Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die synaptischen und erregbaren Eigenschaften von embryonalen Zebrafischen zu erfassen, die ihre Zellen munden. Dazu wird zunächst der Zebrafischembryo präpariert, um die ventrale Oberfläche des Hinterhirns freizulegen. Der zweite Schritt besteht darin, das präparierte Präparat auf den Tisch eines Patch-Clamp-Mikroskops zu legen und den Mund in ihren Zellen zu identifizieren.

Nächster Patch. Mit dem entsprechenden Aufnahmemodus auf die M-Zellen klemmen und synaptische Aktivität und Erregbarkeitseigenschaften aufzeichnen. Der letzte Schritt besteht darin, die aufgezeichneten Daten zu analysieren, um synaptische oder Erregbarkeitseigenschaften zu ermitteln.

Letztendlich wird das Patch-Clamping von diesen Zellen verwendet, um die Eigenschaften von synaptischen Rezeptoren in einem sich entwickelnden Organismus zu zeigen. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, zwei Hauptschwierigkeiten. Die erste ist das Sezieren.

Die zweite Formation der Gig-Szene kann eine Herausforderung sein. Ich hatte die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als ich mich entschied, an einem Zebrafischpräparat zu arbeiten, bei dem das Hinterhirn mit dem Rückenmark verbunden war, um zu demonstrieren, dass das Verfahren Burram Roy, ein Doktorand in meinem Labor, sein wird. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die mit Sarde ausgekleidete Sezierschale vorbereiten. Befestigen Sie zuerst die Unterlegscheiben mit Fett an der Rutsche.

Geben Sie dann flüssigen Sard in die Mitte der Waschmaschine. Die Sarde härtet in der Regel über Nacht aus und bildet ein kleines kreisförmiges Bett auf dem Objektträger, das zum Boden der Präparierschale wird. Nachdem Sie ein Deckglas auf das Dia gelegt haben, legen Sie das Dia in die Aufnahmekammer, um es als Basis für das Sezieren zu verwenden.

Bereiten Sie anschließend die erforderlichen Lösungen vor. Die extrazellulären Lösungen sollten bei Raumtemperatur belassen werden, während intrazelluläre Lösungen steril gehalten werden sollten. Man kann der intrazellulären Lösung auch 0,1 % Lose für Gelb hinzufügen, so dass am Ende des Experiments eine Visualisierung der M-Zell-Morphologie durchgeführt werden kann, um die Zellidentität zu bestätigen.

Als nächstes werden die Wildtyp-Zebrafischembryonen in 28,5 Grad Celsius warmem Eiwasser aufgezogen und gemäß der vorherigen Veröffentlichung entnommen und bereitgestellt. Zum Sezieren werden die Embryonen in die Präparierschale gebracht, die auch als Aufnahmekammer dient. Betäuben Sie sie dann für sieben bis 10 Minuten.

In einer betäubenden Salzlösung, die der physiologischen Kochsalzlösung sehr nahe kommt, kann man feststellen, ob sie ausreichend betäubt sind, indem man die Reaktion auf ein sanftes Einklemmen des Schwanzes untersucht. Anschließend stecken Sie die Embryonen durch den No Accord und mit 0,001 Zoll Wolframdraht unter einem Präpariermikroskop mit 25-facher Vergrößerung auf die SIL-Schutzlinienschüssel. Stellen Sie die Vergrößerung am Präparierfernrohr auf 40 bis 50 x ein, um das Präparieren durchzuführen.

Entfernen Sie nun die Kieferaugen und das Vorderhirn mit einer feinen Pinzette. Schälen Sie das Hinterhirn vorsichtig vom darunter liegenden Knotenstrang ab, indem Sie die Pinzette vorsichtig zwischen dem Knotenstrang und dem Gehirn bewegen. Drehen Sie dann das Hinterhirn vorsichtig um, so dass die Bauchfläche nach oben zeigt.

Diese Positionierung ermöglicht einen guten Zugang zu den M-Zellen, die sich bei jungen Embryonen in der Regel innerhalb von fünf bis 10 Mikrometern und bei älteren Larven innerhalb von 20 bis 50 Mikrometern von der ventralen Oberfläche befinden. Verschieben Sie als Nächstes die Vorbereitung vorsichtig in das Aufnahme-Setup, wo das Patch-Clamp-Experiment durchgeführt werden kann. Die M-Zellen werden mit differentiellem Interferenzkontrast visualisiert, obwohl auch andere Bildgebungsmodi zur Vorbereitung des Patch-Clampings verwendet werden können.

Beginnen Sie damit, einige Patch-CLA-Pipetten mit dünnwandigem Bo-Silikatglas zu ziehen. Bei einem horizontalen Zug betragen die Durchmesser der Pipettenspitze nach dem Brandpolieren etwa 0,2 bis 0,4 Mikrometer zu einer glatten Kante, und der Schaftkegel ist etwa vier Millimeter lang. Füllen Sie die Pipettenspitze mit intrazellulärer Lösung, indem Sie die Spitze in die intrazelluläre Flüssigkeit tauchen.

Führen Sie dann eine Spritzennadel in die Pipette ein und stoßen Sie die intrazelluläre Lösung vorsichtig aus der Spritze aus. Um die Pipette fertig zu befüllen, befestigen Sie die Pipette am Verstärkerkopftisch. In der Elektrophysiologie ist es wichtig, den Kopftisch in einem Winkel von etwa 45 Grad zur horizontalen Achse zu halten, da dies einen Eintrittswinkel für die Pipette gewährleistet, der für die Bildung von hochbeständigen Dichtungen mit dem Mund in ihrer Zelle geeignet ist, kurz bevor sich die Pipette in die Badlösung senkt. Üben Sie eine kleine Menge Überdruck auf die Pipette aus, um die Wahrscheinlichkeit eines Blockierens der Spitze zu verringern. Nähern Sie sich der M-Zelle weiter mit einem kleinen Überdruck in der Pipette.

Durch den Überdruck wird die Zelle sanft von einer Seite zur anderen geschoben, und wenn sie unmittelbar über der Zelle positioniert wird, bildet sich ein kleines Grübchen auf der Zellmembran. Lassen Sie nun die Pipette einige Sekunden an Ort und Stelle, um die Zelloberfläche sanft zu reinigen, damit eine starke Abdichtung zwischen Pipette und Membran gebildet werden kann. Lassen Sie dann den Überdruck in der Pipette ab, um die Versiegelung einzuleiten.

Ein geringer Unterdruck in Verbindung mit einem negativen Pipettenpotenzial führt dazu, dass sich innerhalb weniger Sekunden Giga-Dichtungen bilden. Ändern Sie anschließend das Haltepotenzial im Verstärker auf minus 60 Millivolt. Reißen Sie die Zellmembran mit einer Reihe kurzer Saugimpulse auf.

Erfassen Sie dann sofort Membranpotentiale und minimieren Sie Kapazitätsartefakte. Kompensieren Sie die Zellkapazität und den Zugangswiderstand um 70 bis 85 %Der Zugangswiderstand sollte alle 30 Sekunden bis zu einer Minute überwacht werden, und wenn es eine Änderung von 20 % oder mehr gibt, brechen Sie das Experiment ab. Sobald das Experiment beendet ist und genügend Daten gesammelt wurden, opfern Sie den Embryo, indem Sie das Hinterhirn mit einer Pinzette entfernen.

Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Aufzeichnungen von exzitatorischen A-MPA- und NMDA-Rezeptorströmen, die von 48 HPF-Embryonen gewonnen wurden. Hier sind die spontanen A MPA ME PSCs, die von einer M-Zelle bei einem Haltepotential von minus 60 Millivolt aufgezeichnet wurden. Und das sind die durchschnittlichen ME PSCs.

Hier sind die spontanen A MPA und NMDA me PSCs, die von einer M-Zelle bei einem Haltepotential von 40 Millivolt aufgezeichnet wurden. Und dies ist der durchschnittliche ME PSCs, Glutamat me PSCs wurden in Gegenwart von einem mikromolaren TTX zur Blockierung von Aktionspotentialen, fünf mikromolaren strengen neun und 100 mikromolaren Ritoxin zur Blockierung des Auftretens von Glycin und G aufgezeichnet. Hier sind die spontanen MI-PSCs, die von einer M-Zelle bei einem Haltepotential von minus 60 Millivolt aufgezeichnet wurden.

Und die durchschnittlichen MI PSCs MI PSCs wurden in Gegenwart von einem mikromolaren TTX aufgezeichnet, um Aktionspotentiale zu blockieren. Ein Millimolar Chimäre Säure zur Blockierung der Glutamatrezeptoraktivität und 10 Mikromolare durch Qing zur Blockierung des GABA-Auftretens. Dies sind die Aktionspotentiale, die von einer M-Zelle in dieser speziellen Zelle aufgezeichnet werden.

Ein SRA-Schwellenstimulus von 0,48 Nanoampere löste mehrere Aktionspotentiale aus, aber ein Stimulus bis zur Schwelle führt nur zur Erzeugung eines einzigen Aktionspotentials. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Clamp-Aufzeichnungen von M-Zellen und anderen retikulären Spinalneuronen in Zebrafischembryonen patcht.