Proteinauftrennung mittels SDS-PAGE

Separating Protein with SDS-PAGE

JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Separating Protein with SDS-PAGE

2.2: Gel Purification

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07:29 min

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February 01, 2013

Overview

Die Natriumdodecylsulfat Polyacylamid-Gelelektrophorese, oder SDS-PAGE, ist ein häufig angewandtes Verfahren, um Proteingemische auf ihrer Größe basierend aufzutrennen. SDS, ein anionisches Tensid, wird benutzt um eine gleichmäßige Ladung um die ganze Länge des linearisierten Proteins, zu erzeugen. Durch das Beladen und Laufen des Polyacrylamid-Gels mit einem elektrischen Feld werden die Proteine, welche mit SDS umschlossen sind, aufgetrennt. Das elektrische Feld führt dazu, dass die mit SDS eingedeckten Proteine in Richtung der Anode migrieren, wobei größere Proteine langsamer als kleinere Proteine sind. Um die Größe der Proteine zu bestimmen, lässt mein einen Molmassen-Standard zusammen mit den Proben unter den gleichen Bedingungen in dem Gel laufen.

Dieses Video präsentiert eine Einführung in das SDS-PAGE. Zuerst wird die Theorie, die hinter dem SDS-PAGE steht, erklärt, und dann eine Schritt-für-Schritt Anleitung gegeben. Außerdem erläutern wir verschiedene experimentelle Parameter, wie zum Beispiel die angelegte Spannung oder die Dichte des Polyacrylamid-Gels. Dann werden verschiedenen Methoden zur Färbung des Gels und Abwandlungen der Methode, wie die 2-D Gelelktrophorese, präsentiert.

Procedure

Das SDS-PAGE ist eine Methode, die von vielen Forschern benutzt wird, um Proteingemische aufzutrennen. Die erfolgreiche Ausführung dieses Verfahrens ist der erste wichtige Schritt in vielen verschiedenen Methoden zur Proteinanalyse, wie zum Beispiel dem Immunblot. Als alleinstehende Methode ist es ein wichtiges Werkzeug, um die Größe und Reinheit von Proteinen zu begutachten.

Um das SDS-PAGE zu verstehen, müssen wir zuerst dessen grundlegende Bestandteile verstehen. SDS-PAGE steht für Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Der erste Teil davon, also das Natriumdodecylsulfat (oder SDS), ist ein anionisches Tensid. Das heißt, dass es aus einer hydrophilen Gruppe mit einer negativen Nettoladung und einer hydrophoben Kette mit einer neutralen Ladung besteht.

Die hydrophoben Ketten umschließen die Proteine relativ zu ihrer Masse mit einem Verhältnis von 1.4 Gramm SDS pro Gramm Protein. Das ist der Grund, weshalb die Proteine in einem elektrischen Feld nach ihrer Größe aufgetrennt werden können.

Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese beinhaltet die Benutzung eines Hydrogels aus Polyacrylamid. Polyacrylamid ist ein Polymer, der eine sehr geordnete Matrix bildet, durch welche die Proteine migrieren können. Je höher die Konzentration des Gels, desto langsamer durchqueren die Proteine das Gel in einem elektrischen Feld. Das Verfahren, bei dem man ein räumlich gleichmäßiges elektrisches Feld benutzt, um die Bewegung eines Objektes zu beeinflussen, nennt man Elektrophorese.

SDS-PAGE wird für Proteine angewandt, die von vielen verschiedenen Quellen, wie zum Beispiel aus Zellen in Kultur, Geweben, Blut, Urin, oder Hefe, isoliert worden sind.

Proteine, die von diesen verschiedenen Quellen isoliert worden sind, müssen zuerst mit Verfahren wie Homogenisierung und Zentrifugierung von anderen zellulären Komponenten getrennt werden. Oft ist der nächste Schritt dann die Benutzung von Puffern für den Zellaufschluss.

Nachdem das Protein isoliert wurde, wird oft die Konzentration bestimmt, um sicherzustellen, dass die gleiche Menge an Proteinproben geladen wird. Die Konzentration wird mit einem kolometrischen Verfahren, durch das Vergleichen der Menge des Proteins zu einen Albuminstandard in Bicinchoninsäure, oder BCA, bestimmt.

Es ist wichtig, dass man nicht vergisst den Probenpuffer zu den Proben hinzu zu geben. Der Probenpuffer hat 3 Funktionen. Erstens denaturiert er die Proteine dank des SDS und anderer reduzierender Reagenzien. Das heißt im Grunde genommen, dass die komplexe Proteinstruktur in eine lineare Aminosäurekette umgewandelt wird. Zweitens enthält der Probenpuffer Glyzerin, welches bewirkt das die Probe nicht wegfließt wenn man die Geltaschen belädt. Und letztens enthalten die meisten kommerziell erhältlichen Probenpuffer einen Farbstoff, wie zum Beispiel Bromophenolblau, welcher dabei hilft zu Messen wie weit die Elektrophorese bereits fortgeschritten ist.

Nachdem man den Probenpuffer hinzugibt, werden die Proben gemischt und für 5 Minuten gekocht. Das führt dazu, das die Disulfitbrücken in den Proteinen durch eine reduzierende Reagenz, wie zum Beispiel beta-Mercaptoethanol, gespaltet werden. Wenn alle Disulfidbrücken gespalten sind, kann das SDS die Proben gleichförmig umschließen.

Danach werden die Proben kurz zentrifugiert. Jetzt können sie in das Elektrophese-Gelsystem geladen werden.

Bevor die Proben aufgetragen werden, muss das Gelsystem erst einmal aufgebaut werden. Das fängt beim Kauf oder mit der Herstellung eines Polyacrylamid-Gels an. Fertig hergestellte Gele werden immer populärer, da das Polyacrylamid ein Neurotoxin ist und zu Hirnschäden führen kann. Das Gel besteht aus Geltaschen, in welche man die Proben aufträgt.

Wenn die Gele sicher platziert sind, füllt man die innere und die äußere Kammer mit einem Puffer, welcher die selbe Ionenkonzentration enthält wie der Puffer, der für die Herstellung des Gels benutzt wurde. Dadurch wird ein Stromkreis hergestellt, in welchem der Strom einfach von der Kathode, durch das Gel, zu der Anode, fließen kann.

Nun werden die Molmassen-Standards in das Gel aufgetragen, gefolgt von den Proben. Wenn das Gel läuft, erzeugt der Standard sichtbare Banden mit bekannten Größen. Zum Schluss können diese Banden benutzt werden, um die Größe der Proteine zu berechnen.

Wenn alle Proben aufgetragen sind, werden die negativen und positiven Anschlüsse der Gelkammer mit der Stromversorgung verbunden, die eine konstante Spannung für eine längere Zeitspanne bereitstellen muss. Gele werden normalerweise bei 60V gestartet bis die ganze Probe in eine Gelregion, die Sammelgel heißt, eingetreten ist. Danach wird die Spannung auf ~200V erhöht und das Gel für 30 Minuten bis 1 Stunde laufen gelassen, abhängig von der Größe und der Konzentration des Gels und der Größe des Zielproteins.

Wenn die Elektrophorese abgeschlossen ist, wird die Gelkassette entfernt und geöffnet, um das Gel zu entfernen. Das Gel kann dann mit den typischen Proteinfärbungen, wie dem Coomassieblau oder der Silberfärbung, eingefärbt werden, um die Proteinbanden zu visualisieren. Die Coomassiefärbung kann bis zu 50 Nanogramm des Proteins nachweisen, wohingegen die Silberfärbung sogar nur 1 Nanogramm eines Proteins nachweisen kann.

Bei der zweidimensionalen Gelelktrophorese werden die Proben nach zwei verschiedenen Eigenschaften, nacheinander aufgetrennt. Zuerst werden die Proben geladen und nach ihren isoelektrischen Punkten auf lokalisiserten pH-Gradienten getrennt. Die Proteine in den Gelstreifen werden dann denaturiert und auf ein Polyacrylamid-Gel aufgesetzt, wo sie durch ein frisches Gel räumlich festgehalten werden. Dann erfolgt die Separation in der zweiten Dimension durch SDS-PAGE.

Die isoelektrische Fokussierung ist nicht die einzigste, aber die häufigste, Anwendung der 2-D Gelelektrophorese. Die 2-D Gelelektrophorese ist ein wichtiges Werkzeug, um Proteinkomplexe und die suborganelle Organisation besser zu verstehen.

Nachdem das Gel gelaufen worden ist, transferiert man die Proteine für Analysezwecke häufig von dem Gel auf eine Membran die aus PVDF oder Nylon gefertigt ist. Dann können spezifische Antikörper benutzt werden, um Zielproteine auf der Membran nachzuweisen. Hier sieht man einen normalen Immunblot, in dem ein Forscher 3 verschiedene Signal-Amplifikationsverfahren verwendet hat, um festzustellen welches am besten das Protein Pit1 in mehreren seriellen Verdünnungen nachweist.

Das war die Einführung in SDS-PAGE von JoVE. Ihr solltet nun die verschiedenen Schritte in der Proteinauftrennung nach Größe verstehen, die mit dieser vielfältigen Methode möglich sind. Wie immer –Danke für eure Aufmerksamkeit.

Transcript

SDS-PAGE is a technique used by many researchers to separate mixtures of proteins by size. Successful completion of this technique is an essential first step for many methods of protein analysis, like immunoblotting. By itself, it is a useful tool in assessing protein size and purity.

In order to understand the SDS-PAGE technique, you must first understand its principle components. SDS-PAGE stands for Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis. Sodium-Dodecyl Sulfate, the first part of this, or “SDS”, is an anionic detergent. This means that it is composed of a hydrophilic group with a net negative charge and a long hydrophobic chain with neutral charge.

The hydrophobic chain blankets proteins in proportion to their mass at a rate of 1.4 grams of SDS per gram of protein. This provides the proteins with the driving force necessary for size driven separation in an electric field.

Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis utilizes a hydrogel made from polyacrylamide. Polyacrylamide is a polymer that forms a very regular matrix through which proteins can move. The more concentrated the gel is, the slower the proteins will traverse across it when exposed to an electric field. The process of using a spatially uniform electric field to influence an objects motion is known as electrophoresis.

SDS-PAGE is performed on proteins isolated from many different sources including cells in culture, tissues, blood, urine, and yeast.

Proteins from these various sources must first be separated from other cellular components using techniques including homogenization and centrifugation, often followed by the use of lysis buffers.

Once the protein is isolated, its concentration is often measured, to ensure equal loading of samples, by comparing the amount of protein in the sample to albumin standards in a Bicinchoninic acid, or BCA, colorimetric assay.

An important step to remember is the addition of the loading buffer. The loading buffer has 3 main functions. First, thanks to SDS and additional reducing agents, it denatures the proteins, which basically means it turns complex protein structures into a linear chain of amino acids. Secondly, it contains glycerin, which ensures that the sample doesn’t float away when it is loaded in the wells of the gel. And finally, most commercial loading buffers include a dye, such as bromophenol blue, which can be tracked to measure the progress of the electrophoresis step.

After adding the loading buffer, the samples need to be mixed and then boiled for 5 minutes. This allows the strong di-sulfide bonds in the proteins to be broken with the help of a reducing agent such as beta-mercaptoethanol. Once all the disulfide bonds are broken SDS can more evenly coat the proteins.

Next, the samples are quickly spun down and are then ready to be loaded into the gel system for electrophoresis.

Before the samples can be loaded, the gel system must first be assembled. This begins with the purchase or fabrication of a polyacrylamide gel. Premade gels are becoming more and more popular because acrylimide is neurotoxic and can cause brain damage. The gel cassette contains wells that are used to load the samples.

Once the gels are secured into place, the inner and outer chambers are filled with a buffer that contains the same concentration of ions used to make the gels. This creates an electrical circuit that passes seamlessly from the cathode, through the gel and into the anode.

Next, molecular weight ladders are typically loaded into the gel, followed by the samples. As the gel runs, the ladder will spread and create visible protein bands of known sizes. At the final steps, these bands can be used to calculate each protein’s size.

Once all the samples are loaded, the positive and negative terminals on the gel box are connected to a power source capable of maintaining a constant voltage for a long period of time. Gels are typically started at around 60V until the entire sample has entered the gel region called the “stacking gel”. Then, the voltage is increased to around 200V for 30 minutes to 1 hour depending on the size and concentration of the gel and the size of the protein of interest.

When electrophoresis is complete, the cassette is removed and opened to expose the gel. The gel can then be stained with a typical protein stain, such as coomassie blue or silver stain, to visualize the protein bands within the gel. Coomassie stain can detect bands with as little as 50 nanograms of protein, whereas silver stain can detect bands with as little as 1 nanogram of protein.

In two-dimensional gel electrophoresis, samples are separated by two separate properties on gels, one dimension at a time. First, samples are loaded and arranged according to their isoelectric points on localized pH gradient strips. The proteins in the strip are then denatured and are placed on top of a typical polyacrylamide gel where they are secured in place with fresh gel solution. Then, second dimension separation is performed by SDS-PAGE.

While isoelectric focusing isn’t the only option for 2-D gel electrophoresis, it is the most common. Two-dimensional gel electrophoresis is an invaluable tool that provides insights into protein complexes and sub-organelle organization.

After running the gel, a very common next step is to transfer the proteins from the gel onto a membrane made of PVDF or nylon for analysis. You can then use specific antibodies to probe the membrane and look for proteins of interest. Shown here are typical immunoblot results where the researcher used 3 different signal amplification techniques to determine which best shows the presence of the Pit-1 protein throughout a number of serial dilutions.

You’ve just watched JoVE’s video on protein separation using SDS-PAGE. You should now understand the steps involved in resolving a protein by size using this powerful technique. As always, thanks for watching!

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