DNA-Gelelektrophorese

DNA Gel Electrophoresis

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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

DNA Gel Electrophoresis

2.3: PCR: The Polymerase Chain Reaction

2.5: Separating Protein with SDS-PAGE

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09:22 min

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April 30, 2023

Overview

Die DNA Gelelektrophorese ist ein Verfahren das benutzt wird, um DNA Moleküle aufzutrennen und nachzuweisen. Ein elektrisches Feld wird auf eine Gelmatrix, die aus Agarose besteht, angewendet. Geladene Partikel migrieren durch das Gel und werden dadurch nach ihrer Größe aufgetrennt. Die negativ geladenen Phosphatgruppen im DNA Rückgrat bewirken das die DNA Fragmente in Richtung der Anode migrieren – also der positive geladenen Elektrode.

Das Video erklärt den Mechanismus durch welchen die DNA Fragmente in dem Agarose-Gel aufgetrennt werden, und es stellt eine allgemeine Schritt-für-Schritt Anleitung zur Verfügung, wie man das Agarose-Gel vorbereitet, die Proben lädt, die DNA Fragmente visualisiert, und das Gel und den Laufpuffer richtig entsorgt nachdem das Experiment abgeschlossen ist.

Procedure

Die DNA Gelelekrophorese ist ein Verfahren, mit dem man DNA Fragmente nach ihrer Größe auftrennen und identifizieren kann.

Verschieden große DNA Fragmente werden auf ein poröses Gel aus Agarose – einem Kohlenhydrat der roten Alge – aufgetragen.

Wenn ein elektrisches Feldes angelegt wird, migrieren die Fragmente dank der negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA Nukleotiden durch das Gel.

Kleinere Stücke der DNA können einfacher durch das Gel migrieren als größere Stücke, für welche es schwieriger ist sich durch die Gelmatrix zu bewegen.

Wenn der Lauf abgeschlossen ist, kann die Position der DNA Proben mit einer Reihe von DNA Fragmenten (oder Banden) verglichen werden, die bekannte Größen haben und auch DNA-Leiter genannt werden.

Das Vorhandensein des jeweiligen Fragments kann dann anhand dessen Größe bestätigt werden, welche durch den Vergleich der relativen Position der Probe zu den Fragmenten der DNA-Leiter, bestimmt werden kann.

Agarose-Gele werden durch die Verwendung einer massenprozentigen Lösung hergestellt. Das heißt das 1 Gramm Agarose in 100ml Puffer ein 1% Gel ergibt. Gele mit niedriger Agarosekonzentration können größere Fragmente besser auflösen, wohingegen Gele mit höherer Agarosekonzentration besser für den Nachweis kleinerer Fragmente sind. Um ein Gel herzustellen, wiegt man zuerst die benötigte Masse an Agarose in einem Erlenmeyerkolben ein.

Nun füllt man Laufpuffer in den Erlenmeyerkolben. Das Puffervolumen sollte nicht mehr als 1/3 des Fassungsvolumens des Erlenmeyerkolbens sein. Nun schwenkt man die Lösung, um sie zu vermischen.

Die Agarose/Puffer Mischung wird dann durch Erhitzen in der Mikrowelle bei maximaler Leistung geschmolzen. Alle 30s entnimmt man den Erlenmeyerkolben, um den Inhalt richtig zu mischen. Das wiederholt man so lange, bis die Agarose komplett aufgelöst ist.

Danach gibt man das Ethidiumbromid hinzu, um eine Endkonzentration von 0.5 μg/ml zu erreichen. Ethidiumbromid ist ein aromatischer Stoff, der zwischen den DNA Basenpaaren interkaliert und dazu führt, dass die DNA beim beleuchten mit UV Licht ein intensiv fluoreszierendes Orange emittiert. Es ist wichtig zu wissen, dass Ethidiumbromid ein krebserregender Stoff ist und man deshalb immer Handschuhe tragen sollte wenn man mit Ethidiumbromid arbeitet.

Damit sich der Gelschlitten nicht verformt, lässt man die Agarose in einem 65ºC warmen Wasserbad abkühlen.

Während die Agarose abkühlt, bereitet man die Gießform vor, indem man den Gelschlitten in den Gießstand setzt. Alternativ kann man auch die offenen Enden des Gelschlittens zukleben, um die Gelform zu erzeugen. Durch das Einsetzen des Kamms entstehen die Geltaschen, in welche die DNA aufgetragen wird. Man sollte einen Kamm wählen, mit dem eine Geltasche entsteht, welche die DNA Probe komplett fassen kann.

Nun gießt man die geschmolzene Agarose in den vorbereiteten Gelschlitten und lässt sie bei Zimmertemperatur fest werden.

Nachdem die Agarose fest ist, entnimmt man den Kamm. Wenn das Gel nicht gleich verwendet wird, wickelt man es in Plastikfolie ein und lagert es bis zur Benutzung bei 4ºC.

Wenn man das Gel gleich benutzt, setzt man es in die Elektrophoresekammer.

Jetzt schaltet man die Stromversorgung an. Das Gel wird laufen gelassen, bis die Farbestoffe im Auftragspuffer die richtige Länge migriert sind.Nun schließt man die Elektrophoresekammer wieder. Man sollte sich nochmals versichern, dass die Anschlüsse in der richtigen Position mit der Stromversorgung verbunden sind.Nun nimmt man die Abdeckung der Elektrophoresekammer ab. Die DNA Proben werden langsam und vorsichtig auf das Gel aufgetragen. Nochmals: der Auftragspuffer in der Probe ermöglicht es den Proben in die Geltaschen zu sinken und hilft dabei festzustellen wie weit die Proben schon migriert sind. Ein DNA Größenstandard, oder eine DNA-Leiter, sollte immer neben den experimentellen Proben aufgetragen werden.Nun verbindet man die Anschlüsse der Elektrophoresekammer mit der Stromversorgung. Die DNA ist negativ geladen, das heißt sie migriert in Richtung der Anode, welche positiv und normalerweise rot markiert ist. Man sollte sicherstellen, dass man nicht den schwarzen Anschluss, also die Kathode, mit der Unterseite des Gels verbindet. Um sich das besser zu merken, kann man sich die folgende Eselsbrücke einprägen: schwarze Katzen bringen Unglück (was negativ ist) – das heißt die schwarze Kathode ist negativ. Man lässt das Gel also in Richtung der roten Anode laufen. Um sicherzustellen dass sowohl die Elektrophoresekammer als auch die Stromversorgung richtig funktionieren, sollte man nachschauen das sich kleine Blasen an den Elektroden bilden, die darauf hindeuten das Strom fließt.Danach gibt man genügend Laufpuffer in die Elektrophoresekammer, um die Oberfläche des Gels zu bedecken. Man sollte sicherstellen, dass der Laufpuffer der Gleiche ist wie der Puffer, der für die Herstellung des Gels verwendet wurde.Jetzt stellt man die Stromversorgung auf die gewünschte Spannung ein. Zuerst gibt man DNA-Auftragspuffer zu den DNA Proben, die aufgetrennt werden sollen. Der Auftragspuffer ist normalerweise eine 6X Lösung. Der Auftragspuffer hilft bei der Visualisierung und beim Auftragen der Proben in die Geltaschen. Außerdem hilft er dabei festzustellen, wie weit die Proben während des Laufs migriert sind.

Wenn die Gelelektrophorese abgeschlossen ist, schaltet man die Stromversorgung aus und nimmt die Abdeckung der Elektrophoresekammer ab.

Man nimmt den Gelschlitten aus der Elektrophoresekammer und lässt den überschüssigen Puffer von der Geloberfläche abfließen. Der Gelschlitten wird auf ein Papiertuch gesetzt, das den überschüssigen Laufpuffer aufsaugt.

Um die DNA Fragmente zu visualisieren, nimmt man das Gel von dem Gelschlitten und beleuchtet es mit UV Licht.

Die DNA Fragmente sollten als orange fluoreszierende Banden erscheinen. Nun macht man ein Bild von dem Gel.

Nach dem Experiment entsorgt man das Gel und den Laufpuffer gemäß den Vorschriften des jeweiligen Instituts. Nochmals: vergesst nicht das Gel und den Laufpuffer immer mit Handschuhen anzufassen, um direkten Kontakt mit dem Ethidiumbromid zu vermeiden.

Nun das ihr gesehen habt wie man die DNA-Elektrophorese durchführt, schauen wir uns einige Anwendungen und Variationen dieser sehr nützlichen Methode an.

Hier seht ihr das Ergebnis einer Agarose-Gelelektrophorese nachdem PCR-Produkte aufgetrennt wurden. Die DNA Fragmente, die in das Gel aufgetragen wurden, sieht man als klar definierte Banden. Der DNA Größenstandard (oder die DNA Leiter) sollten so aufgetrennt werden, dass sie die Bestimmung der Größe der Banden in der Probe ermöglichen. In diesem Beispiel sind die DNA Fragmente 765 Basenpaare, 880 Basenpaare und 1022 Basenpaare, in einem 1.5% Agarose-Gel mit einer log2-DNA-Leiter.

Zusätzlich zu der Bestätigung des Vorhandenseins des DNA Fragments kann die DNA Gelelektrophorese mit der Gelaufreinigung kombiniert werden. Normalerweise wird eine Rasierklinge benutzt, um das DNA Fragment von Interesse auszuschneiden, so dass man daraus DNA zurückgewinnen kann.

Die Gelelektrophorese kann auch zusammen mit einem Transferblot benutzt werden, bei welchem man DNA oder RNA auf eine Zellulosemembran transferiert, um dann spezifische DNA oder RNA Sequenzen in der elektrophoretisch aufgetrennten Probe mittels Radioaktivität zu identifizieren.

Die normale DNA Gelelektrophorese ist nicht ideal um DNA mit hoher molekularer Masse von mehr als 15-20kb (beispielsweise genomische DNA) aufzutrennen. Um große DNA Proben aufzutrennen, benutzt man die “Puls-Feld” Gelelektrophorese, bei der man das Gel einem wechselnden, oder pulsierenden, elektrischen Feld in verschiedenen Richtungen, aussetzt. Bei dieser Methode benötigt man eine spezielle Elektrophoresekammer, bei der Elektrodenpaare in verschiedenen Richtungen um das Gel herum angebracht sind. Dieses Verfahren kann benutzt werden, um Unterschiede in der Genomgröße zwischen verschiedenen Populationen von Organismen zu bestimmen, wie zum Beispiel den vermischten DNA Proben von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften, die von verschiedenen Teilen eines Sees entnommen worden sind.

Das war die Einführung in die DNA Gelelektrophorese. Wir haben die Konzepte behandelt, auf denen diese Methode beruht, und außerdem gezeigt, wie man ein Agarose-Gel herstellt, wie man die Proben aufträgt, wie man das Gel laufen lässt, und wie man das Gel analysiert. Außerdem haben wir uns ein paar häufige Anwendungen angeschaut. Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit und viel Glück beim Laufen des Gels.

Transcript

DNA Gel Electrophoresis is a technique used to separate and identify DNA fragments based on size.

DNA fragments of various sizes are loaded into a porous gel made from agarose – a carbohydrate found in red algae.

When an electric field is applied, the fragments will migrate through the gel, thanks to the negatively charged phosphate groups in DNA nucleotides.

Smaller pieces of DNA will more easily migrate through the gel than larger fragments, which have a more difficult time moving through the gel matrix.

When the gel run is complete the location of your DNA samples can be compared to a series of fragments or bands of known sizes, called a DNA ladder.

The presence of your fragment of interest can then be confirmed based on its size, which is determined by comparing the relative location of your test sample to the fragments of the ladder.

Agarose gels are prepared using a weight over volume percentage solution. So 1 gram of agarose in 100 ml of buffer will make a 1% gel. Lower percent gels will better resolve larger fragments and higher percent gels will make smaller fragments easier to identify. To start the gel-making procedure, weigh out the appropriate mass of agarose into an Erlenmeyer flask.

Add running buffer to the flask, so that the volume of buffer is no greater than 1/3 of the capacity of the flask. Then swirl to mix.

Melt the agarose/buffer mixture by heating in a microwave at maximum power. Every thirty seconds, remove the flask and swirl the contents to mix well. Repeat until the agarose has completely dissolved.

Next add ethidium bromide to a concentration of 0.5 mg/ml. Ethidium Bromide is an aromatic compound that fits in between individual base pairs of DNA, or intercalates, and causes DNA to emit intense orange fluorescence under UV light. It is important to note that ethidium bromide is a carcinogen so gloves should always be worn when handling gels containing this compound.

To prevent the gel tray from warping, let the agarose cool by placing it in a 65ºC water bath.

As the agarose is cooling, prepare the gel mold by placing the gel tray into the casting apparatus. As an alternative, you can use tape to seal the open edges of the gel tray to create the mold. Placing a comb into the gel creates the wells where DNA is loaded. Make sure the comb will create a well that is the appropriate size for your DNA sample.

Pour the molten agarose into the gel mold and allow it to harden at room temperature.

After the agarose has hardened, take out the comb. If the gel is not going to be used immediately, wrap it in plastic wrap and store at 4ºC until use.

If the gel is going to be used immediately, place it in the gel box.

To begin this procedure, add gel-loading dye to the DNA samples to be separated. Loading dye is typically made at a 6X concentration. Loading dye helps to visualize and load samples into the wells and helps determine how far the samples have migrated during the run.

Set the power supply to the desired voltage.

Now add enough running buffer into the gel box to cover the surface of the gel. Make sure to use the same running buffer as the one used to prepare the gel.

Connect the leads of the gel box to the power supply and turn it on. Remember that DNA is negatively charged and will move toward the anode, which is positive, and generally red in color. Make sure not to connect the black lead, or cathode, to the bottom of the gel box. So you don’t forget, keep in mind that black cats are bad luck, or negative, and the black CAThode is therefore negative. Run your gel to red, or the anode. To verify that both the gel box and the power supply are working; the appearance of bubbles at the electrodes indicates that current is passing through.

Remove the lid of the gel box. Slowly and carefully load the DNA samples into the gel. Again, the loading dye in the sample allows the sample to sink into the gel and will help to track how far the sample has traveled. A DNA size marker, or ladder, should always be loaded along with the experimental samples.

Replace the lid. Double check that the electrodes are plugged into the correct slots in the power supply.

Turn on the power. Run the gel until the dye has migrated to an appropriate distance.

When the electrophoresis run is complete, turn off the power supply and remove the lid of the gel box.

Remove the gel from the gel box and drain off excess buffer on the surface of the gel. Place the gel tray on paper towels to absorb any remaining running buffer.

To visualize the DNA fragments, remove the gel from the gel tray and expose the gel to ultra violet light.

DNA fragment should show up as orange fluorescent bands. Take a picture of the gel.

At the end of the experiment, properly dispose of the gel and running buffer per institution regulations. Again, remember to always handle the gel and running buffers with gloves to avoid ethidium bromide exposure.

Now that you’ve seen how to perform DNA gel electrophoresis. Let’s have a look at some downstream applications and variations of this highly useful method.

Here you see an agarose gel electrophoresis result after separating PCR products. The DNA fragments loaded into the gel are visible as clearly defined bands. The DNA standard or ladder should be separated to a degree that allows for the useful determination of the sizes of sample bands. In this example, DNA fragments of 765 base pairs, 880 base pairs and 1022 base pairs are separated on a 1.5% agarose gel with a 2-log DNA ladder.

In addition to confirming the presence of a DNA fragment of interest, DNA gel electrophoresis can be combined with gel purification procedures. Typically a razor blade is used to cut out the DNA fragment of interest, so that it can be collected and the DNA sample within it recovered.

Agarose gel electrophesis can also be combined with transfer blotting, which involves allowing DNA, or RNA, to transfer to a cellulose membrane where radioactive probes can be used to identify specific DNA or RNA sequences in your electrophoretically-separated sample.

Standard DNA gel electrophoresis is not ideal for the separation of high molecular weight DNA greater than 15-20 kb in size, like genomic DNA. To separate large DNA samples, pulse field gel electrophoresis is used, which involves subjecting the gel to a changing, or pulsing, electric field in different directions. This technique involves a specialized gel running apparatus, which has pairs of electrodes arrayed in different orientations around the gel. This can be used to detect differences in genome sizes between populations of organisms, like the pooled DNA samples from different microbial communities, you see here which are taken from different lake environments.

You’ve just seen an introduction to DNA gel electrophoresis. We showed you the concept behind the method, how to prepare the agarose gel, how to load your samples, how to run the gel, and analyze it and some common applications of agarose gel electrophoresis. Thanks for watching and good luck with running your gel.

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