Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates
26. September 2013
Im Jahr 2001 beschrieben Forscher an der UCLA die Isolierung einer Population von adulten Stammzellen, sogenannte Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, aus dem Fettgewebe. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung des ASC aus lipoaspirates mit einem manuellen, enzymatische Verdauung mit Kollagenase-Protokoll.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, aus Fett gewonnene Stammzellen aus dem in Form eines Lipo-Aspirats gewonnenen Fett zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die chirurgische Lösung entfernt und das Aspirat von kontaminierenden roten Blutkörperchen gewaschen wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Stammzellen über den enzymatischen Verdau des gewaschenen Lipo-Aspirats mit Kollagenase freizusetzen.
Anschließend werden die freigesetzten Zellen in Form einer stromalen Gefäßfraktion (SVF) durch Zentrifugation gesammelt. Der letzte Schritt besteht darin, den Überstand und die Platte, die SVF-Zellen für die Selektion und Kultivierung der adhärenten ASCs zu entfernen. Letztendlich in vitro Induktion dieser kultivierten ASCs in Richtung Knochen, Fett und Knorpel.
Abstammungslinien können verwendet werden, um das Vorhandensein dieser Zellen in der Kultur zu bestätigen und ihre Multipotentialität zu bestätigen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Logistik der Arbeit mit großen Mengen an Lipo-Aspirin vor der Zellentnahme Schwierigkeiten haben. Bereiten Sie sterile Kollagenase Typ eins eine Lösung und steriles Kontrollmedium vor.
Sammeln Sie das Lippenaspirat in einem Aspirationsbehälter. Dekantieren Sie das Lippo-Aspirat vorsichtig in einen sterilen Ein-Liter-Glaslautsprecher. Wenn sich die Lippenansaugschichten durch die Schwerkraft getrennt haben, saugen Sie die oberste Ölschicht an, falls vorhanden.
Entfernen Sie auch das untere Inat. Beurteilen Sie das Volumen der resultierenden Fettgewebsschicht. Fügen Sie ein gleiches Volumen sterilen XPBS hinzu und rühren Sie mit der Pipette um, die zur Aspiration verwendet wird.
Wenn sich die beiden Schichten abgesetzt haben, aspirieren Sie das Inat mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette. Waschen Sie die Fettgewebsfraktion weiter mit PBS, bis die Fettschicht eine gelbgoldene Farbe hat. Aspirieren Sie das Inat ein letztes Mal, wobei Sie die Fettgewebsfraktion belassen.
Im Glaslautsprecher. Lassen Sie die Lippenaspiratschichten nach der letzten Wäsche und vor der letzten Aspiration fünf Minuten lang absetzen. Bereiten Sie in einer Filtereinheit sterile Kollagenase eine Lösung vor.
Fügen Sie ein Volumen hinzu, das dem der Fettfraktion und des Sterilfilters entspricht. Gießen Sie dann die gewaschene Fettfraktion vorsichtig in die Kollagenaselösung und verschließen Sie die Flasche fest. Inkubieren Sie dann das Kollagenase-Fettgemisch 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad mit leichtem Schwenken alle fünf bis 10 Minuten, bewerten Sie die Fettgewebeschicht für ein glatteres Aussehen im Laufe der Verdauung und erhöhen Sie gegebenenfalls die Reaktionszeit, um feste Fettstücke aufzulösen.
Die Filtereinheit mit dem verdauten Kollagenase-Fettgemisch mit 70%igem Ethanol sterilisieren und wieder in die Biosicherheitswerkbank stellen. Pipettieren Sie nun 25 Milliliter Aliquots des Inats, das die stromale Gefäßfraktion enthält, in sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 25 Milliliter Kontrollmedium in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Kollagenase zu inaktivieren.
Dann zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 1.200 mal G, um die stromale Gefäßfraktion als Pellet in der Biosicherheitswerkbank zu sammeln. Saugen Sie den Überstand aus jedem Rohr an. Es ist sicherzustellen, dass die oberste Ölschicht und alle schwimmenden Adipozyten mit diesem Überstand abgesaugt werden.
Kombinieren Sie dann die SVF-Pellets in einem Zentrifugenröhrchen mit 30 Millilitern konditioniertem Medium und verteilen Sie sie gleichmäßig auf zwei neue 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, nachdem die Zentrifugation die Überstände aus den beiden Pellets aspiriert hat. Wenn eine Erythrozytenlyse gewünscht wird, können diese beiden Pellets jeweils in 10 Millilitern eines Erythrozytenlysepuffers resuspendiert und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert werden. Nach der Zentrifugation werden die Überstände aspiriert, um Pellets der stromalen Gefäßfraktion zu erhalten.
Kombinieren Sie diese beiden Pellets zu einem neuen Zentrifugenröhrchen. Mit fünf bis 10 Millilitern Kontrollmedium können große Gewebepartikel mit einem 100-Mikron-Maschenfilter herausgefiltert werden, der auf einem neuen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen platziert ist. Nun aliquotieren Sie die filtrierte Fraktion, die die Fettstammzellen enthält, auf Gewebekulturschalen.
Ergänzen Sie dann jedes Gericht mit einem angemessenen Maß an Kontrolle. Medienkultur. Die Zellen aspirieren die Kultur drei bis vier Tage lang ohne Medienwechsel und waschen die Zellen einmal mit sterilem PBS, um alle kontaminierenden roten Blutkörperchen zu entfernen, füllen dann das Medium auf und setzen die Kultur fort, wenn dieses manuelle Enzym zur Isolierung einer stromalen vaskulären Fraktion aus einer großvolumigen Lippenaspiratprobe verwendet wird.
Die resultierende kultivierte A-SC-Population ist relativ homogen im Aussehen und besteht aus Fibroblasten wie Zellen als beliebtestes Validierungsmittel. Die In-vitro-Induktion der A-SC-Population unter definierten Kulturbedingungen führt zu ihrer Differenzierung in mesodermale, ektodermale und endodermale Linien. Das in vitro Tri-Keimschichtpotenzial hat zur Verwendung von ASCs für eine Vielzahl von regenerativen Modellsystemen geführt.
Die Differenzierung in adipige, osteogene und kongene Zellen ist im Allgemeinen ausreichend, um das A SC zu identifizieren und seine Multipotenz zu bestätigen. Darüber hinaus können ASCs auch in skelettale myogene und glatte myogene Linien der ektodermalen Linie oder endodermale Leberzelllinie differenziert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine stromale Gefäßfraktion aus Lipos isolieren können.
Für die Zwecke von Turing handelt es sich um eine SC-Komponente.
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Übersicht
In diesem Artikel wird die Isolierung von aus Fettgewebe stammenden Stammzellen (ASCs) aus Lipoaspiraten mithilfe eines manuellen, enzymatischen Verdauungsprotokolls mit Kollagenase beschrieben. Der Prozess umfasst das Waschen des Aspirats, die enzymatische Verdauung und das Kultivieren der Zellen für weitere Untersuchungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Regenerativmedizin
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Stammzellen aus Fettgewebe (ASCs) sind eine aussichtsreiche Quelle für regenerative Therapien.
- ASCs können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, darunter Knochen-, Fett- und Knorpelzellen.
- Die Isolierung von ASCs aus Fettgewebe ist entscheidend für ihre Anwendung in Forschung und Therapie.
- Bisherige Studien haben Methoden zur ASC-Isolierung etabliert, doch die Optimierung ist weiterhin Gegenstand laufender Forschung.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Isolierung von ASCs aus Lipoaspiraten bereitzustellen.
- Die Effizienz der ASC-Isolierung für Forschungszwecke zu verbessern.
- Die Untersuchung der Differenzierung von ASCs und deren potenzielle therapeutische Anwendungen zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Entfernung der chirurgischen Lösung und Waschen des Lipoaspirats.
- Enzymatische Verdauung des gewaschenen Lipoaspirats mit Kollagenase.
- Sammlung der stromavaskulären Fraktion (SVF) durch Zentrifugation.
- Aussaat der SVF-Zellen zur Selektion und Kultur adhärenter ASCs.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von ASCs aus Lipoaspiraten mithilfe des beschriebenen Protokolls.
- Lebensfähige ASCs wurden gewonnen und für weitere Differenzierungsstudien kultiviert.
- Die Methode zeigte eine hohe Effizienz bei der Entfernung von Kontaminationen und Maximierung der Zellausbeute.
- ASCs zeigten in vitro ein Potenzial für die Differenzierung in mehrere Zelllinien.
Schlussfolgerungen
- Das beschriebene enzymatische Verdauungsprotokoll ist wirksam für die Isolierung von ASCs.
- Isolierte ASCs können für verschiedene Anwendungen in der regenerativen Medizin verwendet werden.
- Weitere Studien sind erforderlich, um das volle Potenzial von ASCs in therapeutischen Anwendungen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Isolierung von fettgewebsstämmigen Stammzellen (ASCs) aus Liposaspiraten bietet eine skalierbare Quelle für multipotente Zellen in der frühen regenerativen Medizin-Forschung. Dieses Protokoll ermöglicht die Zielvalidierung und phänotypische Untersuchung in krankheitsrelevanten Systemen, indem es adhärente ASC-Populationen erzeugt, die zu mehreren Zelllinien differenzieren können. Die Methode unterstützt die mechanistische Risikominderung und erhöht die Vorhersagegenauigkeit in präklinischen Modellen, da sie homogene, aus dem stromavaskulären Fraktion stammende Zellen für nachgeschaltete Anwendungen liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Heterogenität mesenchymaler stromaler Zellen und die funktionelle Validierung der Multipotenz von ASCs durch definierte Differenzierungsassays.
- Operativer Wert: Stellt eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von ASCs aus menschlichem Fettgewebe bereit und reduziert so die Variabilität bei der Beschaffung primärer Zellen für Target-Validierungsstudien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt adhärente ASC-Populationen, die für Screenings mit hohem Informationsgehalt bezüglich Verbindungen geeignet sind, die adipogene, osteogene oder chondrogene Signalwege modulieren.
- Operativer Wert: Liefert Pellets aus der stromavaskulären Fraktion (SVF), die über verschiedene Lipoaspiratvolumina hinweg standardisiert werden können und somit die Skalierbarkeit von Assays sowie die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren unterstützen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Die Differenzierung in adipogene, osteogene und chondrogene Linien bestätigt die funktionelle Potenz und ermöglicht den Einsatz in präklinischen Modellen der Geweberegeneration.
- Operativer Wert: Die skalierbare Isolierung aus voluminösen Liposuktionaten unterstützt eine gleichmäßige Zellversorgung für langfristige präklinische Studien und Arbeiten zur Zulassungsvorbereitung (IND-enabling).
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Workflow zur Isolierung von ASCs ist in die Entdeckungskette von der Zielidentifizierung bis zur Lead-Optimierung integriert und liefert eine nachwachsende Zellquelle für mechanistische Assays und phänotypische Screening-Verfahren vor der präklinischen Validierung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Stromazellfunktion und der Modulation von Signalwegen in menschlichen mesenchymalen Zellpopulationen.
- Screening: Erzeugt adhärente ASC-Monolagen mit konsistenter Morphologie für das Screening von Substanzbibliotheken und die Profilierung von Dosis-Wirkbeziehungen.
- Analytik: Ermöglicht die Quantifizierung der Differenzierungseffizienz mittels linienspezifischer Färbungen (z. B. Oil Red O, Alizarinrot) als quantitative Messgröße für Substanzeffekte.
- Translationale Forschung: Die Differenzierungsfähigkeit in mesodermale Linien unterstützt die Übertragung auf präklinische Modelle der Reparatur von Knochen, Fett und Knorpel.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die Anpassungsfähigkeit des Protokolls an unterschiedliche Lipoaspiratvolumina ermöglicht die Wiederverwendung über mehrere Projekte und therapeutische Anwendungsbereiche hinweg, ohne dass eine erneute Optimierung erforderlich ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten durch validierte Mehrfach-Potenz-Bewertung isolierter ASCs.
- Operationaler Wert: Standardisierung der enzymatischen Verdauung und der Waschschritte minimiert die Variabilität der SVF-Ausbeute von Charge zu Charge.
- Strategischer Wert: Fundierte Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf Differenzierungspotenzial reduzieren späte Ausscheidungen in regenerativen Programmen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von aus ASCs abgeleiteten Therapien, ermöglicht durch zuverlässige Potenzmetriken aus der in-vitro-Differenzierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Primärzellkultur und steriler Technik, um die Lebensfähigkeit der ASCs während der Isolierung aufrechtzuerhalten.
- Setzt den Zugang zu sterilem Kollagenase Typ I, Sicherheitswerkbänken und gekühlten Zentrifugen für die Verarbeitung der stromal-vaskulären Fraktion voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Waschprotokollen, um eine gleichmäßige Färbung des Fettgewebes und eine konsistente Entfernung von roten Blutkörperchen zu erreichen.
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen die Anpassung der Kollagenasekonzentration und der Inkubationszeit entsprechend der Dichte des Liposaspirats und der Variabilität des Spenders.
- Praktische Einschränkungen beinhalten die Variabilität der Zellausbeute, die mit dem Alter des Spenders, dem BMI und der Liposuktionsmethode verknüpft ist, wie in der Quelle angegeben.
