PCR: Die Polymerase-Kettenreaktion

PCR: The Polymerase Chain Reaction

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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PCR: The Polymerase Chain Reaction

2.2: Passaging Cells

2.4: DNA Gel Electrophoresis

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13:27 min

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April 30, 2023

Overview

Die Polymerase-Kettenreaktion, oder PCR, ist eine Methode, bei der DNA durch das sogenannte Thermocycling – also das wiederholte verändern der Temperatur für einen bestimmten Zeitraum – amplifiziert werden kann. Durch die Benutzung einer thermostabilen DNA-Polymerase kann das PCR viele Kopien der DNA, von den DNA Bausteinen, die Deoxy-Nukleotidtriphosphaten, oder dNTPS, genannt werden, herstellen. Es gibt 3 Schritte in einem PCR: die Denaturierung, Hybridisierung, und Elongierung. Die Denaturierung ist der erste Schritt in dem Zyklus und bewirkt, dass die DNA durch die Unterbrechung der Wasserstoffbrückenbindungen schmilzt und dadurch Einzelstrang-DNA entsteht. Bei der Hybridisierung wird die Temperatur verringert, sodass sich die Oligonukleotidprimer an die Template-DNA binden können. Bei dem Elongierungsschritt synthetisisert die DNA Polymerase die neue, doppelsträngige DNA.

Dieses Video gibt eine Einführung in das PCR Verfahren. Wir beschreiben die grundlegenden Prinzipien des PCRs und geben eine Schritt für Schritt Anleitung, um eine allgemeine PCR Reaktion anzusetzen. Das Video beschreibt außerdem die benötigten Komponenten, zeigt wie Primer entworfen werden, und gibt nützliche Hinweise, um eine erfolgreich PCR Reaktion anzusetzen.

Procedure

Die Polymerase-Kettenreaktion, oder PCR ist eine häufig angewandte Methode, um DNA Fragmente zu vervielfältigen. Das PCR beruht auf der Thermocycling-Methode, bei der die Reaktionen wiederholt auf drei verschiedene Temperaturen, die Denaturierung, Hybridisierung und Elongierung genannt werden, erhitzt und abgekühlt werden.

Die PCR Reaktion beginnt, wenn alle PCR Reagenzien in die Thermocycler Maschine platziert werden, die programmiert ist, um die Reaktion präzise zu erhitzen und abzukühlen.

Der PCR Zyklus beginnt mit der Denaturierung, die bei 95°C für 20-30s, also deutlich über dem Schmelzpunkt der DNA, ausgeführt wird. Der Schmelzpunkt ist der Zustand, in dem die Hälfte der DNA eine Doppelstrang-Helix, und die andere Hälfte ein Einzelstrang-„Random Coil“ ist.

Die Denaturierungstemperatur liegt weit über dem Schmelzpunkt, um sicherzustellen, dass alle Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren gebrochen sind, und dass nur Einzelstrang-DNA vorhanden ist. Die beiden Einzelstränge werden Leitstrang und Folgestrang genannt. Die Sequenz des Leitstrangs ist identisch mit der mRNA, die letztendlich das Protein kodiert.

Wenn die DNA von links nach rechts gelesen wird, beginnt sie mit einer 5’ Phosphatgruppe und endet mit einer 3’ Hydroxylgruppe. Der Folgestrang wird auch der komplimentäre Strang genannt, und beginnt mit einer 3’ Hydroxylgruppe und endet mit einer 5’ Phosphatgruppe, wenn er von links nach rechts gelesen wird.

Im zweiten Schritt, der Hybridisierung, binden sich kurze Stücke von DNA, die auch Primer genannt werden, mittels Wasserstoffbrückenbindungen an Leit- und Folgestrang. Der Primer, der den Folgestrang bindet, hat die gleiche Sequenz wie der Leitstrang und ist daher der Vorwärtsprimer. Der Primer, der den Leitstrang bindet, ist umgekehrt komplementär zu dem Leitstrang und ist deshalb der umgekehrte oder Rückwärtsprimer. Abhängig von der Länge des Primers liegt die Hybridisierungstemperatur für diesen Schritt normalerweise 3-5°C unter dem Schmelzpunkt der beiden Primer. Die Hybridisierung findet normalerweise zwischen 50 und 65°C statt und dauert 20-40 Sekunden.

Wenn die Primer an die DNA binden, starten sie die Reaktion, weil sie der Polymerase, einem Enzym, das die DNA repliziert, eine 3’ Hydroxylgruppe zur Verfügung stellen.

Der nächste Schritt wird Elongation genannt und passiert normalerweise bei 72°C, was optimal für die Polymeraseaktivität ist. Wenn sie erst einmal gebunden ist, fängt die Polymerase an freie Deoxy-Nukleotidtriphosphate, oder dNTPs, an das Ende des Primers, eines nach dem anderen von der 5’ in die 3’ Richtung anzufügen, um doppelsträngige DNA herzustellen.

Wenn die Elongation abgeschlossen ist, kann ein neuer Zyklus beginnen. In dem nächsten Zyklus binden sich die Primer an die Einzelstrang-DNA, die bei der vorherigen Elongation entstanden ist. Das kurze Fragment, das man amplifizieren will (welches auch als Amplikon bezeichnet wird) wird letztendlich gebildet, indem die Polymerase mit dem Vorwärtsprimer einen DNA Strang ausgehend von der durch den Rückwärtsprimer entstandenen Amplifikation bildet, oder umgekehrt. Wenn es erstmal hergestellt wurde, erhöht sich die Menge an Amplikon exponentiell in den folgenden Zyklen. Abhängig von dem Ziel der Reaktion werden 20-40 Zyklen benötigt.

Für lange Amplikons wird der letzte Elongationsschritt normalerweise bei 72°C für 5-15 Minuten ausgeführt, um sicherzustellen dass die DNA doppelsträngig ist. Normalerweise wird ein letzter Halteschritt als Vorsichtsmaßnahme bei 4°C in den Thermocycler programmiert, damit die DNA stabil bleibt bis sie aus dem Thermocycler entnommen wird.

Das PCR benötigt einige wichtige Reagenzien. Zuerst braucht man „Template“-DNA, also eine DNA Probe von der ein Fragment amplifiziert werden soll. Dann sind da natürlich noch die Primer, also die kurzen Stücke DNA oder Oligonukleotiden, welche die Reaktion starten.

Beim Aussuchen der Primer gibt es einiges zu beachten. Erstens müssen sie komplementär zu den 5’ und 3’ Regionen der Template-DNA sein, welche die zu amplifizierenden Sequenzen flankieren. Zweitens sollten sie zwischen 15 und 30 Basen lang sein und aus ca. 50% Guanin und Cytosin bestehen. Drittens sollten die Schmelzpunkte der Primer über 50°C Celsius liegen und nur etwa 1 oder 2 Grad voneinander abweichen, damit sie beide effizient bei der Hybridisierungtemperatur binden können. Viertens können sie nicht komplementär mit sich selbst sein und dadurch miteinander hybridisieren. Und fünftens sollten sie keine Sekundärstruktur enthalten, die entsteht wenn ein Primer intern hybridisiert.

Zusätzlich zu den Primer und der Template-DNA ist die DNA Polymerase wichtig für die PCR Reaktion. Das Enzym, das häufig für die PCR benutzt wird, heißt Taq Polymerase und ist ein thermostabiles Enzym, das von dem Bakterium Thermus aquaticus, welches in heißen Quellen zu Hause ist, isoliert worden ist. Die Taq Poymerasen können Temperaturen von mehr als 90°C widerstehen.

Deoxy-Nukleotidtriphosphate, oder dNTPs, welche die Basenpaare in den wachsenden Strängen darstellen, müssen auch noch zu der Reaktion hinzu gefügt werden. Ein Reaktionspuffer, der den pH-Wert beibehält und wichtige Ionen wie Mangan, Magnesium und Kalium bereitstellt, ist außerdem wichtig, um die Reaktion zu stabilisieren und wichtige Kofaktoren für das Polymerase-Enzym bereit zu stellen. Wie alle Reaktionen, benötigt man für das PCR auch ein Lösungsmittel: man benutzt PCR-Grad Wasser, das keine Ionen enthält, welche die Reaktion hemmen können.

Bevor man mit dem PCR beginnt, sollte man sicherstellen, dass die Arbeitsumgebung sauber ist, um eine Kontamination zu vermeiden. Handschuhe müssen immer getragen werden.

Man sollte eine Tabelle mit Reaktionsvolumen und Konzentrationen anfertigen, um einen Überblick über die verschiedenen Bestandteile der Reaktion, die man braucht, einschließlich der Kontrollen, zu behalten. Eine typische Reaktion sollte die folgenden Komponenten enthalten: 5µl eines 10X Reaktionspuffers, 4µl von 25mM MgCl2, 1µl von 10mM dNTPs, 2µl des 50 ng/µl Vorwärts- und Rückwärtsprimers, und 0.3µl einer 5U/µl Taq Polymerase. Außerdem sollte man genug Template-DNA hinzugeben, um 100 ng in der Reaktion zu erreichen. Die meisten PCR Reaktionen werden bei einem 50 µl Volumen durchgeführt. Das heißt spezielles Wasser für die PCR Reaktion muss hinzugefügt werden, um ein Endvolumen von 50µl zu erreichen.

Wenn die Reaktion auf dem Papier geplant wurde, kann man die Reagenzien auf Eis zusammenstellen.

Danach gibt man die Reagenzien in PCR-Reaktionsgefäße. Zuerst gibt man das Wasser hinzu, dann die Template-DNA, die Primer, den Puffer, das Magnesiumchlorid, die dNTPs und zu letzte die Taq Polymerase. Danach mischt man die Reaktion gründlich.

Wenn die Reaktion fertig angesetzt ist, platziert man sie in den Thermocycler und startet das PCR-Programm. Nur kurz erwähnt: die Maschine besteht aus einem Thermoblock, wo die PCR-Reaktionsgefäße oder die Platte eingesetzt werden und wo sie den genauen Temperaturänderungen ausgesetzt sind. Außerdem gibt es eine beheizte Abdeckung, durch welche Kondensation vermieden wird, sodass keine Probe verloren geht, und ein Display, mit dem man die PCR Temperaturen und Zeitdauern programmiert. Man sollte das Programm immer schon vor dem Ansetzen der PCR Reaktion programmiert haben.

Nachdem der Thermocycler fertig ist, nimmt man die Reaktionen heraus und sieht sich das PCR Produkt mittels Gel-Elektrophorese an. Wenn das PCR erfolgreich war, sollte man ein Amplikon auf der richtigen Basenpaargröße sehen.

Nun geben wir einige nützliche Hinweise für ein erfolgreiches PCR Experiment. Wenn man versucht, das selbe PCR-Produkt von verschiedenen Template-DNAs zu erhalten, hat man normalerweise viele Reaktionen anzusetzen. Dabei kann es nützlich sein einen Mastermix vorzubereiten. Der PCR-Mastermix ist im Prinzip eine Mischung von großem Volumen, die alle Reagenzien enthält, die gleich für die verschiedenen Proben sind, und dann in verschiedene PCR-Reaktionsgefäße aufgeteilt wird.

Die meisten PCR Reaktionen fangen mit einem ersten Denaturierungsschritt an, der normalerweise bei 95°C für 1-9 Minuten stattfindet. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Template-DNA als Einzelstrang für den ersten Amplifikationszyklus bereit steht.

Oft kann es vorteilhaft sein eine Laborbank speziell für PCR zu benutzen um eine Reaktion anzusetzen, speziell dann wenn das Risiko einer Kontamination hoch ist. Um zu schauen ob eine Probe kontaminiert ist, ist es wichtig eine Negativkontrolle ohne Template-DNA anzusetzen, von welcher kein PCR-Produkt auf dem DNA-Gel zu sehen sein sollte.

Das PCR muss oftmals durch das Einstellen der Temperaturen, der Magnesiumchloridkonzentration, oder durch neue Primer, optimiert werden. Wenn die Reaktion erstmal funktioniert, ist es außerdem eine gute Idee eine Kontroll-DNA anzusetzen, von welcher man weiß, dass ein Produkt entsteht.

Es existieren viele verschiedenen Anwendungen des PCRs für verschiedene Zwecke.

Bei einer Variation des PCR, dem sogenannten „Hotstart“-PCR, wird die Polymerase der Reaktion bis nach dem ersten Denaturierungsschritt vorenthalten. Dadurch wird nicht-spezifische Amplifizierung unterbunden, die vor der Reaktion auftreten kann.

Ein PCR kann auch modifiziert werden, damit man mehrere DNA Sequenzen gleichzeitig amplifizieren kann. Hierfür verwendet man verschiedene Primer in der gleichen PCR Reaktion, was auch Multiplex-PCR genannt wird.

In Verbinding mit fluoreszenten Oligonukleotidproben kann das PCR eine Technik sein, mit der man die absoluten oder relativen Level der Genexpression messen kann, oder wieviel mRNA von einem bestimmten Gen oder einer Gruppe von Genen produziert wird. Diese Methode nennt man qPCR.

Das PCR kann auch benutzt werden, um die Anwesenheit einer speziellen DNA Sequenz in einem Organismus zu bestimmen. Dieses Verfahren wird auch als Genotypisierung bezeichnet. Zum Beispiel kann die Genotypisierung benutzt werden, um die Echtheit von Fischproben zu bestimmen. Dafür stellt man fest, ob eine speziesspezifische Sequenz in der Probe enthalten ist. Die Genotypisierung wird auch in der forensischen Analyse benutzt, um zu bestimmen, ob DNA an einem Tatort mit der DNA eines Verdächtigen übereinstimmt.

Das war die Einführung in das PCR von JoVE. In diesem Video haben wir uns angeschaut was ein PCR ist und wie es funktioniert, welche Komponenten man für das PCR benötigt, durch welchen Mechanismus das PCR DNA amplifizieren kann, und welche verschiedenen Anwendungen diese nützliche Methode hat. Danke für eure Aufmerksamkeit.

Transcript

The polymerase chain reaction or PCR is a widely used method for amplifying DNA fragments. PCR uses thermocycling, which is the repeated heating and cooling of the reaction via three distinct temperatures called denaturation, annealing and extension or elongation.

The thermocycling reaction begins once the PCR reagents are put into a thermocycler a machine, which is programmed to precisely heat and cool the reaction.

The PCR cycle begins with denaturation, which occurs for 20 to 30 seconds at 95 °C, well above the melting temperature of DNA. The melting temperature is a state where half of the DNA is a double stranded helix and the other is a single stranded random coil. The denaturation temperature is well above the melting temperature, in order to ensure that all the hydrogen bonds between complementary base pairs are broken yielding only single stranded DNAs. Paired single strands are termed the sense and antisense strands. The sequence of the sense, or coding strand, is identical to the sequence of mRNA, which will ultimately code for protein. Therefore, it makes sense. When read from left to right it begins with the 5’ phosphate and ends with the 3’ hydroxyl. The antisense strand is also called the complementary strand and begins with 3’ hydroxyl and ends with the 5’ phosphate when read from left to right.

In the second step, annealing, short pieces of DNA called primers, which are specific to the sense or antisense strands bind via hydrogen bonds. The primer that binds to the antisense strand and has the same sequence as the sense strand is the forward or sense primer. The primer that binds to the sense strand and has a sequence that is reverse and complementary to the sense strand is your reverse or antisense primer. Depending on the length of primers used the annealing temperature for this step is usually 3 to 5 °C below the lower melting temperature of your two primers. Annealing tends to occur between 50 and 65 °C and lasts for 20 to 40 seconds.

Once the primers bind to DNA they prime the reaction by creating a 3’ hydroxyl group end to which a polymerase, an enzyme that replicates DNA, will bind.

The next step called elongation or extension occurs at 72 °C, which is optimal for polymerase activity. Once bound the polymerase begins to add free nucleotide triphosphates, or dNTPs, to the ends of the primer one at a time in the 5’ to 3’ direction to make double stranded DNA.

Once elongation completes the next cycle begins. In the next cycle primers will bind to single stranded DNA formed via previous extension. The short fragment you are trying to amplify, the amplicon, will ultimately form when the polymerase extends from the forward primer on a strand that was generated by amplification from the reverse primer or vice versa. Once generated, the amount of amplicon will increase exponentially in subsequent cycles. Depending on the goal of your reaction, 20 to 40 cycles will be needed.

For long amplicons, a final elongation step is typically run at 72 °C for 5 to 15 minutes in order to ensure all DNA is double stranded. Usually, a final hold step at 4 °C is programmed into the thermocycler as a precautionary step to ensure that the DNA remains stable until taken out of the thermocycler.

The PCR reaction requires several key reagents. First is the DNA template, which is the DNA sample from which your fragment will be amplified. Then there are your primers, which are the short pieces of DNA or oligonucleotides that prime the polymerase reaction.

There are several important considerations that need to be taken when choosing your primers. First, they must be complementary to the 5’ and 3’ regions of your DNA template that flank the sequence you want to amplify. Second, they should be between 15 and 30 base pairs long and be comprised of about 50% guanines and cytosines. Third, the melting temperatures of both primers should be above 50 °C and within one to two degrees of each other so they can efficiently bind at the same annealing temperature. Fourth, they can’t be complementary to each other and form primer dimers. And fifth, they should not contain secondary structure, which is form by self-annealing within one of the primers.

In addition to the primers and DNA template, DNA polymerase is essential for the PCR reaction. The enzyme most commonly used in PCR is Taq polymerase, which is a thermostable enzyme isolated from the bacterium Thermus aquaticus that makes its home in hot springs. Taq polymerase can withstand temperatures greater than 90 °C.

dNTPs, which will comprise the base pairs in the growing strands, must also be added to the reaction. A reaction buffer, which maintains pH and contains important ions like manganese, magnesium and potassium, is also a necessary reaction component that stabilizes the reaction and provides important cofactors to the polymerase enzyme. Like all reactions, PCR needs a solvent, and so PCR grade water, which is free of ions that can inhibit the reaction, is used.

Before beginning the PCR make sure the working environment is clean to avoid contamination. Gloves must always be worn.

To help with keeping track of the various reaction components that you will need. Make a table of reagent volumes and concentrations for each of your samples including controls. In terms of volumes a typical reaction should contain 5μL of 10X reaction buffer, 4μL of 25 mM MgCl2, 1μL of dNTPs at 10 mM, 2μL of forward and reverse primers at 50 ng/μL, and 0.3μL of Taq polymerase at 5 U/μL. You want to add enough template so that 100 ng is present in the reaction. Finally, most PCR reactions are conducted in a total volume of 50μL. So a volume of PCR grade water must be used to ensure the total volume is indeed, 50μL.

Once your reaction is planned on paper assemble your reagents on ice.

Next, add your reagents to the PCR tube. First add water, then your template, your primers, buffer, magnesium chloride, and dNTPs, add Taq polymerase last and mix thoroughly.

After your reaction is setup place your sample in a thermocycler and start your PCR program. Briefly, parts of the machine consist of a thermoblock, where the PCR tube or plate is inserted and subject to precise temperature changes. A heated lid, which prevents condensation so no sample is lost and an interface with a display for programming PCR temperatures and cycle durations. Always setup your program before assembling the reaction.

Once the thermocycler has done its job. Take out your reaction and verify the PCR product with gel electrophoresis. If the PCR is successful, you should see the amplicon at the correct base pair size.

And now for some helpful hints when working with PCR. When you are trying to amplify the same PCR product from a number of different templates and therefore have a lot of different reactions to setup. It is useful to scale up the reaction to create a master mix. The PCR master mix is a large volume mixture of all the reagents shared among your samples, which is later distributed into multiple reaction tubes.

Most PCR reactions begin with an initial denaturation step, which occurs at 95°C for 1 to 9 minutes. This step ensures that all of the template is single stranded for the first amplification cycle.

Often it is desirable to use a PCR cabinet when the risk of contaminating your sample is high. To check for any contamination in your reaction it is beneficial to setup a negative control, which has no DNA template and shouldn’t produce a product in your DNA gel.

Often PCR must be optimized by adjusting temperatures, magnesium chloride concentration, or trying new primers. Once you have your PCR working. It’s a good idea to always run a positive control template, which you know will produce a product.

Many variations and applications of PCR exist for a variety of purposes.

One variation of PCR, hot start PCR, involves withholding the polymerase from the reaction until after the first denaturation step, which prevents nonspecific amplification that might occur before cycling.

PCR can also be modified to simultaneously amplify multiple DNA sequences by employing multiple primers in a single PCR reaction called multiplex PCR.

In combination with fluorescent oligonucleotide probes, PCR can actually become a technique that can measure relative or absolute levels of gene expression or how much mRNA is produced for a given gene or group of genes. This method is referred to as qPCR.

PCR can also be used to determine the presence of a particular DNA sequence in an organism. This procedure is referred to as genotyping. For example, genotyping can be used to determine the authenticity of fish samples by figuring out if a species specific sequence is present in the sample. Genotyping is also used in forensic analysis to determine if DNA found at the scene of a crime matches a suspect.

You’ve just watched JoVE’s introduction to PCR. In this video we reviewed what PCR is and how it works, the many components of the PCR reaction, the mechanism by which PCR can amplify DNA and the many variations and applications of this highly useful technique. Thanks for watching!

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PCR Polymerase Chain Reaction DNA Amplification Thermocycling Denaturation Annealing Extension Elongation Thermocycler Melting Temperature Double Stranded Helix Single Stranded Random Coil Sense Strand Antisense Strand MRNA Coding Strand Complementary Strand Primers