Name: Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Bildgebung synaptischer Vesikel-Recycling mit Styryl-FM-Farbstoffen in Nervenendigungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung sowohl evozierter als auch spontaner synaptischer Aktivitäten.

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Harata für die Diskussionen während der Ausführung dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der American Heart Association, der Dystonie Medical Research Foundation, die Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, der National Science Foundation und der Whitehall-Stiftung finanziert NCH

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir haben Protokolle für Färben und Entfärben synaptischen Vesikeln in Reaktion auf evozierte, spontan und Miniatur synaptische Aktivität und für die Bildgebung bei der Entfärbung Phase beschrieben. Zusätzlich zu den bestehenden Protokollen, haben wir ein neues Protokoll der Beobachtung der FM Entfärben basierend auf Miniatur synaptische Aktivität enthalten. Mit Hilfe dieser Protokolle, bisher haben wir Anomalien in kultivierten Neuronen aus einem Maus-Modell der Bewegungsstörung Dystonie identifiziert. Im Vergleich zu ...

Die Funktionalität der synaptischen Vesikeln ist eine wichtige Determinante der synaptischen Übertragung. Diese Vesikel Neurotransmitter freisetzen, wenn sie mit der präsynaptischen Plasmamembran (Exozytose) fusionieren, und sie werden, nachdem sie von der Plasmamembran (Endozytose) regeneriert und neu geladen mit Neurotransmitter bereit für einen weiteren Zyklus der Veröffentlichung. Erforschung der Mechanismen und Dynamik der synaptischen Vesikel Recycling Basiswert hat durch die Einführung von Styryl-Farbstoffe FM 1 beschleunigt. Diese amphipathische Moleküle, die (in 1A, stereo von FM1-43 in Figur 1B mehrere Farbstoffe) positiv geladen sind hydrophile Kopfgruppen und hydrophoben Schwänze, reversibel ein-und aussteigen, ohne Lipidmembranen durchdringt sie. Gruppen FM Farbstoffe haben ähnliche Funktionen, die das Spektrum des Lichts, das sie aussenden beeinflussen. Zum Beispiel, FM2-10, FM1-43 und FM1-84 haben eine Doppelbindung zwischen zwei zyklischen Verbindungen und show grüne Emission. Der Unterschied zwischen ihnen ist die Länge der hydrophoben Schwanz, der seine Hydrophobie bestimmt und daher die Rate des Austritts aus der Membran (departitioning). In den Fällen des FM5-95 und FM4-64, drei Doppelbindungen verbinden die zyklische Verbindungen, und sie rote Emission zeigen. Diese Farbstoffe unterscheiden sich in ihrem hydrophilen Teile. In allen FM-Farbstoffe, die Fluoreszenzintensität erhöht, wenn sie in biologischen Membranen eingesetzt, aufgrund einer Erhöhung der Quantenausbeute in der hydrophoben Umgebung relativ zu dem hydrophilen Umgebung. So werden die Veränderungen in der FM-Intensität stellen die Veränderungen in der Membran Umsatz. Die verschiedenen Farben (Emissionsspektren) und Hydrophobien machen das FM färbt ein vielseitiges Forschungsinstrument in der synaptischen Vesikel-Recycling. Basierend auf diesen Merkmalen werden die FM-Farbstoffe meist nach dem folgenden Schema bei der Analyse der synaptischen Vesikel-Recycling (Fig. 2) verwendet. Neurons sind in einer extrazellulären Lösung, die das FM Farbstoff getaucht, so dass es in die synaptischen Vesikel (SV) genommen werden, da sie über Endozytose (Färbung) zu bilden. Der Farbstoff wird dann durch Aufbringen einer farbstofffreien extrazellulären Lösung gewaschen, dies zeigt die funktionelle Nervenenden, dh nur die aktiv Endozytose wird eine Gruppe von synaptischen Vesikeln, die mit dem Farbstoff (Fig. 2 unten) beladen sind, enthalten. Anschließende Exozytose führt zum Verlust des FM-Farbstoff an den extrazellulären Raum und einem gleichzeitigen Verlust der Fluoreszenz (Entfärbung, sowohl wegen der departitioning zu einer hydrophilen Umgebung und Diffusion weg vom Ort der Exozytose). Daher sind die Veränderungen in der Fluoreszenzintensität FM sind Indikatoren für die synaptischen Vesikel Exo-und Endozytose. FM-Farbstoffe werden verwendet, um zu färben und entfärben die synaptischen Vesikeln in verschiedenen Organismen und Zubereitungen 2,3. Beispiele sind Säugetier neuronal Kulturen 4-9, Säugetiergehirnscheiben 10,11, 12,13 neuromuskulären Verbindungen, Netzhaut bipolaren Neuronen 14,15 und Haarzellen der Cochlea 16. Typischerweise in solchen Experimenten werden sowohl Färbung und Entfärbung von extensiv Stimulierung der Neuronen (evozierte Aktivität) ausgelöst. Kürzlich jedoch synaptischen Vesikel-Recycling in Reaktion auf schwache Stimulation wurde auch untersucht, ebenso wie das Recycling in Abwesenheit eines externen Stimulus (spontan und Miniatur synaptische Aktivität) 9,17-19. Spontanen und Miniatur synaptischen Aktivitäten als diejenigen, die in der Abwesenheit von externen Stimuli auftreten definiert, wobei erstere mit der spontanen Zündung von Aktionspotentialen (Fig. 3). Diese schwachen synaptischen Aktivitäten werden mit kleineren Änderungen in der FM-Signale als die von umfangreichen Stimulation ausgelöst verbunden. Die Messung erfordert, daß die Veränderungen in der FM fluoreszierReferenzintensität genau widerspiegeln synaptischen Vesikel Endozytose oder Exozytose aber nicht artifactual Änderungen in der Intensität. Eine Ursache des Artefakts ist die Anwesenheit von nicht-spezifische Färbung der Plasmamembran durch FM-Farbstoffe. Schrittweise Auswaschung dieser Komponente wird zu einer allmählichen Veränderung der Fluoreszenzintensität gemessen, die fälschlicherweise synaptischen Aktivitäten zugeschrieben wird, zu führen. Dieser Faktor kann durch geeignete Methoden reduziert werden (siehe Protokoll). Die wichtigste Ursache des Artefakts ist das Bleichen von FM-Farbstoff in synaptischen Vesikeln erhalten. Die Photobleaching bedingte Veränderungen FM Intensität im Vergleich zu den biologischen (synaptischen) Änderungen, die gemessen werden klein sein. Die jüngste Entwicklung von empfindlichen Kameras, z. B. die Elektronenvervielfachungsladungsgekoppelte Vorrichtung (EM-CCD)-Kamera, ist es möglich, zu minimieren Bleichen durch Verkürzen Belichtungszeit und die Schwächung der Intensität des Lichts verwendet werden, um die Fluorophore anzuregen. Eine weitere Ursache des Artefakts ist eine Drift in die Fokussierung Niveau der Lichtmikroskop. Die Fokusdrift während eines Bildgebungssitzung kann durch mechanische oder thermische Effekte verursacht werden, und fälschlicherweise zu einer Änderung in der gemessenen Fluoreszenzintensität führen. Hier beschreiben wir Protokolle und Geräte, die es möglich, UKW-Farbstoffe verwenden, um synaptische Vesikel-Recycling auch im Rahmen von schwachen oder gar keine Stimulation zu analysieren, insbesondere das Miniatur synaptische Aktivität zu machen. Wir zeigen Beispiele für die Färbung und Entfärbung von Vesikeln während evozierte und spontane synaptische Ereignisse, mit kultivierten Hippocampus-Neuronen Nagetier, und die Abbildung der Entfärbung Phase. Wir zeigen auch, wie der Grad der FM Farbstoff Bleichen zu bewerten, in Abwesenheit von jedem FM-Farbstoffverlust durch synaptische Aktivitäten.

<table><tbody><tr><td>Pulsgeber</td><td>AMPI</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/" target="_blank"&gt;Isolierter Stimulator&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds3-isolated-constant-current-stimulatorstimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS3&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Invertiertes Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Dies dient zur Beurteilung der Zellmorphologie bei geringer Vergrößerung.</td></tr><tr><td>Invertiertes Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TiE</td><td>Dies dient der hochauflösenden Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskopie mit minimalem Fokusdrift.</td></tr><tr><td>Objektivlinse</td><td>Nikon</td><td></td><td>Es wird eine Wassereintauchlinse empfohlen. Eine Öleintauchlinse kann verwendet werden, sofern die abgebildete Struktur nicht tief unterhalb der Deckglasoberfläche liegt.&lt;i&gt;z. B.&lt;/i&gt; &gt;10 &amp;mu;m).</td></tr><tr><td>Filterkassette</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>490/20-nm Ex, 510-nm DCLP, 520-nm-LP Em für FM1-43</td></tr><tr><td>Filterblock</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>490/420 nm Exzitation, 510 nm dclp, 650 nm LP Emission für FM4-64.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EMCCD-Kamera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon EM+ DU-860</td><td>Diese EMCCD-Kamera wird zur hochsensitiven Detektion von Fluoreszenz eingesetzt.</td></tr><tr><td>Flüssigkeits-Umwälzkühler</td><td>Festkörperkühlsysteme</td><td>Oasis 160</td><td>Dies dient dazu, die Kamera kontinuierlich mit gekühltem Wasser zu perfundieren, um eine Temperatur von -80&amp;deg;Cund dadurch das Rauschen reduzierend.</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED–Benutzerdefinierte Anschlusslösung</td><td>490 nm</td><td>Diese Lichtquelle dient der schnellen Ein-/Aus-Steuerung der Fluoreszenzanregung.</td></tr><tr><td>Software zur Bildaufnahme</td><td>Andor Technology</td><td>Solis</td><td></td></tr><tr><td>Abbildungskammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td></td></tr><tr><td>Schnelles Perfusionsystem</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>D,L-AP5</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0106</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1069</td><td>Achtung: toxisches Reagenz. Vorsichtig handhaben.</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd-fixierbares FM1-43 (FM1-43FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd-fixierbares FM4-64 (FM4-64FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; ausgeglichenes Salz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td>Diese Lösung enthält kein Phenolrot, das die Fluoreszenzbildgebung stören könnte.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Achtung: toxisches Reagenz. Vorsichtig behandeln.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr></tbody></table>

die untersuchung der synaptischen vesikel recycling verwenden des ukw-farbstoffe während evozierte, spontan, und miniatur synaptic aktivitäten

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptische Vesikel in Nervenfunktionsterminals unterziehen Exozytose und Endozytose. Diese synaptischen Vesikel-Recycling kann mit FM Styryl-Farbstoffe, die Membran Umsatz offenbaren effektiv analysiert. Herkömmliche Protokolle für die Verwendung von FM-Farbstoffe wurden für die Analyse von Neuronen nach stimulierte (hervorgerufen) synaptische Aktivität entwickelt. Kürzlich Protokolle werden für die Analyse der FM-Signale, die schwächer synaptischen Aktivitäten, wie spontane oder Miniatur synaptischen Ereignisse begleiten verfügbar. Analyse dieser kleine Änderungen in FM-Signale erfordert, dass das Abbildungssystem ist empfindlich genug, um kleine Änderungen in der Intensität zu erfassen, doch ist ein Artefakt Änderungen mit großer Amplitude unterdrückt werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll, die angewendet werden, um hervorgerufen, spontan, und Miniatur-synaptischen Aktivitäten, und verwenden Sie kultivierten Hippocampus-Neuronen als Beispiel werden. Dieses Protokoll enthält auch ein Mittel zur Bewertung der Rate der Photobleichung des FM-Farbstoffe, da dies eine erheblicheQuelle von Artefakten bei der Abbildung von kleinen Änderungen in der Intensität.

Als Beispiel zeigen wir repräsentative Ergebnisse für die Entfärbung Zeitverlauf der synaptischen Vesikel (Abbildung 4). Hippokampalen Neuronen wurden mit FM4-64 angefärbt mit der spontanen synaptischen Aktivität (Schritt 2.3) und mit Farbstoff-freie Lösung (Spüllösung 2) gewaschen. Die Abbildungs ​​zeigt die Anfangs Entfärben Zeitverlauf mit Spontanaktivität (Schritt 5.3) (Anfangsteil der durchgehenden Linie, 4A). Dies wird durch die Entfärbung Zeitkurs mit drei Runden der evozierten A...

Wir beschreiben die Verwendung von Styryl FM Farbstoffe Bild synaptischen Vesikel-Recycling in der funktionellen Nervenenden. Dieses Protokoll kann nicht nur beschworen, sondern auch spontan und Miniatur synaptischen Tätigkeiten angewendet werden. Das Protokoll erweitert die Vielzahl von synaptischen Ereignisse, die effektiv ausgewertet werden können.

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Fähigkeit, die Kinetik der Vesikelfreisetzung messen kann helfen, einen Einblick in einige der Grundlagen der Neurotransmission. Hier haben wir Echtzeit-Bildgebung von Vesikeln mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff FM 4-64 markiert, um die Rate der präsynaptischen Vesikel Release in Hippocampus-Neuronen Kulturen zu messen.

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

FM Farbstoffe haben eine unschätzbare Hilfe für das Verständnis der synaptischen Dynamik worden. FMs sind in der Regel unter dem Fluoreszenzmikroskop bei unterschiedlichen Bedingungen Stimulation gefolgt. Allerdings ermöglicht Photokonversion FM Farbstoffe mit Elektronenmikroskopie kombiniert die Visualisierung verschiedener synaptischer Vesikel-Pools, unter anderem Ultrastruktur Komponenten in synaptischen boutons.

Studium synaptischer Vesikel Pools mit Photokonversion Styrylfarbstoffe

Eine Live-Fluoreszenz-Imaging-Technik, um den Nachschub und die Mobilisierung der spezifischen synaptischen Vesikel (SV)-Pools in zentralen Nervenendigungen quantifizieren beschrieben. Zwei Runden SV Recycling sind in der gleichen Nervenenden Bereitstellung eines internen Kontrollsystems überwacht.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Untersuchung des synaptischen Vesikelrecyclings an neuromuskulären Verbindungen in Channelrhodopsin-exprimierenden Drosophila-Larven unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs. Blaues Licht aktiviert die Kanalrhodopsine, was zu Kalziumeinstrom und synaptischer Vesikelexozytose führt. Der Farbstoff integriert sich in die neuronalen Membranen und wird während der Endozytose internalisiert, was zu einer verstärkten Fluoreszenz führt. Eine weitere...

Analyse des synaptischen Vesikelrecyclings und der Aufnahme von Fluoreszenzfarbstoffen in Drosophila-Larven

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen unter Verwendung eines Synaptobrevin2-pHluorin-Konstrukts und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Auch über die entwickelte Strategie für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wird berichtet.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Synaptischen Vesikel Endozytose wird durch Lichtmikroskopie pHluorin verschmolzen mit synaptischen Vesikel Protein und Elektronenmikroskopie der Vesikel Aufnahme erkannt.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

Synaptischen Vesikel (SV) Radfahren ist der Kern-Mechanismus der interzellulären Kommunikation bei neuronalen Synapsen. FM-Farbstoff-Aufnahme und Veröffentlichung sind die Primärmittel des quantitativ prüfen SV Endo- und Exozytose. Hier vergleichen wir alle stimulationsmethoden FM1-43 Radfahren an der Drosophila neuromuskulären (NMJ) Modell Synapse zu fahren.

FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Die neuromuskuläre Verbindung der Zebrafischlarve ist ein attraktives Modell für die Untersuchung der synaptischen Physiologie. Es ist für viele experimentelle Techniken zugänglich, einschließlich Elektrophysiologie und optischer Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Abbildung der synaptischen Übertragung mit einer pHluorin-basierten Sonde unter einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop.

Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

Erfahren Sie die Bildgebung synaptischer Vesikel-Recycling mit Styryl-FM-Farbstoffen in Nervenendigungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung sowohl evozierter als auch spontaner synaptischer Aktivitäten.

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten (Video) | JoVE Journal

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

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