Cell Death mit Abnormal Mitose Assoziierte Beobachtet von konfokalen Imaging im Live Cancer Cells

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die zytotoxische Wirkung des Philanthridin-Derivats PJ 34 während der Mitose in multizentrischen somatischen menschlichen Krebszellen zu beobachten. Dies wird erreicht, indem Zentrosomen mit GFP-markiertem γ-Tubulin und Chromosomen mit H2B-mCherry durch Transfektion markiert werden. Das Ziel der Transfektion ist es, die Verfolgung der Migration und Aggregation der Zentrosomen sowie der Anordnung der Chromosomen während der Mitose in lebenden multizentrischen somatischen Krebszellen zu ermöglichen.

Im zweiten Schritt werden einige der transfizierten Zellen mit PJ 34 behandelt, einem Molekül, das als zusätzlicher Wirkstoff zur Entbündelung von Zentrosomen wirkt. Anschließend werden lebende, transfizierte Krebszellen mittels konfokaler Mikroskopie untersucht, um Ereignisse während der Mitose in Zusammenhang mit der Migration von Zentrosomen und Chromosomen aufzuzeichnen. Die Umordnung oder zeitliche Abfolge der aufgenommenen Bilder zeigt die entbündelnden und zytotoxischen Wirkungen der Behandlung mit PJ 34 in Krebszellen während der Mitose anhand der konfokalen Bildgebung lebender Zellen.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zu einer gezielten Krebstherapie, die ausschließlich autosomale Krebszellen während der Mitose eliminiert. Die Demonstration dieser Technik wird unser Kooperationspartner, Dr. Asher Castillo vom Cancer Research Center im Sheba Medical Center, und Dr. Leonid Middleman von der Bildgebungseinheit der Sackler School of Medicine an der Tel Aviv University, durchführen. Um MDA-MB-231 Brustkrebszellen für die lebende konfokale Bildgebung vorzubereiten, säen Sie zwei Mal 10^5 Zellen in 35 mm Durchmesser großen, mit Poly-D-Lysin beschichteten Kulturschalen mit Glasboden in einem Liter vollständigem Medium aus und inkubieren Sie bei 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.

Die Zellkultur ist bereit für die Transfektion, wenn sie eine Konfluenz von 60 bis 70 % erreicht hat. Die Zellen werden mit zwei Plasmiden transfiziert, von denen eines Gamma-Tubulin und GFP zur fluoreszenten Detektion von Zentrosomen codiert, und das andere Histon rot zur fluoreszenten Detektion von Chromosomen. Die Transfektion wird mithilfe des liposomalen Transfektionsreagens jet PI gemäß dem Herstellungsprotokoll durchgeführt. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und ersetzen Sie dann das Zellmedium durch zwei Milliliter warmes DMEM ohne Zusätze. Geben Sie das Transfektionsgemisch vorsichtig zu den Zellen in DMEM hinzu und stellen Sie die Zellen anschließend acht Stunden lang in den Inkubator. Nach acht Stunden.

Ersetzen Sie das DMEM durch zwei Milliliter komplettes Medium und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang im Inkubator. 24 Stunden nach der Transfektion ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter komplettes Medium, das 20 Mikromolar PGA 34 enthält.

Inkubieren Sie die Zellen weitere 18 Stunden vor der lebenden konfokalen Bildgebung. Die folgenden technischen Parameter gelten für die Einstellungen des Scanners bei der lebenden konfokalen Bildgebung. Scan-Modus XYZT, Pinhole: Airy 1,00, Zoom: 3,5, Auflösung: acht Bit, Laser: DPSS 561 Nanometer, sichtbarer Argonlaser 488 Nanometer, sichtbarer Helium-Neon-Laser 633 Nanometer.

Objektiv H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63× 1,40 Öl UV, numerische Apertur 1,4. Scanngeschwindigkeit 700 Hertz und Brechungsindex 1,52. Unterziehen Sie die Zellen mindestens 16 Stunden lang einer Live-Konfokalmikroskopie in einer Abbildungskammer, wobei die Zellen bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius gehalten werden.

Die Transfektions-Effizienz wird mittels Fluoreszenzmikroskopie überprüft. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie jeweils zwei mal 10 hoch 5 MDA-MB-231-Zellen in eine sechswellige Platte mit je einem Deckglas pro Vertiefung in zwei Milliliter komplettem Medium ansäen. Transfizieren Sie die Zellen anschließend wie zuvor mit dem liposomalen Transfektionsreagenz jetPEI gemäß Herstellervorschrift.

36 Stunden nach der Transfektion. Entfernen Sie das Medium aus jedem Well, nachdem die transfizierten auf einem Deckglas kultivierten Zellen mit PBS gewaschen wurden. Fixieren Sie die Zellen durch Inkubation in einer kalten Lösung aus Methanol und Aceton im Verhältnis eins zu eins für sieben Minuten bei minus 20 Grad Celsius.

Nach sieben Minuten die Fixierungslösung abpipettieren und das Deckglas mit den fixierten Zellen 30 Minuten lang in einer Abzugshaube trocknen lassen. Anschließend verlängertes Gold-Anti-Fade-Reagenz mit DPI auftragen und das Deckglas sechs Stunden im Dunkeln trocknen lassen. Die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop untersuchen und den Prozentsatz der transfizierten Zellen mit roten und grünen Signalen berechnen.

Aus der Gesamtzellpopulation beträgt der gewünschte Transfektionsanteil etwa 20 bis 40 %, wenn 100 bis 200 Zellen gezählt werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, säen Sie zwei mal zehn hoch fünf MDA-MB-231 Brustkrebszellen auf Deckgläsern in einer sechswelligen Platte in zwei Milliliter komplettem Medium aus. Geben Sie PJ 34 dem Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen für den erforderlichen Zeitraum.

Nach Beendigung der Inkubationszeit die Deckgläser einmal mit PBS waschen und die Zellen durch siebenminütige Inkubation in einer Lösung aus eiskaltem Methanol und Aceton im Verhältnis eins zu eins bei minus 20 Grad Celsius fixieren. Anschließend die Fixierungslösung abpipettieren und die Deckgläser 30 Minuten lang in einem Abzug trocknen lassen. Die Deckgläser danach einmal mit PBST waschen, um die Zellmembranen zu permeabilisieren, und die Zellen anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur mit 10 % normalem Eselserum in PBST blockieren.

Erstellen Sie das erste Antikörpermittel, indem Sie Antikörper gegen Fa-Tubulin und gegen Gamma-Tubulin in die Blockierungslösung geben und vortexen. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Antikörperlösung pro Deckglas auf einen Abdeckungsboden einer sechswelligen Platte. Drehen Sie das Deckglas um und legen Sie es vorsichtig auf den Antikörper-Tropfen; inkubieren Sie zwei Stunden lang.

Geben Sie Raumtemperatur hinzu. Dadurch werden Spindeln und Zentrosomen angefärbt. Legen Sie die Deckgläser zurück in die Vertiefungen und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBST.

Dann geben Sie die sekundären Antikörper, LOR 488 und LOR 568, je einen Tropfen pro Deckglas auf einen Abdeckungsboden einer sechs-Loch-Platte. Anschließend legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach unten auf die Antikörpertröpfchen, inkubieren eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln und kehren die Deckgläser nach Beendigung der Inkubation mit den sekundären Antikörpern in die Vertiefungen zurück. Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit PBST.

Schließlich die Deckgläser mit einem langanhaltenden Gold-Anti-Fade-Reagenz montieren und über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, um sie vor der Bildaufnahme fixierter Zellen mittels konfokaler Mikroskopie trocknen zu lassen. PJ 34 ist ein stabiles, wasserlösliches Phantrodin, das zuvor beobachtet wurde, ausschließlich Krebszellen mit multiplen Zentrosomen zu eliminieren, ohne normale Zellen, die Mitose mit zwei Zentrosomen und bifokalen Spindeln durchlaufen, zu beeinträchtigen. In dieser Studie wurde die zytotoxische Aktivität von PJ 34 an lebenden menschlichen Brustkrebszellen M-D-A-M-B 231 untersucht, die eine hohe Häufigkeit zusätzlicher Zentrosomen aufweisen.

Die Zellen wurden mit Gamma-Tubulin-GFP transfiziert, um die Gamma-Tubulin-Foci zu markieren, und mit Histon H2B rot, um die Chromosomen zu markieren. Die Aufnahme von M-D-A-M-B-231-Zellen mittels konfokaler Mikroskopie über einen Zeitraum von mindestens 16 Stunden zeigte eine bifokale Anhäufung von Zentrosomen, die eine zusätzliche bifokale Zentrosomenanordnung in der Mehrheit der Zellen während der Mitose darstellt, wie in den folgenden Videoclips veranschaulicht. Dieses erste Video zeigt eine zufällig ausgewählte lebende Zelle während der Mitose mit grün markierten Zentrosomen durch Gamma-Tubulin.

GFP in der zweiten Videosequenz zeigt die Chromosomenumordnung während der Mitose in einer zufällig ausgewählten M-D-A-M-B-231-Zelle, die mit Histon H zwei B rot transfiziert wurde. Dieses dritte Video zeigt eine MDA MB 231-Zelle während der Mitose, bei der grün markierte bifokale, geclusterte extranukleäre Foci und rot markierte Chromosomen zu sehen sind. Im Gegensatz dazu wurden in lebenden transfizierten M-D-A-M-B-231-Zellen, die mit 20 Mikromolar PJ 34 inkubiert wurden, ungeclusterte Zentrosomen und eine abnorme Anordnung der Chromosomen detektiert, und die Mitose in diesen Zellen endete im Zelltod, wie in diesem Film dargestellt.

Diese Echtzeitdokumentation des Zelltods während der Mitose untermauert stark eine zuvor definierte positive Korrelation zwischen der Anzahl menschlicher maligner Zellen mit multipolaren Spindeln in der Mitose und dem Prozentsatz an Zelltod in Zellen, die mit PJ 34 inkubiert wurden. Da PJ 34 als potenter PARP-1-Inhibitor wirkt, wurde die Möglichkeit untersucht, dass die Hemmung von PARP-1 mit einem Zelltod im Zusammenhang mit Mitosefehlern verursacht. Die zytotoxische Wirkung steigender Konzentrationen von PJ 34 wurde in normalen und PARP-1-defizienten embryonalen Mausfibroblasten getestet, und die Ergebnisse werden hier gezeigt.

Der linke Graph zeigt den Prozentsatz multifokaler Spindeln, der in normalen embryonalen Fibroblasten der Maus, dargestellt durch die schwarze Linie, und in PARP-1-defizienten Fibroblasten, dargestellt durch die graue Linie, berechnet wurde, nach einer Inkubation für 48 Stunden mit PJ 34 in den angegebenen Konzentrationen. Diese Prozentsätze wurden aus insgesamt 20 beobachteten Spindeln aus drei verschiedenen Experimenten ermittelt. Der rechte Graph zeigt die Überlebensfähigkeit normaler und PARP-1-defizienter embryonaler Fibroblasten der Maus nach einer Inkubation für 72 Stunden mit 20 Mikromolar.

Das Zellüberleben unter PJ 34 wurde über die ATP-Produktion der Zellen gemessen. Die Mittelwerte aus vier Messungen für jede Zelllinie in drei verschiedenen Experimenten sind dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass PJ 34 abhängig von der Dosis verformte Spindeln und Zelltod in PARP1-defizienten embryonalen Mausfibroblasten verursachte, nicht jedoch in normalen Fibroblasten.

Die Tatsache, dass PJ 34 PARP1-defiziente Meth trotz ihres PARP1-Mangels eliminierte, und die Korrelation zwischen der Bildung multifokaler Spindeln und der Zelleliminierung in PARP1-defizienten embryonalen Mausfibroblasten, die mit PJ 34 in Konzentrationen inkubiert wurden, die höher sind als jene, die zur PARP1-Hemmung erforderlich sind, steht nicht im Einklang mit einer kausalen Verbindung zwischen der Entstauung von Zentrosomen in PARP1-defizienten embryonalen Mausfibroblasten und der PARP1-Hemmung. Diese konfokalen Aufnahmen zeigen normale und PARP1-defiziente embryonale Mausfibroblasten in der Mitose, die fixiert, permeabilisiert und immunmarkiert wurden, wobei Alpha- und Gamma-Tubulin ihre Spindeln grün bzw. die Zentrosomen rot markierten. Die Chromosomen wurden mit dem DPI-Reagenz blau gefärbt.

Die Zellen wurden entweder unbehandelt gelassen oder mit PJ 34 für 48 Stunden bei den angegebenen Konzentrationen inkubiert. Bei PARP-1-defizienten embryonalen Mausfibroblasten, die mit PJ 34 behandelt wurden, wurden ungeclusterte Gamma-Tubulin-freie Foci, verformte Spindeln und Zelltod beobachtet, nicht jedoch bei normalen embryonalen Mausfibroblasten, die mit PJ 34 behandelt wurden. Einige der untersuchten Zellkulturen wurden mit zwei potenzen, nicht-arenen PARP-1-Inhibitoren, ABT-888 und AG-014699, behandelt, die die enzymatische Aktivität von PARP-1 hemmen.

Keiner der getesteten PARP1-Inhibitoren beeinträchtigte normale murine embryonale Fibroblasten in Konzentrationen, die die PARP1-Aktivität hemmten. Diese PARP1-Inhibitoren beeinflussten auch die Zentrosomenaggregation in PARP1-defizienten murinen embryonalen Fibroblasten nicht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die zytotoxische Wirkung von PJ 34 auf Zellen mit multiplen Zentrosomen von anderen potenzen PARP1-Inhibitoren nicht geteilt wurde, sobald diese beherrscht waren.

Diese Technik kann bei anderen lebenden Zelltypen für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden.