manipulation ersetzen unbeaufsichtigt und tote Brut, um mögliche Erreger Last zu reduzieren. </li><li> Um erfolgreich zu Umkehr in der Häcksler-abgeleiteten Bienenstock zu validieren, machen Sie Fotos von Brutwaben vor der Einführung dieser und wieder, wenn Kämme ersetzt werden oder wenn die Reversion Experiment abgeschlossen ist (Abbildung 2). Bereiche mit zuvor unverschlossen Brut und mit offenen, Live-Brut sind zuverlässige Marker der Pflegetätigkeit in Häcksler abgeleitete Kolonien. </li></ol></li><li> Sampling: Physiologische Effekte, die soziale Umkehrung begleiten kann 3-8 Tage nach Häcksler und Pflegepersonal erkannt werden getrennt. <ol><li> Wir beraten Probenahme alle Testgruppen, dh rückgängig Arbeiter-und Weiterbildung Häcksler (Häcksler abgeleitete Bienenstock), sowie die anhaltenden Krankenschwestern und neu eingestellten Sammlerinnen (Krankenschwester-Bienenstock abgeleitet) von 8 Tagen nach Umkehr eingeleitet wird. </li><li> Collect Proben wie in Schritt 1.5 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Analyse Worker-Typ-spezifische zelluläre Seneszenz-Muster durch Quantifizierung von Lipofuszin Lipofuszin ist ein universeller Biomarker für zelluläre Seneszenz. Als intrinsische Akkumulations Produkt kann lipofuscin spezifischen Autofluoreszenz (Emissions max = 530-650 nm) zur Detektion 18 verwendet werden. <ol><li> Dissection und Fixierung: Schauer Bienen auf Eis, bis unbeweglich, zu entfernen und sezieren die gewünschte Gewebeprobe. <ol><li> Transfer in die Fixierlösung (4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, PBS, pH 7,2) für eine Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> 3 mal in PBS waschen Proben. </li></ol></li><li> Gewebeverarbeitung und Montage: Schneiden von Gewebeproben in Abschnitte mit nicht mehr als 40 &amp;mgr; m Dicke, beispielsweise unter Verwendung eines Mikrotoms Schwingklinge, z. B. Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Deutschland). <ol><li&gt; Für die Reinigung, Inkubation Gewebeschnitte über Nacht in 30% Glycerin (PBS), und weitere 2 h in 50% Glycerin (PBS). </li><li> Montieren Abschnitte auf Objektträger in 50% Glycerin (PBS). Für die langfristige Lagerung Dichtungsdeckel rutscht mit Nagellack. </li></ol></li><li> Bildaufnahme: Um Lipofuszin erkennen, empfehlen wir die Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das Laserlinien bietet mit λ = 514, 561nm oder ähnliche für die Anregung, mit der Detektor Bandbreite von 570 bis 650 nm eingestellt. <ol><li> Zur besseren Identifizierung von Lipofuszin, einen zweiten Kanal, und tun eine gleichzeitige Abtastung bei kürzeren Wellenlängenspektren (Anregung = 405 nm, Emission = 410 bis 450 nm). Die längere Wellenlängenkanal wird sowohl durch autofluoreszierenden Luftröhre und andere nicht-körnige Strukturen offenbaren, granulare Lipofuszin, aber auch unspezifische &quot;Hintergrund&quot;. Der zweite, kürzere Wellenlängenkanal nur unspezifische Autofluoreszenz zeigen, aber nicht Lipofuszin. So kann Lipofuszin Identifizierung Facili sein<html> durch Vergleich der Signale in den beiden Kanälen, wobei nur einer von ihnen offenbart die Granulate mit Lipofuscin spezifische Fluoreszenz tated. </li><li> Zum Erwerb der Bilder mit hoher Auflösung verwenden ein Objektiv mit 40-facher Vergrößerung oder höher, und vorzugsweise einer numerischen Apertur von 1,25 oder höher. Scan-Bildstapeln mit den Abmessungen von ca. 100 x 100 x 10 um drei. Und jeder einzelne Gewebeprobe, die von mehreren Bildstapel dargestellt werden. </li><li> Um intra-individuelle und inter-individuelle Unterschiede durch technische Veränderung zu reduzieren, der stets Laserleistung und Empfindlichkeit des Detektors konstant. </li><li> Um Verzerrungen durch Tag zu Tag technische Varianten reduzieren scannen gleich Probennummern aller Testgruppen in jeder der verschiedenen Scan-Sitzungen. </li></ol></li><li> Bildverarbeitung: Mit Software-Pakete mit Modulen, die für erweiterte Verarbeitung von mikroskopischen Bildstapeln zu ermöglichen, zum Beispiel ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA,gej.nih.gov / ij / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Generieren Sie ein 2D-Projektions maximal für jeden der 3D-Bildstapeln. </li><li> Tragen Sie eine Gauss-Filter mit einem bescheidenen Kerngröße, um Hochfrequenzrauschen zu dämpfen und um Strukturen mit Abmessungen von Lipofuszingranula bewahren. </li><li> Zusammenführen beider Farbkanäle, um die Identifizierung von Lipofuszin (siehe Schritt 3.2) zu erleichtern. </li></ol></li><li> Imageanalysen: Vergewissern Sie sich, dass das Thema der Durchführung der Quantifizierung Schritte werden blind für die Gruppenidentität zu testen. <ol><li> Für alle Bilder, zuerst eine Region von Interesse (ROI), die die entsprechenden Strukturen bedeckt, und hat ähnliche Abmessungen wie der ROIs von anderen Bildern zu wählen. </li><li> Dann wählen Sie die gewünschte Anzahl von Lipofuszingranula, die jede ROI darzustellen. Bei der Auswahl Lipofuszingranula innerhalb einer ROI, wird die Anwendung der folgenden Regeln subjektive Bias zu reduzieren. <ol><li> Wählen Sie einen einheitlichen Ort für die Auswahl der ersten Granulatle. Dies kann, zum Beispiel, wird die am weitesten links Kante eines ROI, und das Granulat, das am nächsten zu der Kante ist immer die erste Wahl sein. </li><li> Einer nach dem anderen werden die Granulat gewählt, die am nächsten zu der vorherigen Auswahl (nächste Nachbarn) sind. </li><li> Bei der Wahl des nächsten Nachbarn, bewegen sich nur in eine Richtung, beispielsweise nur richtig suchen, von der vorherigen Auswahl. Diese Regel verhindert, dass die Auswahl durch gelegentliche Cluster von dicht gepackten Granulat dominiert. </li><li> Bei Auswahl abgeschlossen ist, beurteilen die Größe der einzelnen Partikel durch Lipofuszin skizziert und die Messung der jeweiligen Granulatbereich. Verwenden Sie geeignete statistische Tests, um Personen der verschiedenen Testgruppen vergleichen. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir übernehmen hier zuvor beschriebenen Ansätze 8,16,17,19,20, und integrieren sie in einem einzigen Workflow, der das Studium flexibel Alterung in Honigbienen erleichtern wird. Unser Ziel ist es, die Anfänger sind Wissenschaftler auf diesem Gebiet mit einem standardisierten Werkzeugsatz, um relevante Probenmaterial zu erhalten, liefern und experimentelle Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Forschungsteams zu verbessern. Während unsere Verfahren werden vereinfacht und nicht spezielle Ausrüstung wie in f...

Die komplexen Strukturen der Kolonie sehr soziale Tiere werden durch das Zusammenspiel eines Fortpflanzungs Kaste gehalten und ein Helfer Kaste der Regel nicht-Wiedergabe Arbeitnehmer mit unterschiedlichen sozialen Aufgabe Verhaltensweisen. In den verschiedenen Arbeiter, spezifische physiologische Anpassungen ermöglichen deutliche sib Pflege Verhalten und werden auch extreme Unterschiede Lebensdauer verbunden. Honigbienen und Nacktmulle stellen die besten entwickelten Tiermodell zu untersuchen, wie Sozialität ist, um Muster der beschleunigten, unerheblich oder umgekehrt Alterungs 3.1 verknüpft. In Bienenvölkern ist eine einzige eierlegende Königin von Tausenden von Arbeitnehmern, die die Brut-, Futter für Lebensmittel sind in der Regel unterstützt wird, und bei der Bewachung, Thermoregulation oder hygienische Verhaltensweisen 4 eingreifen. Unter dieser Arbeiter sind die extrem kurzlebige Häcksler, Krankenschwester Bienen mit Zwischen-und Winter (diutinus) Bienen mit der längsten Lebensdauer. Menschen sind jedoch nicht permanent an einem bestimmten WO gebundenrker-Typ, aber zeigen eine flexible Verhaltens Ontogenese, sie von einer sozialen Aufgabe, Verhalten ändern, um eine andere (&quot;zeitliche Kasten&quot;). Callow Bienen zum Grübeln neigen Krankenschwester Bienen verändern, was kann schließlich außerhalb Futtersuche ändern. Allerdings kann callow Nest Bienen auch in langlebigsten Winterbienen zu verwandeln, und kurzlebig Häcksler kann sogar in der Regel langlebiger Krankenschwestern zurück. Arbeitnehmer mit extremen (Winterbienen) und Mittelstufe (Krankenschwester Bienen) Lebensdauer verfügen über gut entwickelte Lebensmittelproduktion und Speicherorgane mit reichlich Ressourcen - im Gegensatz zu kurzlebigen Häcksler (in 1,5 bewertet). Jedoch, dass die Regelung von Einzel Lebensdauer geht über einfache Änderungen in Ressourcenbilanz eines Menschen ist durch die Forschung auf einem Eigelb-Protein, das vielfältige angepasst Funktionen in der Nicht-Wiedergabearbeiterkaste hat, wie Gelee Produktions 6, hormonelle Steuerung 7, Immun vorgeschlagen 8 und antioxidative Verteidigungs 9. Patterns of functional Rückgang (Seneszenz) Spiegel Lebensdauer Ungleichheiten unter den Arbeitnehmern, wie für andere Riechhirn oder motorischen Funktionen 10-13 gegründet, und auch. Insbesondere der deutliche Rückgang der Lernfunktion nach nur zwei Wochen der Nahrungssuche entspricht eine ähnliche Mortalitätsverlauf in Sammler 14, im Gegensatz zu dem Fehlen von nachweisbaren Rückgang (vernachlässigbare Seneszenz) in langlebigen Winterbienen 15. Um die molekularen Fingerabdrücke der Alterung wir flexible angepasst etablierten experimentellen Paradigmen, die für die Überwachung und Manipulation Aging-Typ-Übergänge ermöglichen 8,16,17 identifizieren. Versuch 1 Details, wie man Proben, in denen die Auswirkungen der chronologischen Alter und Arbeitnehmertyp-spezifische soziale Verhaltensweisen auf die Alterung getrennt werden können, zu erhalten. Experiment 2 beschreibt die Umkehrung der Häcksler mit beschleunigten in Krankenschwester Bienen mit verlangsamten Alterungsdynamik. Experiment 3 liefert einen Ansatz zur Untersuchung von Auswirkungen von zellulärer Seneszenz durch anatomical Quantifizierung eines etablierten Biomarker für Zellalterung (Lipofuszin) 18.

<table><tbody><tr><td>Apifonda</td><td>S&#252; dzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Merck</td><td>1.04094.1000</td><td></td></tr></tbody></table>

beziehen proben mit verlangsamt, beschleunigte und umge aging in der honig-bienen-modell

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Gesellschaften sehr soziale Tiere verfügen über große Lebensdauer Unterschiede zwischen nahe verwandten Individuen. Unter sozialen Insekten, ist die Honigbiene, die am besten etablierten Modell zu untersuchen, wie die Plastizität der Lebenserwartung und Alterung wird durch soziale Faktoren erklärt. Die Arbeiterkaste der Honigbienen gehören Krankenschwester Bienen, die die Brut neigen und Sammlerinnen, die Nektar und Pollen zu sammeln. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Gehirnfunktionen und Flugleistung altern schneller in Sammlerinnen als in Krankenschwestern. Allerdings kann die Gehirnfunktionen zu erholen, wenn Häcksler wieder zurück zu Pflegeaufgaben. Solche Muster der beschleunigt und umgekehrt Funktions Seneszenz sind an veränderte Stoffwechsel Ressource Ebenen verknüpft sind, um Veränderungen in der Proteinmenge und die Immunfunktion. Vitellogenin, einem Eigelb Protein mit angepassten Funktionen in hormonelle Steuerung und zelluläre Abwehr, kann als eine wichtige regulatorische Element in einem Netzwerk, das die unterschiedlichen Alterungsdynamik in Arbeiter steuert dienen. Hier beschreiben wir, wie die Entstehung von Krankenschwestern und Sammlerinnen können überwacht werden, und manipuliert werden, einschließlich der Auflösung von in der Regel nur von kurzer Dauer Sammlerinnen in langlebiger Krankenschwestern. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, wie Individuen mit ähnlichen chronologischen Alter differenzieren sich in Sammlerinnen und Krankenschwester Bienen unter experimentellen Bedingungen. Wir veranschaulichen, wie Verhaltensumkehr von Sammlerinnen zurück zu Krankenschwestern können validiert werden. Schließlich zeigen wir, wie verschiedene Zellalterung kann durch Messen der Akkumulation von Lipofuscin, eine universelle Biomarker der Alterung geprüft. Für die Untersuchung Mechanismen, die soziale Einflüsse verbinden kann und Alterungs Plastizität, bietet dieses Protokoll ein standardisiertes Tool, um relevante Probenmaterial zu erwerben, und die Vergleichbarkeit der Daten bei zukünftigen Studien zu verbessern.

Protokoll Abschnitt 1 und 2 ausführlich, wie Testgruppen erhalten, um die Attribute des beschleunigten studieren, verlangsamt und umgekehrt Alterung in Kolonien mit einer einzigen Alterskohorte. Um Arbeitnehmer-Typ-Differenzierung, die den normalen Ontogenese wir beurteilt Häcksler Zahlen (&quot;Eingang zählt&quot;) für 6 Kolonien (Abbildung 1, vgl. Abschnitt 1) begleitet überwachen. Die Grafiken zeigen, dass erhebliche Veränderung von der Krankenschwester auf den Häcksler Zustand ist in der Regel nicht...

In Arbeitsbienen, hängt Altern auf Sozialverhalten und nicht auf das chronologische Alter. Hier zeigen wir, wie Arbeiter-Typen mit sehr unterschiedlichen Alterungsmuster erhalten und für die zelluläre Seneszenz analysiert werden.

Beziehen Proben mit verlangsamt, Beschleunigte und Umge Aging in der Honig-Bienen-Modell

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Arbeitsbienentypen zu erhalten, bei denen Alterungsprozesse verlangsamt und umgekehrt wurden. So kann das Altern untersucht werden. Dies wird erreicht, indem zunächst der Alterungsprozess vom chronologischen Alter entkoppelt wird, indem Kolonien zusammengestellt werden, die neugeborene Bienen desselben Alters erhalten. Diese Bienen übernehmen schließlich unterschiedliche soziale Aufgaben, entweder Brutpflege oder Nahrungssuche, obwohl sie das gleiche chronologische Alter haben. Die Pflegebienen können im Vergleich zu einer schnelleren Alterung der Sammler eine verlangsamte Alterung aufweisen. Anschließend wird eine Umkehrung der Alterungsdynamik von der Nahrungssuche zurück zur Brutpflege ausgelöst.Zunächst werden Sammlerinnen von Pflegerinnen getrennt, danach kehren Sammlerinnen, die einen Mangel an Pflegerinnen erfahren, zu Pflegeaufgaben zurück. Die Ergebnisse werden durch den Vergleich von Anzeichen zellulärer Alterung bei rückentwickelten Arbeitsbienen, regulären Sammlerinnen und Pflegerinnen erhalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Alterungsforschungsbereich zu beantworten, beispielsweise, welche Mechanismen zur Verlangsamung des funktionellen Abbaus während des Alterns beitragen können.Ein wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass keine spezielle Ausrüstung erforderlich ist. Daher sollten Experimente mithilfe dieser Methoden leicht zu reproduzieren sein. Einige der Verfahren werden demonstriert von Osman Craft ulu, Projektleiter im Honigbienen-Forschungslabor an der Arizona State University.Dieser Abschnitt beschreibt den Aufbau einer Kolonie mit zwei Kohorten, die aus einer altersgerecht abgeglichenen Kohorte markierter Bienen und einer Kohorte zufälliger Nestbienen besteht. Die markierten Bienen gliedern sich in Pflegebienen oder Sammelbienen auf, die unterschiedliche Alterungsdynamiken aufweisen. Experimente sollten aus zwei oder mehr solchen Kolonien bestehen.Zunächst einen regulären Bienenstock mit zwei Futterwaben mit Honig, einer weiteren Futterwabe mit Pollen und zwei leeren Waben vorbereiten. Danach eine begattete Königin sowie eine Spenderkolonie mit mehr als 3000 Nestbienen lokalisieren. Anschließend Waben mit verdeckelter Brut sammeln, die kurz vor dem Ausschlüpfen steht – für eine Kolonie werden etwa zwischen drei- und fünftausend verdeckelte Brutzellen benötigt.Diese Waben sollten aus mindestens drei verschiedenen Bienenstockquellen gesammelt werden, um eine Verzerrung der maternalen Genotypverteilung zu vermeiden. Inkubieren Sie die gesammelten Brutwaben nun bei 34 Grad Celsius und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 bis 70 %. Lassen Sie die Bienen zwei Tage lang ausschlüpfen und stellen Sie sicher, dass die Waben so gelagert werden, dass die schlüpfende Brut nicht entweichen kann.Markieren Sie anschließend die geschlüpften Bienen mit einem kleinen Farbtag am Thorax, um die Bienen einer einzigen Alterskohorte zu identifizieren und sie von anderen Replikatkolonien zu unterscheiden. Am selben Tag wurden junge Bienen markiert. Sammeln Sie zwischen 2, 503, 000 Nestbienen aus einer Spenderkolonie und fügen Sie diese unmarkierten Bienen der vorbereiteten Bienenstockbox hinzu.Fügen Sie dann eine in einem Käfig eingeschlossene Königin hinzu, der mit essbarem Süßstoff verschlossen wurde. Die robusten adulten Arbeitsbienen werden die Königin langsam freisetzen. Fügen Sie abschließend die neu geschlüpften markierten Bienen hinzu.Der Schwerpunkt der Studie liegt in der Beurteilung des Beginns und der Dynamik des Übergangs von der Pflegerin zur Sammlerin. Überwachen Sie die demografische Entwicklung der Nahrungssammeltätigkeit alle zwei Tage für jede Kolonie. Beginnen Sie fünf Tage nach dem Aufstellen der Kolonien mit der Zählung.Die Überwachung erfolgt durch Zählen der Gesamtanzahl der Bienen, die von Sammelflügen über den Eingang zurückkehren. Dies wird in drei 20-minütigen Zeiträumen zu festgelegten Zeitpunkten durchgeführt. Zählen Sie keine Bienen während Orientierungsphasen.Flüge, bei denen die Eingangszahlen pro Tag über 100 liegen. Beginnen Sie mit der Markierung von Sammelflügen. Verwenden Sie weiche Pinzetten, um einzelne markierte Bienen einzusammeln, wenn sie von ihren Flügen zurückkehren, um das Fangen der Bienen zu erleichtern.Nach der Landung den Bienenstockeingang mit Schaumstoff oder Maschendraht verengen. Eine zweite Farbmarkierung anbringen, die den Tag angibt, um später das Alter des Beginns der Sammeltätigkeit bewerten zu können. Verschiedene Farben oder Farbkombinationen verwenden, um die Bienen an jedem Tag zu markieren.Wenn überlegt wird, wie viele Bienen für die Studie markiert werden müssen, ist damit zu rechnen, dass fünf bis zehn Prozent der markierten Sammelbienen zurückkehren. Nach mindestens zweiwöchiger Sammeltätigkeit sammeln Sie die markierten Pflegerinnen und gleichzeitig die markierten Sammlerinnen aus dem Stock. Diese Bienen füttern und säubern die Larven und stecken dabei ihre Köpfe in offene Brutwaben. Sammeln Sie außerdem die doppelt markierten Sammlerinnen.Sammeln Sie ausgeglichene Zahlen aus allen Testgruppen und replizieren Sie Kolonien. Überführen Sie die Bienen in belüftete Käfige und bewahren Sie sie im Dunkeln auf, bis sie weiterverarbeitet werden. Für molekulare Untersuchungen gefrieren Sie die gesammelten Bienen direkt durch Schnellgefrierung in flüssigem Stickstoff ein.Dieses Verfahren teilt eine einzelne Kolonie in zwei Völker auf, wobei eine Hälfte die Pflegerinnen (B-Fraktion) und die andere die Sammlerfraktion enthält. Dazu wird ein Bienenvolk benötigt, das wie im vorherigen Abschnitt beschrieben vorbereitet wurde und mindestens 500 markierte Sammler sowie eine vollständig markierte foragierende Population aufweist. Am Tag vor der Umkehrung muss ein zweiter, neuer Bienenstock wie zuvor beschrieben vorbereitet werden.Sammeln Sie anschließend zwei Brutwaben aus Spenderkolonien. Bürsten Sie alle erwachsenen Bienen von den ausgewählten Waben ab. Sammeln Sie außerdem zwei Spenderköniginnen, eine Königin in einer mit Süßigkeit verschlossenen Käfigkapsel, und eine Brutwabe.Ersetzen Sie die Königin und Brutwaben in der ursprünglichen Beute. Am nächsten Tag wird eine weitere Königin und Brutwabe für die andere Beute verwendet. Dies dient als Kontrolle, um später sowohl den aus Pflegerinnen als auch den aus Sammlerinnen stammenden Kolonien einen neuen Stallgeruch zu bieten.Am Morgen des Rückverwandlungstages fotografieren Sie den Zustand der neuen Brutwaben. Fügen Sie dann eine neue Königin in einer mit Süßigkeit verschlossenen Käfigzelle und eine Brutwabe der neuen Box hinzu. Während dieses Tages, zur Hauptzeit der Nahrungssuche, bringen Sie die ursprüngliche Kolonie mit markierten Sammler- und Pflegebienen mindestens 100 Meter vom ursprünglichen Standort weg und danach wieder an den ursprünglichen Standort zurück.Richten Sie die neue Box für den Schwarmstock ein. Lassen Sie den Schwarm zwei Stunden lang an den ursprünglichen Standort zurückkehren. Dadurch wird eine nahezu vollständige Trennung der Schwarmpopulation von den Nestbienen erreicht.Um die Trennung abzuschließen, verschließen Sie den ursprünglichen Bienenstock und bringen Sie ihn zu einem Bienenstand, der mindestens drei Kilometer entfernt liegt. Überprüfen Sie die Versuchsstöcke regelmäßig auf gesundes, offenes Brutmaterial. Ersetzen Sie in den ersten Tagen jegliche unbeaufsichtigte und abgestorbene Brut, um die potenzielle Belastung durch Krankheitserreger zu verringern. Bereiche mit zuvor ungedeckelter Brut sowie offene, lebende Brut sind zuverlässige Indikatoren für die Pflegetätigkeit in Kolonien, die von Sammlerinnen abstammen, acht Tage nachdem die Umkehrung eingeleitet wurde.Unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methode zur Probennahme von revertierten Arbeitsbienen sowie weiterhin sammelnden Sammelbienen und weiterhin säugenden Bienen. Wenn das Experiment abgeschlossen ist, machen Sie ein weiteres Foto der eingebrachten Waben, um die Differenzierung der Arbeitstypen zu überwachen, die die normalen Zählungen der Sammelbienen begleitet; diese wurden für sechs Kolonien durchgeführt. Eine beträchtliche Zunahme der Sammeltätigkeit wurde nach 10 Tagen beobachtet.Einige Variabilitäten, die durch die roten Zeitpunkte gekennzeichnet sind, resultieren aus wechselnden Wetterbedingungen. Die umgekehrte Ontogenie vom Nahrungssammeln zurück zu Pflegearbeiten wurde durch die Untersuchung von Brutwaben bestätigt, die in die aus Sammlerinnen stammenden Kolonien eingeführt wurden. Oben ist die Wabe dargestellt, bevor sie eingeführt wurde.Unten ist der gleiche Kamm acht Tage nach seiner Einführung zu sehen. Flecken mit neuem Wabenbau, gesunden, bebrüteten Larven und vermehrter Pollenspeicherung um die bebrüteten Zellen herum deuten darauf hin, dass ehemalige Sammlerinnen erfolgreich typische Aufgaben beim Nestbau und bei der Pflege übernommen hatten. Die Anreicherung von Lipofuszin, ein hochkonserviertes Merkmal der zellulären Seneszenz, wurde in verschiedenen Geweben altersgerechter Pflegebienen und Sammlerinnen bewertet.17 Tage Sammelaktivität führten zu einer signifikanten Vergrößerung der Lipofuscingranula. Diese deutliche Zunahme der Lipofuszinansammlung und der Granulagröße war mit langen Sammeldauern verbunden, wie mit Pfeilen in D dargestellt. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es äußerst wichtig, die Arbeiterinnentypen direkt zu identifizieren. Zum Beispiel sollte eine fehlerhafte Identifizierung sammelnder Bienen vermieden werden, indem die Markierung von Bienen während täglicher Phasen mit Orientierungsflügen unterlassen wird, in denen sich die Bienen noch im Vorsammelstadium befinden.Die Bienen werden gemäß unserer Verfahrensweise den Stock verlassen oder betreten. Andere Methoden wie die Proteomik und Transkriptomik können durchgeführt werden, um molekulare Merkmale der flexiblen Alterung zu identifizieren.

obtaining-specimens-with-slowed-accelerated-reversed-aging-honey-bee

Research

Forschung

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Biology

Biologie

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