DNA-Gelelektrophorese

Die DNA Gelelekrophorese ist ein Verfahren, mit dem man DNA Fragmente nach ihrer Größe auftrennen und identifizieren kann.

Verschieden große DNA Fragmente werden auf ein poröses Gel aus Agarose – einem Kohlenhydrat der roten Alge – aufgetragen.

Wenn ein elektrisches Feldes angelegt wird, migrieren die Fragmente dank der negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA Nukleotiden durch das Gel.

Kleinere Stücke der DNA können einfacher durch das Gel migrieren als größere Stücke, für welche es schwieriger ist sich durch die Gelmatrix zu bewegen.

Wenn der Lauf abgeschlossen ist, kann die Position der DNA Proben mit einer Reihe von DNA Fragmenten (oder Banden) verglichen werden, die bekannte Größen haben und auch DNA-Leiter genannt werden.

Das Vorhandensein des jeweiligen Fragments kann dann anhand dessen Größe bestätigt werden, welche durch den Vergleich der relativen Position der Probe zu den Fragmenten der DNA-Leiter, bestimmt werden kann.

Agarose-Gele werden durch die Verwendung einer massenprozentigen Lösung hergestellt. Das heißt das 1 Gramm Agarose in 100ml Puffer ein 1% Gel ergibt. Gele mit niedriger Agarosekonzentration können größere Fragmente besser auflösen, wohingegen Gele mit höherer Agarosekonzentration besser für den Nachweis kleinerer Fragmente sind. Um ein Gel herzustellen, wiegt man zuerst die benötigte Masse an Agarose in einem Erlenmeyerkolben ein.

Nun füllt man Laufpuffer in den Erlenmeyerkolben. Das Puffervolumen sollte nicht mehr als 1/3 des Fassungsvolumens des Erlenmeyerkolbens sein. Nun schwenkt man die Lösung, um sie zu vermischen.

Die Agarose/Puffer Mischung wird dann durch Erhitzen in der Mikrowelle bei maximaler Leistung geschmolzen. Alle 30s entnimmt man den Erlenmeyerkolben, um den Inhalt richtig zu mischen. Das wiederholt man so lange, bis die Agarose komplett aufgelöst ist.

Danach gibt man das Ethidiumbromid hinzu, um eine Endkonzentration von 0.5 μg/ml zu erreichen. Ethidiumbromid ist ein aromatischer Stoff, der zwischen den DNA Basenpaaren interkaliert und dazu führt, dass die DNA beim beleuchten mit UV Licht ein intensiv fluoreszierendes Orange emittiert. Es ist wichtig zu wissen, dass Ethidiumbromid ein krebserregender Stoff ist und man deshalb immer Handschuhe tragen sollte wenn man mit Ethidiumbromid arbeitet.

Damit sich der Gelschlitten nicht verformt, lässt man die Agarose in einem 65ºC warmen Wasserbad abkühlen.

Während die Agarose abkühlt, bereitet man die Gießform vor, indem man den Gelschlitten in den Gießstand setzt. Alternativ kann man auch die offenen Enden des Gelschlittens zukleben, um die Gelform zu erzeugen. Durch das Einsetzen des Kamms entstehen die Geltaschen, in welche die DNA aufgetragen wird. Man sollte einen Kamm wählen, mit dem eine Geltasche entsteht, welche die DNA Probe komplett fassen kann.

Nun gießt man die geschmolzene Agarose in den vorbereiteten Gelschlitten und lässt sie bei Zimmertemperatur fest werden.

Nachdem die Agarose fest ist, entnimmt man den Kamm. Wenn das Gel nicht gleich verwendet wird, wickelt man es in Plastikfolie ein und lagert es bis zur Benutzung bei 4ºC.

Wenn man das Gel gleich benutzt, setzt man es in die Elektrophoresekammer.

Jetzt schaltet man die Stromversorgung an. Das Gel wird laufen gelassen, bis die Farbestoffe im Auftragspuffer die richtige Länge migriert sind.Nun schließt man die Elektrophoresekammer wieder. Man sollte sich nochmals versichern, dass die Anschlüsse in der richtigen Position mit der Stromversorgung verbunden sind.Nun nimmt man die Abdeckung der Elektrophoresekammer ab. Die DNA Proben werden langsam und vorsichtig auf das Gel aufgetragen. Nochmals: der Auftragspuffer in der Probe ermöglicht es den Proben in die Geltaschen zu sinken und hilft dabei festzustellen wie weit die Proben schon migriert sind. Ein DNA Größenstandard, oder eine DNA-Leiter, sollte immer neben den experimentellen Proben aufgetragen werden.Nun verbindet man die Anschlüsse der Elektrophoresekammer mit der Stromversorgung. Die DNA ist negativ geladen, das heißt sie migriert in Richtung der Anode, welche positiv und normalerweise rot markiert ist. Man sollte sicherstellen, dass man nicht den schwarzen Anschluss, also die Kathode, mit der Unterseite des Gels verbindet. Um sich das besser zu merken, kann man sich die folgende Eselsbrücke einprägen: schwarze Katzen bringen Unglück (was negativ ist) – das heißt die schwarze Kathode ist negativ. Man lässt das Gel also in Richtung der roten Anode laufen. Um sicherzustellen dass sowohl die Elektrophoresekammer als auch die Stromversorgung richtig funktionieren, sollte man nachschauen das sich kleine Blasen an den Elektroden bilden, die darauf hindeuten das Strom fließt.Danach gibt man genügend Laufpuffer in die Elektrophoresekammer, um die Oberfläche des Gels zu bedecken. Man sollte sicherstellen, dass der Laufpuffer der Gleiche ist wie der Puffer, der für die Herstellung des Gels verwendet wurde.Jetzt stellt man die Stromversorgung auf die gewünschte Spannung ein. Zuerst gibt man DNA-Auftragspuffer zu den DNA Proben, die aufgetrennt werden sollen. Der Auftragspuffer ist normalerweise eine 6X Lösung. Der Auftragspuffer hilft bei der Visualisierung und beim Auftragen der Proben in die Geltaschen. Außerdem hilft er dabei festzustellen, wie weit die Proben während des Laufs migriert sind.

Wenn die Gelelektrophorese abgeschlossen ist, schaltet man die Stromversorgung aus und nimmt die Abdeckung der Elektrophoresekammer ab.

Man nimmt den Gelschlitten aus der Elektrophoresekammer und lässt den überschüssigen Puffer von der Geloberfläche abfließen. Der Gelschlitten wird auf ein Papiertuch gesetzt, das den überschüssigen Laufpuffer aufsaugt.

Um die DNA Fragmente zu visualisieren, nimmt man das Gel von dem Gelschlitten und beleuchtet es mit UV Licht.

Die DNA Fragmente sollten als orange fluoreszierende Banden erscheinen. Nun macht man ein Bild von dem Gel.

Nach dem Experiment entsorgt man das Gel und den Laufpuffer gemäß den Vorschriften des jeweiligen Instituts. Nochmals: vergesst nicht das Gel und den Laufpuffer immer mit Handschuhen anzufassen, um direkten Kontakt mit dem Ethidiumbromid zu vermeiden.

Nun das ihr gesehen habt wie man die DNA-Elektrophorese durchführt, schauen wir uns einige Anwendungen und Variationen dieser sehr nützlichen Methode an.

Hier seht ihr das Ergebnis einer Agarose-Gelelektrophorese nachdem PCR-Produkte aufgetrennt wurden. Die DNA Fragmente, die in das Gel aufgetragen wurden, sieht man als klar definierte Banden. Der DNA Größenstandard (oder die DNA Leiter) sollten so aufgetrennt werden, dass sie die Bestimmung der Größe der Banden in der Probe ermöglichen. In diesem Beispiel sind die DNA Fragmente 765 Basenpaare, 880 Basenpaare und 1022 Basenpaare, in einem 1.5% Agarose-Gel mit einer log2-DNA-Leiter.

Zusätzlich zu der Bestätigung des Vorhandenseins des DNA Fragments kann die DNA Gelelektrophorese mit der Gelaufreinigung kombiniert werden. Normalerweise wird eine Rasierklinge benutzt, um das DNA Fragment von Interesse auszuschneiden, so dass man daraus DNA zurückgewinnen kann.

Die Gelelektrophorese kann auch zusammen mit einem Transferblot benutzt werden, bei welchem man DNA oder RNA auf eine Zellulosemembran transferiert, um dann spezifische DNA oder RNA Sequenzen in der elektrophoretisch aufgetrennten Probe mittels Radioaktivität zu identifizieren.

Die normale DNA Gelelektrophorese ist nicht ideal um DNA mit hoher molekularer Masse von mehr als 15-20kb (beispielsweise genomische DNA) aufzutrennen. Um große DNA Proben aufzutrennen, benutzt man die “Puls-Feld” Gelelektrophorese, bei der man das Gel einem wechselnden, oder pulsierenden, elektrischen Feld in verschiedenen Richtungen, aussetzt. Bei dieser Methode benötigt man eine spezielle Elektrophoresekammer, bei der Elektrodenpaare in verschiedenen Richtungen um das Gel herum angebracht sind. Dieses Verfahren kann benutzt werden, um Unterschiede in der Genomgröße zwischen verschiedenen Populationen von Organismen zu bestimmen, wie zum Beispiel den vermischten DNA Proben von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften, die von verschiedenen Teilen eines Sees entnommen worden sind.

Das war die Einführung in die DNA Gelelektrophorese. Wir haben die Konzepte behandelt, auf denen diese Methode beruht, und außerdem gezeigt, wie man ein Agarose-Gel herstellt, wie man die Proben aufträgt, wie man das Gel laufen lässt, und wie man das Gel analysiert. Außerdem haben wir uns ein paar häufige Anwendungen angeschaut. Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit und viel Glück beim Laufen des Gels.