Name: Cell Death mit Abnormal Mitose Assoziierte Beobachtet von konfokalen Imaging im Live Cancer Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Erfahren Sie die zytotoxische Wirkung von PJ-34 auf Brustkrebszellen während der Mitose mittels Live-Konfokalmikroskopie. Diese Methode zeigt, wie das Derivat Centrosomen-Clustering stört und Zelltod induziert.

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Finanzierungsquellen dieser Forschung: ein gemeinsamer Fonds von der Universität Tel Aviv Technologietransfer Firma, RAMOT und dem Sheba Medical Center-(M. CA und SI.), ICRF - Israeli Cancer Research Foundation (M. CA.) Und Israel Science Foundation ( SI).

1. Cell Culture Vorbereitung MDA-MB-231-Zellen wurden von ATCC (American Type Culture Collection) erworben und in flüssigem Stickstoff gelagert. <ol><li> Seed 10 6 MDA-MB-231 Zellen in 92 mm Durchmesser Petrischale in 10 ml Vollmedium mit Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% Pferdeserum, 1% L-Glutamin und 1%-Penstrep Amphotericin B. Zellen zulassen bis zu etwa 80-100% Konfluenz vermehren. </li><li> Entfernen Kulturmedium aus Schale und verwerfen. </li><li> Waschen der Zellschicht kurz mit 0,25% (w / v) Trypsin-EDTA-Lösung, um alle Spuren von Serum zu entfernen. </li><li> 2,0 ml Trypsin-EDTA-Lösung, austeilen und beobachten Zellen durch inverse Mikroskop bis Zellschicht verteilt ist (in der Regel innerhalb von 5 bis 15 min). </li><li> In 18 ml komplettem Wachstumsmedium und sanft saugen die Zellen mit einer Pipette. Transfer zu einem Rohr. </li><li> Zentrifuge die Zellsuspension bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Re-suspend das Zellpellet in 24 ml culture Medium. </li><li> 2 ml Zellsuspension in 35 mm Petrischalen mit Glasboden (ca. 25% Konfluenz) und Platz im Inkubator (5% CO 2, 37 ° C). </li><li> Lösungen: <ol><li> Komplette Medium für Zellen Zellproliferation: DMEM mit 10% FBS, 1% Antibiotika (100 Einheiten / ml Penicillin G, 100 ug / ml Streptomycin, Pen-Strep-Ampho Lösung) und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Trypsin-EDTA-Lösung, die 0,25% Trypsin-EDTA. </li></ol></li><li> Gerichte: 92 mm Durchmesser Petrischalen. 35 mm Durchmesser Poly-D-Lysin beschichteten Glasboden Kulturschalen. </li></ol> 2. Vorbereitung der Zellen für die Live-konfokale Imaging <ol><li> Seed 2 x 10 5 MDA-MB-231-Zellen in Glasbodenkulturschalen in 2 ml Vollmedium, wie in Kapitel 1 erwähnt. Wenn Zellkultur Zusammenfluss von 60-70% (ca. 3-4 x 10 5 Zellen pro Schale) erreicht, mit Transfektion gehen. </li><li> Transfektion der Zellen mit zwei Plasmiden TonkanäleING die Fusionsproteine ​​γ-Tubulin-GFP (für Fluoreszenzdetektion Zentrosome) und Histone-RED (H2b-RED, für Fluoreszenzdetektion der Chromosomen) mit dem liposomalen Transfektionsreagenz Jet-PI nach der Herstellung Protokoll. Kurz gesagt, mischen 2 ug von jedem Plasmid in einem Rohr mit 100 ul NaCl (150 mM). Mischen Sie das Transfektionsreagenz (100 ul) mit 100 ul NaCl (150 mM) in einem zweiten Rohr, und Inkubation 5 min bei Raumtemperatur (RT). Dann kombinieren Sie die beiden Lösungen, Mix (mit milden Vortex) und Spin-down. Inkubieren für 30 min bei RT. </li><li> Während der Inkubation der Transfektionsgemisch, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und ersetzen Sie die Zell-Medium mit 2 ml warmem DMEM ohne Zusätze (37 ° C). </li><li> Sanft fügen Sie die Transfektion Mischung zu den Zellen in DMEM und dann wieder die Zellen in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 8 Stunden. </li><li> Nach 8 h Inkubation, ersetzen Sie das DMEM mit 2 ml Vollmedium und Inkubation der Zellen im Brutschrank für 24hr. </li><li> 24 Stunden nach der Transfektion, ersetzen Sie das Medium der Zellen mit 2 ml Vollmedium mit 20 uM PJ-34. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für weitere 18 Stunden (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Betrifft die Zellen konfokale Bildgebung für mindestens 16 Stunden zu leben in der Bildgebung Kammer halten die Zellen bei 5% CO 2 und 37 ° C. </li><li> Parallel dazu untersuchen Transfektion Wirksamkeit 36 ​​Stunden nach Transfektion unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie wie folgt: <ol><li> Seed 2 x 10 5 MDA-MB-231-Zellen in 6-Well-Platte mit 1 Deckglas pro Vertiefung in 2 ml Vollmedium. </li><li> Transfektion die Zellen wie in den Abschnitten 2.2-2.5 erwähnt. </li><li> 36 Stunden nach Transfektion beheben die transfizierten Zellen auf einem Deckglas durch Inkubation montiert in kaltem Methanol: Aceton (1:1)-Lösung, 7 min, -20 ° C </li><li> Saugen Sie die Fixierung Lösung und lassen das Deckglas mit den montierten Zellen in einer chemischen Haube trocknen. </li><li> Bewerben ProLong Gold-antifade Reagenz mit DAPI und lassen the Deckglas im Dunkeln für 6 Stunden trocknen. </li><li> Untersuchen Sie den Schieberegler unter dem Fluoreszenzmikroskop und berechnen den Anteil der transfizierten Zellen (rote und grüne Signale) von der gesamten Population von Zellen (DNA-Färbung durch DAPI). Die gewünschte Transfektion Prozentsatz etwa 20-40% bei 100-200 Zellen gezählt. </li></ol></li></ol> 3. Technische Parameter der Live-konfokale Imaging Scanner-Einstellungen <ol><li> ScanMode xyzt; Pinhole [luftig] 1,00; Zoom 3,5; Auflösung 8 Bit; Laser DPSS 561 nm; Argon, sichtbaren Laser 488 nm; Laser He / Ne 633 nm sichtbar; Ziel HCX PL APO CS 63X 1.40 OIL UV; Numerische Apertur 1,4; Scan-Geschwindigkeit 700 Hz; Brechungsindex 1,52. </li><li> Bild 3-D Präsentation wurden von Imaris Imaging-Software 7.0 vorbereitet. </li></ol> 4. Konfokalen Imaging der Mitose in fixierten Zellen <ol><li> Seed 2 x 10 5 MDA-MB-231 Brustkrebszellen (ATCC), normale embryonale Maus-Fibroblasten (MEF), oder PARP1 defizienten MEF (PARP - / -, hergestellt von Dr. Francoise Dantzer) auf Deckgläser in 6-Well-Platte in 2 ml Vollmedium. Die Deckgläser wurden mit 96% Ethanol gewaschen, gefolgt von Waschen mit sterilem DD Wasser gewaschen, 2 Stunden, und in jeder Vertiefung der 6-Well-Platte. </li><li> In PJ-34 (10-30 pM) auf das Medium und Inkubation der Zellen für den gewünschten Zeitraum (in der Regel bis zu 96 Stunden). </li><li> Waschen der Deckgläser einmal mit PBS (phosphate buffered saline), und fixieren die Zellen unter Verwendung von Inkubation in eiskaltem Methanol: Aceton (1:1)-Lösung, 7 min, 20 ° C </li><li> Saugen Sie die Fixierung Lösung und lassen Sie die Deckgläser in chemischen Haube trocknen lassen (in diesem Stadium können die Deckgläser in -20 ° C für mehrere Wochen aufbewahrt werden). </li><li> Waschen der Deckgläser einmal mit PBST (PBS mit 0,1% Tween-20 ergänzt), um die Zellmembranen durchlässig und blockieren die Zellen mit 10% NDS (Normale Eselserum) in PBST (&quot;Blocking Solution&quot;) für 1 h bei RT. </li><li> Inkubation der permeabilisierten fixierten Zellen mit primären Antibodies für 2 Stunden bei RT (für Spindeln und Zentrosome Färbung). Anti-α Tubulin (1:250 Verdünnung) und anti-γ Tubulin (1:200 Verdünnung): Die Antikörper werden in der Blocking-Lösung wie folgen verdünnt. Primäre Antikörper wie folgt angewendet: Anwendung 100 ul (in einem Tropfen) einer Mischung der Antikörper in Blocking-Lösung für jedes Deckglas auf 6-Well-Platte Abdeckung (der Deckel auf dem Kopf steht). Sanft legte das Deckglas auf dem Antikörper Tropfen, mit Blick auf die ausgesäten Zellen Drop. Inkubieren Deckgläser zugewandten Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie die Deckgläschen wieder in den Brunnen und die Zellen 3-mal mit PBST. Dann nutzen Sie die gleiche Prozedur in 4.6 für die Markierung von Zellen auf den Deckgläsern mit den fluoreszierenden Sekundärantikörper beschrieben. Inkubieren der Zellen auf den Deckgläschen mit den sekundären Antikörpern für 1 Stunde, RT im Dunkeln. Die Antikörper werden in der Blocking-Lösung wie folgt verdünnt: und Alexa Fluor 568 (1:1000 Verdünnung Alexa Fluor 488 (grün 1:1000 Verdünnung);rot). </li><li> Montieren Sie die Deckgläser mit ProLong Gold-antifade Reagenz mit DAPI (für die Chromosomen-Färbung) und Inkubation über Nacht bei RT in Dunkelheit, um zu trocknen. </li><li> Untersuchen Sie die Deckgläser durch konfokale Mikroskopie. </li></ol> 5. Zellviabilitätsmessungen von ATP Produktion gemessen ATP-Produktion wird durch eine leuchtende ATP Detektionsassay Kit gemessen. <ol><li> Seed die Zellen in 96-Well-Platte etwa 20.000 Zellen in 800 ul Medium in jeder Vertiefung. Drei leere Vertiefungen sollten für die Bestimmung der Hintergrundlumineszenz des Mediums verwendet werden. </li><li> Bereiten ATP Standardverdünnungsreihen von etwa 10 um bis 100 um und halten auf dem Eis. </li><li> In 50 ul Reinigungsmittel in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte für 5 min in Schüttler, 700 min. </li><li> Den Inhalt jeder Flasche des &quot;lyophilisierte Substrat &#39;mit 5 ml&#39; Substratpuffers &#39;in dem Kit. </li><li> In 50 ul des rekonstituierten Substrat-Lösung in die Vertiefungen, und schüttelndie Platte für 5 min auf Schüttler, 700 min. </li><li> Halten Sie die Platte in Dunkelheit für 10 min. </li><li> Messen Lumineszenz von jeder Vertiefung durch ELISA Mikroplatten-Reader. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Live-konfokale Bildgebung bot eine Echtzeit-Dokumentation der zytotoxischen Wirkung der PJ-34 im Live-Multi-zentrosomale Zellen während der Mitose (Abbildung 3 und ergänzende Informationen). Dies war die erste Live-Dokumentation zuschreibt die Zytotoxizität von PJ-34 in menschlichen Krebszellen, um zusätzliche Zentrosome de-Clustering und Zelltod, was darauf hindeutet, Induktion von Mitotic Catastrophe Zelltod durch PJ-34 5-9. Im Gegensatz dazu wurde bi-fokale Clustering von super-Numerarier ...

Phenanthrene abgeleitet PARP1 Hemmern, einschließlich PJ-34, wurden entwickelt, um ruhende Zellen von Apoptose durch die Energie verbrauchen PARP1 vermittelten DNA-Reparatur unter Stressbedingungen (Schlaganfall oder Myokardinfarkt) 1 induziert schützen. Doch vor kurzem entdeckten wir, dass PJ-34, bei zweimal höhere Konzentration als die induzierende PARP1 Hemmung kann ausschließlich Zelltod verursachen in menschlichen Krebszellen 2,3. Je schneller die Proliferation der Zelle war, desto effizienter ist die Tilgung der Zellen. Die zytotoxische Aktivität von PJ-34 wurde extra Zentrosome de-Clustering in Mitose 2 zugeschrieben. Viele menschliche Krebszellen Hafen multicentrosomes 4,5. Inkubation von menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-231, die überzähligen Centrosomen Hafen, mit 20 uM PJ-34 effizient beseitigt diese Zellen innerhalb 72-96 Stunden ohne Beeinträchtigung ruhenden Zellen oder einige gutartige proliferierende Zellen beherbergen zwei Centrosomen in der Mitose <sup&gt; 2,3. Benigne Zellen enthalten humanen Mamma-Epithelzellen MCF-10, Humane Endothelzellen (HUVEC) und primäre mesenchymale Zellen aus menschlichen Thymus hergestellt. Diese Zellen waren resistent gegen die zytotoxische Aktivität der PJ-34. PJ-34 nicht mit ihren Zellzyklus stören während 96 h Inkubation oder auf ihre Centrosomen und bi-fokale Spindelbildung 2,3. Bipolar Zentrosoms Montage ist entscheidend für bipolare Spindel Bildung in der Mitose 4,5. Daher wurden Zellen mit mehr als zwei Centrosomen eine kaum verstanden molekularen Mechanismus entwickelt, Clustering ihre zusätzliche Zentrosome an zwei Pole 4-9. Ausfall der bipolaren Anordnung ihrer Zentrosome kann multipolare Spindeln und aberrante verzerrten Chromosomen Segregation, dass die Verhaftungen Zellzyklus in der G2 / M Verhaftung und zum Zelltod führt zu mitotischen Ausfall 4,5 zugeschrieben. Die molekularen Mechanismen, die extra Zentrosome de-Clustering werden intensiv untersucht &lt;sup&gt; 10. Das Verständnis dieses Mechanismus Tod ermöglichen exklusive Beseitigung von Krebszellen unter Schonung gesunden Gewebes 5,10. So bieten Verbindungen, die mitotische Katastrophe Zelltod aktivieren einen neuen Modus eines selektiven Krebs-Therapie, die wirksam sein kann in einem breiten Spektrum von humanen soliden cancers.Our Ergebnisse legen nahe, dass konfokale Bildgebung verwendet werden, um Moleküle beeinflussen extra Zentrosome Clustering in identifizieren Mitose 2,3, wodurch diese Verbindungen Krebs Targeting Wirkstoffkandidaten. Wir haben die zytotoxische Aktivität der Phenanthridin PJ-34 durch Abtasten festen und lebenden menschlichen Krebszellen (mit hohem Auftreten der extra-Zentrosome in Mitose) gegenüber normalen Zellen dokumentiert. Eine Schritt-für Schritt-Beschreibung der bildgebenden Verfahren verwendet, um die zytotoxische Aktivität der PJ-34 in menschlichen Krebszellen zu identifizieren sind unten aufgeführt.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENZIEN </td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>41965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS (Fötales Rinderserum)</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>12657</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pen-Strep-Ampho-Lösung</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-033-1B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>25030-024</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,25% Tripsin-EDTA</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>25200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>92 mm Petrischalen</td><td>Nunc,Thermo scientific</td><td>150350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm Poly-D-Lysin-beschichtete Glasbodenkulturschalen</td><td>MatTek Corporation, USA</td><td>P35GC-0-14-C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lumineszierendes ATP-Nachweis-Assay-Kit</td><td>Abcam</td><td>ab113849</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NDS (Normales Eselserum)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-Tubulin-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:250 Verdünnung (IF)</td></tr><tr><td>Anti-&gamma;-Tubulin-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:200 Verdünnung (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td>1:1.000 Verdünnung (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Kaninchen IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-10042</td><td>1:1.000 Verdünnung (IF)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifading-Reagenz mit DAPI (einsteigend)</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>JetPEI (liposomales Transfektionsreagenz)</td> <td>Polyplus</td><td>101-10</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica (Mannheim, Deutschland)</td><td>TCS SP5II</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

cell death mit abnormal mitose assoziierte beobachtet von konfokalen imaging im live cancer cells

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrenderivate als potente Inhibitoren PARP1 verhinderte die bi-fokale Clustering überzähliger Centrosomen in multi-zentrosomale menschliche Krebszellen in der Mitose. Die Phenanthridin PJ-34 war die stärkste Molekül. Declustering der extra-Zentrosome verursacht mitotischen Versagen und Zelltod in multi-zentrosomale Zellen. Die meisten soliden menschlichen Krebserkrankungen eine hohe Auftreten von extra Zentrosome. Die Aktivität der PJ-34 wurde in Echtzeit durch konfokale Bildgebung von lebenden menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-231-Zellen mit Vektoren, die für fluoreszierende γ-Tubulin, die sehr häufig in den Centrosomen ist und für Leuchtstofflampen Histone H2B in transfiziert dokumentiert die Chromosomen. Aberrante Chromosom Anordnungen und de-Cluster γ-Tubulin Brennpunkte darstellt Declustered Zentrosome wurden in den transfizierten MDA-MB-231-Zellen nach der Behandlung mit PJ-34 erfasst. Un-Cluster extra Centrosomen in den beiden vorangegangen Spindelpole ihren Zelltod. Diese Ergebnisse verknüpft for das erste Mal, das kürzlich entdeckt exklusiven zytotoxische Aktivität von PJ-34 in menschlichen Krebszellen mit extra Zentrosome de-Clustering in der Mitose und mitotischen Ausfall zum Zelltod führen. Nach den bisherigen Erkenntnissen durch konfokale Bildgebung von fixierten Zellen, PJ-34 ausschließlich ausgerottet Krebszellen mit Multi-Zentrosome ohne Beeinträchtigung normalen Zellen Mitose mit zwei Centrosomen und bi-fokale Spindeln beobachtet. Dieser zytotoxische Aktivität von PJ-34 wurde nicht durch andere potente Inhibitoren PARP1 geteilt, und wurde in PARP1 defizienten MEF beherbergen extracentrosomes beobachtet, was seine Unabhängigkeit von PARP1 Hemmung. Live-konfokale Bildgebung bot ein nützliches Werkzeug für die Identifizierung neuer Moleküle beseitigen Zellen während der Mitose.

PJ-34 ist eine stabile wasserlösliche Phenanthridin 1 (Abbildung 1). Unsere bisherigen Ergebnisse zeigen, Zelltod und extra Centrosomen in verschiedene Arten von festen Multi-zentrosomale Krebszellen, die mit PJ-34 behandelt wurden, de-Cluster. Im Gegensatz dazu wurden normalen proliferierenden Zellen nicht beeinträchtigt 2,3. Zentrosomen wurden durch doppelte Markierung mit Antikörpern gegen centrine1 und γ-Tubulin in den festen extra zentrosomale Zellen 2 gerichtet ide...

Die zytotoxische Aktivität der Phenanthridin PJ-34 in Krebszellen Mitose wurde in Echtzeit Live-konfokale Bildgebung dokumentiert. PJ-34 ausgerottet menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-231-Zellen, die extra Centrosomen in Mitose. Im Gegensatz zu normalen bifokalen Mitose wurden die extra Zentrosome in den beiden Spindelpole in Gegenwart von PJ-34 gruppiert.

Cell Death mit Abnormal Mitose Assoziierte Beobachtet von konfokalen Imaging im Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die zytotoxische Wirkung des Philanthridin-Derivats PJ 34 während der Mitose in multizentrischen somatischen menschlichen Krebszellen zu beobachten. Dies wird erreicht, indem Zentrosomen mit GFP-markiertem γ-Tubulin und Chromosomen mit H2B-mCherry durch Transfektion markiert werden. Das Ziel der Transfektion ist es, die Verfolgung der Migration und Aggregation der Zentrosomen sowie der Anordnung der Chromosomen während der Mitose in lebenden multizentrischen somatischen Krebszellen zu ermöglichen.Im zweiten Schritt werden einige der transfizierten Zellen mit PJ 34 behandelt, einem Molekül, das als zusätzlicher Wirkstoff zur Entbündelung von Zentrosomen wirkt. Anschließend werden lebende, transfizierte Krebszellen mittels konfokaler Mikroskopie untersucht, um Ereignisse während der Mitose in Zusammenhang mit der Migration von Zentrosomen und Chromosomen aufzuzeichnen. Die Umordnung oder zeitliche Abfolge der aufgenommenen Bilder zeigt die entbündelnden und zytotoxischen Wirkungen der Behandlung mit PJ 34 in Krebszellen während der Mitose anhand der konfokalen Bildgebung lebender Zellen.Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zu einer gezielten Krebstherapie, die ausschließlich autosomale Krebszellen während der Mitose eliminiert. Die Demonstration dieser Technik wird unser Kooperationspartner, Dr. Asher Castillo vom Cancer Research Center im Sheba Medical Center, und Dr. Leonid Middleman von der Bildgebungseinheit der Sackler School of Medicine an der Tel Aviv University, durchführen. Um MDA-MB-231 Brustkrebszellen für die lebende konfokale Bildgebung vorzubereiten, säen Sie zwei Mal 10^5 Zellen in 35 mm Durchmesser großen, mit Poly-D-Lysin beschichteten Kulturschalen mit Glasboden in einem Liter vollständigem Medium aus und inkubieren Sie bei 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.Die Zellkultur ist bereit für die Transfektion, wenn sie eine Konfluenz von 60 bis 70 % erreicht hat. Die Zellen werden mit zwei Plasmiden transfiziert, von denen eines Gamma-Tubulin und GFP zur fluoreszenten Detektion von Zentrosomen codiert, und das andere Histon rot zur fluoreszenten Detektion von Chromosomen. Die Transfektion wird mithilfe des liposomalen Transfektionsreagens jet PI gemäß dem Herstellungsprotokoll durchgeführt. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und ersetzen Sie dann das Zellmedium durch zwei Milliliter warmes DMEM ohne Zusätze. Geben Sie das Transfektionsgemisch vorsichtig zu den Zellen in DMEM hinzu und stellen Sie die Zellen anschließend acht Stunden lang in den Inkubator. Nach acht Stunden.Ersetzen Sie das DMEM durch zwei Milliliter komplettes Medium und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang im Inkubator. 24 Stunden nach der Transfektion ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter komplettes Medium, das 20 Mikromolar PGA 34 enthält.Inkubieren Sie die Zellen weitere 18 Stunden vor der lebenden konfokalen Bildgebung. Die folgenden technischen Parameter gelten für die Einstellungen des Scanners bei der lebenden konfokalen Bildgebung. Scan-Modus XYZT, Pinhole: Airy 1,00, Zoom: 3,5, Auflösung: acht Bit, Laser: DPSS 561 Nanometer, sichtbarer Argonlaser 488 Nanometer, sichtbarer Helium-Neon-Laser 633 Nanometer.Objektiv H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63× 1,40 Öl UV, numerische Apertur 1,4. Scanngeschwindigkeit 700 Hertz und Brechungsindex 1,52. Unterziehen Sie die Zellen mindestens 16 Stunden lang einer Live-Konfokalmikroskopie in einer Abbildungskammer, wobei die Zellen bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius gehalten werden.Die Transfektions-Effizienz wird mittels Fluoreszenzmikroskopie überprüft. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie jeweils zwei mal 10 hoch 5 MDA-MB-231-Zellen in eine sechswellige Platte mit je einem Deckglas pro Vertiefung in zwei Milliliter komplettem Medium ansäen. Transfizieren Sie die Zellen anschließend wie zuvor mit dem liposomalen Transfektionsreagenz jetPEI gemäß Herstellervorschrift.36 Stunden nach der Transfektion. Entfernen Sie das Medium aus jedem Well, nachdem die transfizierten auf einem Deckglas kultivierten Zellen mit PBS gewaschen wurden. Fixieren Sie die Zellen durch Inkubation in einer kalten Lösung aus Methanol und Aceton im Verhältnis eins zu eins für sieben Minuten bei minus 20 Grad Celsius.Nach sieben Minuten die Fixierungslösung abpipettieren und das Deckglas mit den fixierten Zellen 30 Minuten lang in einer Abzugshaube trocknen lassen. Anschließend verlängertes Gold-Anti-Fade-Reagenz mit DPI auftragen und das Deckglas sechs Stunden im Dunkeln trocknen lassen. Die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop untersuchen und den Prozentsatz der transfizierten Zellen mit roten und grünen Signalen berechnen.Aus der Gesamtzellpopulation beträgt der gewünschte Transfektionsanteil etwa 20 bis 40 %, wenn 100 bis 200 Zellen gezählt werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, säen Sie zwei mal zehn hoch fünf MDA-MB-231 Brustkrebszellen auf Deckgläsern in einer sechswelligen Platte in zwei Milliliter komplettem Medium aus. Geben Sie PJ 34 dem Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen für den erforderlichen Zeitraum.Nach Beendigung der Inkubationszeit die Deckgläser einmal mit PBS waschen und die Zellen durch siebenminütige Inkubation in einer Lösung aus eiskaltem Methanol und Aceton im Verhältnis eins zu eins bei minus 20 Grad Celsius fixieren. Anschließend die Fixierungslösung abpipettieren und die Deckgläser 30 Minuten lang in einem Abzug trocknen lassen. Die Deckgläser danach einmal mit PBST waschen, um die Zellmembranen zu permeabilisieren, und die Zellen anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur mit 10 % normalem Eselserum in PBST blockieren.Erstellen Sie das erste Antikörpermittel, indem Sie Antikörper gegen Fa-Tubulin und gegen Gamma-Tubulin in die Blockierungslösung geben und vortexen. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Antikörperlösung pro Deckglas auf einen Abdeckungsboden einer sechswelligen Platte. Drehen Sie das Deckglas um und legen Sie es vorsichtig auf den Antikörper-Tropfen; inkubieren Sie zwei Stunden lang.Geben Sie Raumtemperatur hinzu. Dadurch werden Spindeln und Zentrosomen angefärbt. Legen Sie die Deckgläser zurück in die Vertiefungen und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBST. Dann geben Sie die sekundären Antikörper, LOR 488 und LOR 568, je einen Tropfen pro Deckglas auf einen Abdeckungsboden einer sechs-Loch-Platte. Anschließend legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach unten auf die Antikörpertröpfchen, inkubieren eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln und kehren die Deckgläser nach Beendigung der Inkubation mit den sekundären Antikörpern in die Vertiefungen zurück. Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit PBST.Schließlich die Deckgläser mit einem langanhaltenden Gold-Anti-Fade-Reagenz montieren und über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, um sie vor der Bildaufnahme fixierter Zellen mittels konfokaler Mikroskopie trocknen zu lassen. PJ 34 ist ein stabiles, wasserlösliches Phantrodin, das zuvor beobachtet wurde, ausschließlich Krebszellen mit multiplen Zentrosomen zu eliminieren, ohne normale Zellen, die Mitose mit zwei Zentrosomen und bifokalen Spindeln durchlaufen, zu beeinträchtigen. In dieser Studie wurde die zytotoxische Aktivität von PJ 34 an lebenden menschlichen Brustkrebszellen M-D-A-M-B 231 untersucht, die eine hohe Häufigkeit zusätzlicher Zentrosomen aufweisen.Die Zellen wurden mit Gamma-Tubulin-GFP transfiziert, um die Gamma-Tubulin-Foci zu markieren, und mit Histon H2B rot, um die Chromosomen zu markieren. Die Aufnahme von M-D-A-M-B-231-Zellen mittels konfokaler Mikroskopie über einen Zeitraum von mindestens 16 Stunden zeigte eine bifokale Anhäufung von Zentrosomen, die eine zusätzliche bifokale Zentrosomenanordnung in der Mehrheit der Zellen während der Mitose darstellt, wie in den folgenden Videoclips veranschaulicht. Dieses erste Video zeigt eine zufällig ausgewählte lebende Zelle während der Mitose mit grün markierten Zentrosomen durch Gamma-Tubulin.GFP in der zweiten Videosequenz zeigt die Chromosomenumordnung während der Mitose in einer zufällig ausgewählten M-D-A-M-B-231-Zelle, die mit Histon H zwei B rot transfiziert wurde. Dieses dritte Video zeigt eine MDA MB 231-Zelle während der Mitose, bei der grün markierte bifokale, geclusterte extranukleäre Foci und rot markierte Chromosomen zu sehen sind. Im Gegensatz dazu wurden in lebenden transfizierten M-D-A-M-B-231-Zellen, die mit 20 Mikromolar PJ 34 inkubiert wurden, ungeclusterte Zentrosomen und eine abnorme Anordnung der Chromosomen detektiert, und die Mitose in diesen Zellen endete im Zelltod, wie in diesem Film dargestellt.Diese Echtzeitdokumentation des Zelltods während der Mitose untermauert stark eine zuvor definierte positive Korrelation zwischen der Anzahl menschlicher maligner Zellen mit multipolaren Spindeln in der Mitose und dem Prozentsatz an Zelltod in Zellen, die mit PJ 34 inkubiert wurden. Da PJ 34 als potenter PARP-1-Inhibitor wirkt, wurde die Möglichkeit untersucht, dass die Hemmung von PARP-1 mit einem Zelltod im Zusammenhang mit Mitosefehlern verursacht. Die zytotoxische Wirkung steigender Konzentrationen von PJ 34 wurde in normalen und PARP-1-defizienten embryonalen Mausfibroblasten getestet, und die Ergebnisse werden hier gezeigt.Der linke Graph zeigt den Prozentsatz multifokaler Spindeln, der in normalen embryonalen Fibroblasten der Maus, dargestellt durch die schwarze Linie, und in PARP-1-defizienten Fibroblasten, dargestellt durch die graue Linie, berechnet wurde, nach einer Inkubation für 48 Stunden mit PJ 34 in den angegebenen Konzentrationen. Diese Prozentsätze wurden aus insgesamt 20 beobachteten Spindeln aus drei verschiedenen Experimenten ermittelt. Der rechte Graph zeigt die Überlebensfähigkeit normaler und PARP-1-defizienter embryonaler Fibroblasten der Maus nach einer Inkubation für 72 Stunden mit 20 Mikromolar.Das Zell&uuml;berleben unter PJ 34 wurde &uuml;ber die ATP-Produktion der Zellen gemessen. Die Mittelwerte aus vier Messungen f&uuml;r jede Zelllinie in drei verschiedenen Experimenten sind dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass PJ 34 abh&auml;ngig von der Dosis verformte Spindeln und Zelltod in PARP1-defizienten embryonalen Mausfibroblasten verursachte, nicht jedoch in normalen Fibroblasten.Die Tatsache, dass PJ 34 PARP1-defiziente Meth trotz ihres PARP1-Mangels eliminierte, und die Korrelation zwischen der Bildung multifokaler Spindeln und der Zelleliminierung in PARP1-defizienten embryonalen Mausfibroblasten, die mit PJ 34 in Konzentrationen inkubiert wurden, die höher sind als jene, die zur PARP1-Hemmung erforderlich sind, steht nicht im Einklang mit einer kausalen Verbindung zwischen der Entstauung von Zentrosomen in PARP1-defizienten embryonalen Mausfibroblasten und der PARP1-Hemmung. Diese konfokalen Aufnahmen zeigen normale und PARP1-defiziente embryonale Mausfibroblasten in der Mitose, die fixiert, permeabilisiert und immunmarkiert wurden, wobei Alpha- und Gamma-Tubulin ihre Spindeln grün bzw. die Zentrosomen rot markierten. Die Chromosomen wurden mit dem DPI-Reagenz blau gefärbt.Die Zellen wurden entweder unbehandelt gelassen oder mit PJ 34 für 48 Stunden bei den angegebenen Konzentrationen inkubiert. Bei PARP-1-defizienten embryonalen Mausfibroblasten, die mit PJ 34 behandelt wurden, wurden ungeclusterte Gamma-Tubulin-freie Foci, verformte Spindeln und Zelltod beobachtet, nicht jedoch bei normalen embryonalen Mausfibroblasten, die mit PJ 34 behandelt wurden. Einige der untersuchten Zellkulturen wurden mit zwei potenzen, nicht-arenen PARP-1-Inhibitoren, ABT-888 und AG-014699, behandelt, die die enzymatische Aktivität von PARP-1 hemmen.Keiner der getesteten PARP1-Inhibitoren beeinträchtigte normale murine embryonale Fibroblasten in Konzentrationen, die die PARP1-Aktivität hemmten. Diese PARP1-Inhibitoren beeinflussten auch die Zentrosomenaggregation in PARP1-defizienten murinen embryonalen Fibroblasten nicht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die zytotoxische Wirkung von PJ 34 auf Zellen mit multiplen Zentrosomen von anderen potenzen PARP1-Inhibitoren nicht geteilt wurde, sobald diese beherrscht waren.Diese Technik kann bei anderen lebenden Zelltypen für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

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Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

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