Name: Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kennzeichnung von Neutrophilen aus dem Knochenmark der Maus mittels Dichtegradientenzentrifugation und CellTracker-Farbstoffen. Diese Methode ermöglicht funktionelle Studien und adoptive Transferexperimente.

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Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA unterstützt. Alle Mäuse wurden an einer amerikanischen Vereinigung für die Akkreditierung von Laboratory Animal Care-akkreditierten Tierhaus am National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) gepflegt und untergebracht in Übereinstimmung mit den Verfahren in den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren skizzierten unter der Schirmherrschaft eines Protokolls von der Animal Care und Use Committee des NIAID genehmigt.

1. Isolierung von Knochenmarkszellen der Maus <ol><li> Euthanize Mäusen unter Verwendung des Organs Tierpflege-Ausschuss genehmigten Protokoll und sprühen das Tier Oberfläche mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Einschnitt der Haut in der Mitte des Bauches und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, welche die unteren Extremitäten. </li><li> Schneiden Sie die Muskeln der unteren Extremitäten mit einer Schere und sorgfältig verrücken die Pfanne aus dem Hüftgelenk, bei gleichzeitiger Vermeidung Brechen des Femurkopfes. </li><li> Entfernen Sie die restlichen Muskeln aus dem Oberschenkel und Schienbein mit einem Skalpell und Schere und trennen Sie die Oberschenkelknochen von der Tibia im Kniegelenk Ausübung Sorgfalt nicht brechen die Knochen endet. Legen Sie die Knochen in eine Petrischale mit eiskaltem RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin. </li><li> Fahren Sie mit den folgenden Schritten unter einer Gewebekultur Kapuze. Nehmen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahme strengen sterilen Techniken zu halten, um zu vermeiden neutrophil Aktivierung. </li><li> Spülen Sie jede Knochen mit 70% Ethanol (in einer Petrischale) durch drei nachfolgenden Wäschen in eiskaltem sterilem PBS (in Petrischalen) abzuspülen das Ethanol von der Oberfläche der Knochen gefolgt. </li><li> Innerhalb einer sauberen sterilen Petrischale, schneiden Sie die Epiphysen der Knochen und halten Sie sie beiseite. </li><li> Verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel und eine 12-ml-Spritze mit RPMI mit 10% FBS und 2 mM EDTA ergänzt gefüllt und bündig die Knochenmarkzellen von beiden Enden der Knochen Wellen auf einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit Schraubverschluss mit 100 um ausgestattet filtern. Um effizient zu entfernen alle Zellen, kratzen die innere Oberfläche des Knochens unter Verwendung des 25-Gauge-Nadel. </li></ol> HINWEIS: Blanchieren der Knochen zeigt, dass die Zellen wurden ausreichend abgeschabt. HINWEIS: Verwenden Sie ca. 10 ml Medium, um einen Oberschenkelknochen / Paar Schienbein zu spülen. Hinzufügen von EDTA zu dem Medium ist wichtig, um zu verhindern Verklumpung der Zellen. <ol start="9"><li> Schneiden Sie die Knochen Epiphysenin kleinen 0,5-1 mm 3 Stück mit einem Skalpell und zerschlagen sie durch die 100 um-Filter mit dem Back-End einer 2,5 ml Eppendorf Combitip plus Biopur Pipettenspitze. </li><li> Zentrifuge bei 1.400 rpm für 7 min bei 4 ° C. </li><li> Lyse der roten Blutkörperchen durch das Zellpellet in 20 ml 0,2% NaCl für etwa 20 Sekunden, gefolgt von der Zugabe von 20 ml 1,6% NaCl. (Critical: Überschreiten Sie nicht 20-30 sec von hypotonen Lyse Knochenmark Zelltod zu vermeiden Der Einsatz von hypotonen NaCl zur Lyse über ACK Lysepuffer wird empfohlen, da die letzteren hat das Potenzial, um die Neutrophilen zu aktivieren.). </li><li> Zentrifuge für 7 min bei 1.400 rpm bei 4 ° C zu sammeln die Zellen. </li><li> Waschen der Zellen mit RPMI 1640 1x mit 10% FBS und 2 mM EDTA supplementiert und Zentrifuge in Schritt 1.12. </li><li> Die Ausbeute von Knochenmarkzellen mit dieser Methode ist etwa 60 bis 80.000.000 pro infizierten 8-12 Wochen alte C57BL / 6 Maus. </li></ol> 2. Trennung von Neutrophilendurch Dichtegradientenzentrifugation <ol><li> Zählen Sie die Knochenmarkszellen und resuspendieren in 1 ml eiskaltem sterilem PBS. </li><li> 3 ml Histopaque 1119 (Dichte, 1.119 g / ml) in einem 15-ml konischen Röhrchen. </li><li> Overlay 3 ml Histopaque 1077 (Dichte 1,077 g / ml) auf die 3 ml Histopaque 1119. </li></ol> HINWEIS: Histopaque 1119 und 1077 Histopaque sollte auf 18-26 ° C erwärmt werden vor der Verwendung. Critical Schritt: Bereiten Gradienten unmittelbar vor der Verwendung als Vorbereitung der Gradient im Voraus in Diffusion zwischen den beiden Schichten und suboptimale Neutrophilen Reinheit und Erholung führen. Critical Schritt: Überlagerung Histopaque 1077 über 1119 muss langsam erfolgen, um zu vermeiden, das Mischen der beiden Dichten, die Trennung von Zellen während der Zentrifugation wird ausgeschlossen. <ol start="4"><li> Overlay das Knochenmark Zellsuspension auf der Oberseite des Histopaque 1077. </li></ol> Critical Schritt: OverlAying das Knochenmark Zellsuspension über Histopaque 1077 muss langsam erfolgen, um zu verhindern, daß die Schnittstelle zwischen den Zellen und Histopaque 1077. Hinweis: Das Resuspendieren Knochenmarkzellen von einem nicht infizierten Maus in 1 ml PBS ergibt Neutrophilen Reinheit von&gt; 90%. Allerdings Bündelung viele Knochenmarkproben beeinträchtigt Neutrophilen Reinheit, beispielsweise Resuspendieren 300 x 10 6 Zellen in 3 ml PBS verringert die neutrophile Reinheit von&gt; 90% auf ca. 80%. Daher sollten Ermittler führen Pilotversuche, um die idealen Zellzahl / Volumen Bedingungen für ihre spezifische Experimente identifizieren <ol start="5"><li> Zentrifuge für 30 min bei 2.000 rpm bei 25 ° C ohne Bremse. </li></ol> Hinweis: Zentrifugation der Gradienten bei Raumtemperatur ist kritisch und notwendig für eine effektive Trennung der Neutrophilen. <ol start="6"><li> Sammeln der Neutrophilen an der Grenzfläche des Histopaque 1119 und 1077 HISTOPAQUE Schichten. </li&gt; <li> Waschen Sie die gesammelten Neutrophilen zweimal mit RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin und Zentrifuge bei 1.400 rpm für 7 min bei 4 ° C ergänzt </li><li> Zählen Sie die Neutrophilen und bestimmen ihre Lebensfähigkeit. </li></ol> HINWEIS: Neutrophile sind typischerweise&gt; 95% lebensfähig und&gt; 90% rein, wie durch FACS-Analyse bestimmt. Die typische Ausbeute von Neutrophilen aus dem Knochenmark (dh 2 Femur und Tibia 2 Knochen) von einem nicht infizierten 8-12 Wochen alte C57BL / 6 Maus ~ 6-12.000.000 Zellen. Diese Zahl ist wesentlich größer als Neutrophilen aus dem Knochenmark von infizierten Tieren geerntet. Daher wurden ~ 30-40000000 Neutrophilen / Maus erholt, als Candida-infizierten Mäusen für Zellernte 6 verwendet wurden. 3. Markierung von Neutrophilen Mit CellTracker Dyes <ol><li> Resuspendieren der Neutrophilen bei 5 x 10 6 Zellen / ml in PBS vorgewärmt auf 37 ° C. </li><li> Fügen Sie einen CellTracker Farbstoff bei einer abschließenden concentration von 5 um. </li></ol> HINWEIS: CellTracker Green (CMFDA (5-Chlormethylfluorescein Diacetate) und CellTracker Orange (CMTMR (5 - (und-6)-4-Amino Chloromethyl Benzoyl Tetramethylrhodamine) wurde in diesem Protokoll verwendet werden, um unterschiedlich beschriften Neutrophilen von Wildtyp-und Gen-defizienten Mäusen. HINWEIS: Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM CellTracker Grüne und CellTracker Orange Aliquot, und bei -80 ° C bis zu dem Tag des Experiments. <ol start="3"><li> Inkubieren Neutrophilen mit 5 uM des entsprechenden CellTracker Farbstoff für 10 min bei 37 ° C in einem Schüttelwasserbad bei Dunkelheit. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem RPMI 1640 1X mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin. </li></ol> HINWEIS: Efficient Waschen der Zellen nach der Markierung mit dem Schritt CellTracker Farbstoff ist wichtig, Farbstoff Kreuzkontamination vor dem Mischen unterschiedlich markierten Neutrophilen für Tiefen vermeidentream wettbewerbsfähig Wiederbesiedlung Studien. 4. Adoptiven Transfer von Neutrophilen in Mice and Analysis der übertragenen Neutrophile mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Resuspendieren Neutrophilen in eiskaltem PBS in einer Konzentration von 25 x 10 6 Zellen / ml und injizieren 200 ul der Suspension in die laterale Schwanzvene so, dass 5 x 10 6 Neutrophile pro Maus übertragen werden. Aus Wettbewerbsgründen Wiederbesiedlung Neutrophilen Studien, mischen Wildtyp-und Gen-defizienten Neutrophilen im Verhältnis 1:1 und injizieren insgesamt 5 x 10 6 Neutrophile pro Maus wie oben. </li></ol> HINWEIS: Mindestens bis zu 10 x 10 6 Neutrophilen kann adoptiv pro Maus ohne offensichtliche Toxizität sofort zu den Tieren übertragen. <ol start="2"><li> Zu verschiedenen Zeiten nach adoptiven Transfer (z. B. 1, 2, 3 oder 4 Stunden nach der Übertragung), einschläfern Mäusen und Ernte Blut und / oder Knochenmark und / oder anderen Zielorgan (e) von Interesse. </li><li> Bereiten single Zellsuspensionen aus diesen Geweben für die quantitative und qualitative Analyse der adoptiv übertragen markierten Neutrophilen mit veröffentlichten Protokollen 6,15. </li><li> Nach Live / Dead-Färbung und Lebensfähigkeit Fc Blockade, Label-Zellen mit CD45 (Klon 30-F11), Ly6G (Klon 1A8) und CD11b (Klon M1/70) und Tor auf Live-CD45 + CD11b + + Ly6G Neutrophilen. Neutrophile in diesem Tor umfassen nativen neutrophilen Granulozyten des Empfängers Maus sowie die adoptiv übertragen markierten Neutrophilen, die FITC + (wenn mit CellTracker Grün markiert) oder PE + (wenn mit den Cell Tracker orange markiert) sind. </li></ol> HINWEIS: Neutrophile können in Blut, Knochenmark und Nieren von Candida-infizierten Mäusen für mindestens 4 Stunden nach der Übertragung verfolgt werden. Hinweis: Befestigung mit 2% Paraformaldehyd in PBS nicht nachteilig auf die mittlere Fluoreszenzintensität der Neutrophilen mit CellTracker Gr markierteneen oder CellTracker orange für mindestens 48 Stunden.

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessen haben.

Hier präsentieren wir eine zuverlässige, einfach, schnell und wirtschaftlich-Protokoll für die Isolierung einer großen Zahl von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit mit einer Dichtegradientenzentrifugation Ansatz. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, kann ~ 6-12 × 10 6 Neutrophile von einer nicht infizierten Maus gewonnen werden und bis zu ~ 30-40 × 10 6 Neutrophilen kann aus einer Maus nach der Infektion 6 isoliert werden. Die is...

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten in den Menschen. Sie sind die wichtigsten zellulären Bestandteil des angeborenen Immunsystems und als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Patienten mit Neutropenie und erworbenen primären Immundefekten, die Neutrophilen Zahlen und / oder Funktion beeinflussen entwickeln lebensbedrohlicher invasiver Bakterien-und Pilzinfektionen, die Bedeutung dieser Zellen in Wirtsabwehr 1. Immune Anerkennung eindringende Pathogene am Ort der Infektion durch ihren verwandten Muster-recognition receptors Ergebnisse in der Induktion einer orchestrierten angeborenen Immunantwort, die Sekretion von Lockstoffe, die eine chemotaktische Gradienten in der Lage Recruiting Neutrophilen aus der Blutbahn in das entzündete Gewebe 2 Leads zu generieren . Nach Neutrophilen Ort der Infektion geben, sie aktiviert werden, führt das zu Zytokin-und Chemokin-Produktion, pathogen-Aufnahme, und die Tötung durch oxidative und nicht-oxidative michchanismen 3. Neben ihrer allgemein anerkannten Rolle in der angeborenen Immunität, haben Neutrophilen auch vor kurzem gezeigt, dass eine wichtige Rolle als Initiatoren der effektiven adaptive Immunantworten 4 spielen. Auf der anderen Seite, abgesehen von ihrer protektiven Immunität in Rollen kann auch Neutrophile vermitteln Gewebeverletzung und Immunpathologie durch übermäßige Akkumulation und / oder Aktivierung an entzündeten Stellen, wie sie in einer Vielzahl von Infektions-und Autoimmunerkrankungen 5-7 gezeigt. Trotz der unverzichtbaren Rolle der Neutrophilen bei der Montage wirksam angeborenen Immunantwort und ihre pleiotropen Effektor-Funktionen in mehreren Infektionskrankheiten und Entzündungen, technische Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle hat die Forschung mit neutrophilen Granulozyten in den letzten Jahrzehnten behindert. Daher sollte die Verwendung von reproduzierbaren Tests zur Isolierung von Neutrophilen weitere Forschung auf Neutrophilen-vermittelte Immunologie erleichterngischen Funktionen ex vivo und in vivo. Bisher wurden verschiedene Verfahren zur Isolierung von Neutrophilen wie Dichtegradientenzentrifugation von menschlichem Blut und Maus Blut oder Knochenmark 8,9, positive oder negative immunomagnetische Anreicherung von Neutrophilen Maus Blut oder Knochenmark 10,11 beschrieben wurde, und das Ernten von Neutrophilen aus der Peritonealhöhle von Mäusen nach intraperitonealer Injektion von Thioglycolat oder andere entzündungshemmende Mittel 12. Obwohl Neutrophilen kann leicht in großen Stückzahlen aus menschlichem Blut isoliert werden, ist diese Methode nicht optimal in den Mäusen infolge des geringen Volumens Mäuseblut die Isolierung von Neutrophilen ausreichend für funktionelle Studien oder adoptiven Transfer Experimente 13 ausschließt. Darüber hinaus, obwohl die Ausbeute an Thioglycolat-induzierte Zellen aus der Bauchhöhle größer ist verglichen mit der Maus Blut variiert die Reinheit von Neutrophilen in den entzündlichen Peritoneallavage zwischen60-90%, und die isolierten Neutrophilen zeigen einen aktivierten Phänotyp. Somit erfasst die Zellen unter Verwendung dieses Verfahren nur zur Durchführung funktionelle Untersuchungen aktivierten verwendet werden, nicht aber von nicht stimulierten Neutrophilen, die Maus Bauchhöhle wenigen Neutrophilen im stationären Zustand 12. Stattdessen wird das Knochenmark ein bequemer Reservoir für die Ernte eine große Zahl von entweder stimulierten oder aktivierten Neutrophilen 11,14, die dann stromabwärts funktionellen Studien wie Phagozytose Tötung und Degranulation oder für die adoptive Transfer in Empfänger-Mäuse verwendet werden. Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (~ 2 Stunden)-Protokoll, das eine hohe Ausbeute liefert (~ 6-12 × 10 6 Neutrophile / infizierten Maus oder bis zu 30-40 × 10 6 Neutrophile / infizierten Maus) reines (80 -95%) Neutrophilen mit&gt; 95% Rentabilität aus dem Knochenmark. Diese Methode verwendet handelsübliche Histopaque, die Dichtegradienten Zelle getrennt sindRation Medien aus Ficoll und Natriumdiatrizoat, an Neutrophile aus dem Knochenmark von Mäusen zu trennen. Dieses Verfahren ergibt wesentlich größere Anzahl von Neutrophilen pro Maus im Vergleich zu Blut oder Bauchhöhle, kann es verwendet werden, um Neutrophile von Mäusen sowohl im stationären Zustand oder nach der Infektion gesammelt werden, und es ist einfacher zu Schicht im Vergleich zu der Dichtegradientenzentrifugation Verfahren die diskontinuierliche verwendet Percoll Gradienten, bestehend aus 55% / 65% / 75% Percoll in PBS 9. Darüber hinaus werden die Zeit und die Ressourcen, die zur reinen Neutrophilen sammeln signifikant im Vergleich zu Neutrophilen Trennung mittels Fluorescence-Activated Cell Sorting verringert. Da auch dieses Verfahren nicht auf einer immunomagnetischen Anreicherungsschritt ist es kostengünstiger und vermeidet die Exposition von Zellen gegenüber der magnetischen Spalte und Antikörper, dh verringert die Wahrscheinlichkeit der Aktivierung von Neutrophilen. Zusätzlich zur Durchführung funktionelle Studien an isolierten neutrophils ex vivo und adoptiven Transfer von Zellen in Empfängermäuse, dieses Protokoll beschreibt auch ein Verfahren zur Kennzeichnung von isolierten Neutrophilen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe. Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Mäusen verschiedener genetischer Hintergründe können im Leistungssport Wiederbesiedlung Studien für die Verfolgung der übertragenen Neutrophilen im Gewebe des Empfängers Mäusen mittels Durchflusszytometrie, die mechanistischen Einblick in die direkte Rolle bestimmter Gene kann in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut angepasst werden Ziel in entzündeten Organen 6.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1X mit L-Glutamin und 25 mM HEPES</td><td>Cellgro</td><td>10-041-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (hitzeinaktiviert)</td><td>GemCell</td><td>100500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten Penicillin / 10.000 mg/ml Streptokokken)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA-Qualität</td><td>Biological Inc</td><td>351-027-101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,2 % und 1,6 % Natriumchlorid</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Natriumchloridlösungen, die mit destilliertem Wasser hergestellt und steril filtriert</td></tr><tr><td>werden Steril filtriertes Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Histopaque 1077 muss auf 18-26 &deg gebracht werden; C vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>Sterilfiltriertes Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Histopaque 1119 muss auf 18-26 &Grad; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylalkohol (200 Promille)</td><td>The Warner Graham Company</td><td>64-17-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chlormethylfluoresceindiacetat)</td><td>Invitrogen</td><td>C-7025</td><td>Herstellung von Stammlösungen von 10 mM in DMSO, aliquot und Lagerung bei -80 & deg; C</td></tr><tr><td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(und 6)-4-Chlormethylbenzoylaminotetramethylrhodamin)</td><td>Invitrogen</td><td>C-2927</td><td>Stammlösungen von 10 mM in DMSO herstellen, aliquotieren und bei -80 & deg lagern; C</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 (Klon 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>170451-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly6G (Klon 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>551461</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly6G (Klon 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>560599</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11b (Klon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>47-0112-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td>Verwendung bei 1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixierbar Blue Dead Cell Stain Kit</td><td>Molekulare Sonden</td><td>L-23105</td><td>Verwendung bei 1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td>&<td>nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Lösung, 4% in PBS</td><td>USB Corporation</td><td>19943</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabelle 1. Reagenzien für die Isolierung, Markierung und Verfolgung von adoptiv übertragenen Neutrophilen.</stark></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Materials</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>Taconic</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430053</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>25 ml serologische Pipetten</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10 ml serologische Pipetten</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>5 ml serologische Pipetten</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten (3 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12 ml Spritzen</td><td>Kendall monoject</td><td>512878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>25 G x 5/8 Zoll Nadeln (Präzisions-Gleitnadeln)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>100 mm Zellsiebe</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bakterizide Petrischalen</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Combitips Plus Biopur</td><td>Eppendorf</td><td>2249608-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Instrumente zum Präparieren von Mäusen (Schere, Pinzette, Skalpell)</td><td>Instrumente für die biomedizinische Forschung</td><td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td><td>Instrumente, die vor dem Gebrauch sterilisiert werden</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Gewebekulturhaube</td><td>The Baker Company</td><td>SG403</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75004521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>37°; C Schüttelwasserbad</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>3166721</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabelle 2. Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Ausrüstungen.</td></tr></tbody></table>

isolierung, reinigung und kennzeichnung von knochenmark der maus neutrophile für funktionelle studien und experimente adoptiven transfer

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophile sind kritische Effektorzellen des angeborenen Immunsystems. Sie werden sich schnell an den Standorten der akuten Entzündung rekrutiert und üben Schutz-oder pathogenen Wirkungen in Abhängigkeit von der entzündlichen Milieu. Dennoch ist trotz der unverzichtbaren Rolle von Neutrophilen in Immunität, detailliertes Verständnis der molekularen Faktoren, die Neutrophilen &#39;Effektor-und immunpathogenen Effekte in verschiedenen Infektionskrankheiten und entzündlichen Erkrankungen vermitteln noch fehlt, teils wegen ihrer kurzen Halbwertszeit, die Schwierigkeiten mit der Handhabung dieser Zellen und der Mangel an zuverlässigen experimentelle Protokolle für den Erhalt ausreichender Zahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien und adoptiven Transfer Experimente. Daher sind einfache, schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methoden sehr wünschenswert für die Ernte eine ausreichende Zahl von Neutrophilen Maus für die Beurteilung Funktionen wie Phagozytose, Tötung, Zytokin-Produktion, Degranulation und Menschenhandel. Zu diesem ZweckWir stellen eine reproduzierbare Dichtegradientenzentrifugation-basiertes Protokoll, das in jedem Labor eine große Anzahl von Neutrophilen im Knochenmark von Mäusen mit hoher Reinheit und Lebensfähigkeit isolieren angepasst werden kann. Darüber hinaus präsentieren wir ein einfaches Protokoll, das CellTracker Farbstoffe verwendet, um die isolierte Neutrophile, die dann in adoptiv Empfängermäuse übertragen werden können und verfolgt in mehreren Geweben für mindestens 4 Stunden nach der Übertragung mittels Durchflusszytometrie zu beschriften. Mit diesem Ansatz können Differential Kennzeichnung von Neutrophilen von Wildtyp-und Gen-defizienten Mäusen mit verschiedenen CellTracker Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden, um wettbewerbsfähig Wiederbesiedlung Studien zur Bewertung der direkte Rolle von spezifischen Genen in Menschenhandel von Neutrophilen aus dem Blut in Zielgewebe in vivo durchführen .

Dieses Protokoll ist für die Ernte von Knochenmarkszellen von Mäusen und die anschließende Trennung von Neutrophilen aus diesen Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation mit handelsüblichen Histopaque Zellseparation Medien optimiert. Neutrophile isoliert mit dieser Methode kann für eine Vielzahl von nachgelagerten funktionelle Studien ex vivo und für adoptiven Transfer Experimente in Mäusen Empfänger verwendet werden. Die typische Ausbeute der Sammlung von Knochenmarkzellen aus be...

Wir beschreiben ein Protokoll für die Isolierung und Reinigung von Neutrophilen aus Maus-Knochenmark durch Dichtegradientenzentrifugation und Neutrophilen-Kennzeichnung mit CellTracker Farbstoffe. Dies stellt eine einfache, schnelle, reproduzierbare und kostengünstige Methode zur Gewinnung einer großen Anzahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien oder Adoptiv-Transfer-und Tracking-Experimenten.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Neutrophile aus der Knochenmark von Mäusen zu isolieren und zu markieren, um sie anschließend in funktionellen Untersuchungen und adoptiven Transferexperimenten einzusetzen. Zunächst werden dazu die Knochenmarkzellen aus den Femora und Tibiae von Mäusen gewonnen. Im zweiten Schritt werden die roten Blutkörperchen osmotisch lysiert, indem sie nacheinander in 0,2 %iger und 1,6 %iger Natriumchloridlösung suspendiert werden.Anschließend werden die Neutrophilen durch Zentrifugation über eine Dichtegradienten isoliert. Im letzten Schritt werden die Neutrophilen mit Zelltracern markiert. Letztendlich kann die Anzahl der adoptiv übertragenen, in verschiedene Mausgewebe rekrutierten Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden.Der Hauptvorteil der Isolierung von Maus-Neutrophilen aus dem Knochenmark gegenüber Blut oder Peritoneum besteht darin, dass sowohl im Ruhezustand als auch nach einer Infektion eine große Zellanzahl gewonnen werden kann, die für nachgeschaltete funktionelle Untersuchungen und Adoptivtransfer-Experimente ausreichend ist. Der Vorteil der Verwendung einer Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von Maus-Neutrophilen gegenüber der immunmagnetischen Selektion oder der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung liegt darin, dass sie schnell und kostengünstig ist und es vermeidet, die Neutrophilen mit Antikörpern zu markieren, was eine Neutrophilenaktivierung auslösen könnte. Die Demonstration des Verfahrens wird muca swami us, eine Technikerin aus meinem Labor, durchführen, nachdem sie eine euthanasierte Maus mit 70%igem Ethanol besprüht hat.Erstellen Sie einen Schnitt im mittleren Bauchbereich der Haut des Tieres und entfernen Sie anschließend das Hautgewebe vom distalen Teil des Tieres einschließlich der unteren Extremitäten. Danach schneiden Sie mit einer Schere die Muskulatur der Hintergliedmaßen des Tieres durch und lösen dann vorsichtig das Hüftbein aus dem Hüftgelenk, wobei darauf zu achten ist, den Femurkopf nicht zu beschädigen. Entfernen Sie anschließend mit der Schere in Skalpelltechnik die restliche Muskulatur vom Femur und Schienbein.Trennen Sie die Beinknochen am Kniegelenk, wobei darauf geachtet werden sollte, die Knochenenden nicht zu beschädigen, und legen Sie die Knochen dann in eine Petrischale mit eiskaltem RPMI 1640. Mit FBS und Antibiotika supplementieren. Bringen Sie die Schale in eine Gewebekulturhaube und desinfizieren Sie anschließend die Außenseite jedes Knochens mit 70 % Ethanol in einer neuen Petrischale.Nach etwa 10 bis 15 Sekunden spülen Sie das Ethanol von der Oberfläche jedes Knochens mit drei aufeinanderfolgenden Waschungen in eiskalter, steriler PBS ab. Schneiden Sie danach die Epiphyse von jedem Knochen ab und legen Sie sie in eine neue sterile Petrischale. Befestigen Sie anschließend eine 25-Gauge-Nadel an einer 12-cc-Spritze, die mit 10 Milliliter RPMI gefüllt ist.Mit FBS und EDTA versetzen. Anschließend die Knochenmarkzellen von beiden Enden des Schafts jedes Femur-Tibia-Paares in ein 50-Milliliter-Schraubverschluss-Falcon-Röhrchen spülen, das mit einem 100-Mikrometer-Filter vorgeschwächt ist, um alle Zellen zu entfernen. Die inneren Oberflächen der Knochen mit der Nadelspitze abschaben.Wenn die Knochen blass erscheinen, wurden die Zellen ausreichend entfernt. Schneiden Sie nun mit einem Skalpell die Knochenepiphysen in kleine Stücke von 0,5 bis einem Millimeter Q und zerstoßen Sie diese anschließend mit dem stumpfen Ende einer 2,5-Milliliter-Einor-Kamm-Spitze plus BioPure-Pipettenspitze durch den 100-Mikrometer-Filter. Nachdem die gewonnenen Zellen sieben Minuten bei 427 × g und 4 °C zentrifugiert wurden, lysieren Sie die roten Blutkörperchen in 20 Milliliter 0,2 %iger Natriumchloridlösung für etwa 20 Sekunden.Anschließend die Lyse mit 20 Milliliter 1,6 %iger Natriumchloridlösung stoppen, die Zellen abzentrifugieren und dann das Pellet in RPMI 1640, ergänzt mit FBS und EDTA, resuspendieren. Die Zellen zählen und nach erneutem Abzentrifugieren das gewaschene Pellet mit maximal 100 × 10⁶ Zellen pro Milliliter eiskalter, steriler PBS resuspendieren. Nun drei Milliliter einer 18 bis 26 °C warmen, trüben Lösung von Histopaque®-1077 in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen geben und langsam drei Milliliter der 18 bis 26 °C warmen Histopaque®-1077-Lösung darauf aufschichten.Sein opakes 1 0 7 7. Um eine Vermischung der beiden Dichten unmittelbar nach der Herstellung des opaken Mediums zu vermeiden, vorsichtig die Knochenmarkzell-Suspension auf das his-opaque-1-0-7-7-Medium aufschichten, zentrifugieren die Dichtegradienten 30 Minuten bei 834 × g und 25 °C ohne Bremse und sammeln dann die Neutrophilen an der Grenzfläche zwischen den his-opaque-1-1-1-9- und 1-0-7-7-Schichten. Nachdem die gesammelten Neutrophilen zweimal in RPMI 1640 mit FBS und Antibiotika gewaschen wurden, die Zellen in PBS erneut suspendieren und auf eine Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter einstellen. Das PBS vorher auf 37 °C vorwärmen.Nach der Zellzählung wird eine kleine Aliquotprobe jeder experimentellen Probe zurückbehalten, um Reinheit und Vitalität mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen; anschließend werden die verbleibenden Neutrophilen mit einem Zelltracierungsfarbstoff bei einer Endkonzentration von fünf µM für 10 Minuten bei 37 °C unter Schütteln im Dunkeln markiert. Abschließend werden die Zellen zweimal mit eiskaltem RPMI 1640, ergänzt mit FBS und Antibiotika, gewaschen, um eine Farbstoffübertragung zu vermeiden, bevor die unterschiedlich markierten Neutrophilenpopulationen für nachfolgende kompetitive Rebesiedelungsstudien gemischt werden. In diesem Panel sind repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von aus dem Knochenmark isolierten, mittels Dichtegradiententrennung gewonnenen Neutrophilen einer nicht infizierten C57BL/6-Maus dargestellt. Die anfängliche Gating-Strategie erfolgte anhand der aus der Grenzfläche von Histopaque 1119 und Histopaque 1077 gewonnenen Knochenmarkzellen.Mithilfe von Forward- und Side-Scatter wird gezeigt, dass die durch Dichtegradienten getrennten neutrophilen Granulozyten über 90 % rein und über 95 % vital für mindestens vier Stunden nach der adoptiven Übertragung mit einer Zellmarkierung sind. Mit DIA markierte neutrophile Zellen können mittels Durchflusszytometrie in verschiedenen Mausgeweben verfolgt werden. Beispielsweise im Blut, Knochenmark und Nieren der empfangenden, mit Candida infizierten C57BL/6-Maus, wie in diesem Experiment durch Gating auf lebende CD45+, Ly6G+, CD11b+ Zellen gezeigt wird, können sich diese repräsentativen adoptiv übertragenen, mit CMTMR markierten neutrophilen Zellen von den endogenen, CMTMR- und PE-negativen neutrophilen Zellen der Empfängertiere durch ihre PE-Expression unterscheiden.Nach Beherrschung der Technik kann die Isolierung und Markierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark der Maus innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Knochenmarktransplantation bietet eine Möglichkeit, um den Genotyp der Knochenmark stammende Zellen zu ändern. Wenn das Gen von Interesse an beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen exprimiert wird, kann die Knochenmarktransplantation Knochenmark stammende Zellen zu einem anderen Genotyp ändern, ohne die nicht-Knochenmark stammende Zellen Genotyp.

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Diese Handschrift stellt ein technisches Verfahren , das verwendet werden kann , C1498 - Zellkulturen in vitro und der akuten Leukämie induziert in Mäusen nach der Injektion zu charakterisieren. Die phänotypische und funktionelle Analysen werden mit Hilfe der Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzmikroskopie, Zytochemie und May-Grünwald Giemsa Färbung durchgeführt.

Ein detailliertes Protokoll der murinen C1498-Zelllinie und der damit verbundenen Leukämie Maus-Modell für Charakterisieren

Neue Protokolle werden hier beschrieben, zu isolieren und zu charakterisieren Mikropartikel abgeleitet von Mensch und Maus Neutrophile. Diese Protokolle nutzen Ultrazentrifugation, Durchflusszytometrie und Immunoblotting Techniken Mikropartikel Inhalte zu analysieren, und sie können zur Untersuchung der Rolle von Mikropartikeln aus verschiedenen Zelltypen in zelluläre Funktion abgeleitet.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen abgeleitet Mikropartikel für funktionelle Studien

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur in Vivo Bestimmung der naiven CD4-T Zellaktivierung (T Cell), Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch GM-CSF Knochenmark (BM)-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus beschreibt dieses Protokolls BM und T-Zellen isoliert, DC-Generation und DC und T-Zell-Adoptiv-Transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Diese Forschung skizziert zwei Techniken zur Isolierung reichlich neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) aus dem Knochenmark von Ratten. Eine Methode kombiniert ein kommerzielles Neutrophilen-Isolationskit mit einer Dichtegradientenzentrifugation, während die andere nur eine Dichtegradientenzentrifugation verwendet. Beide Ansätze liefern funktionelle NETs, die die von peripheren Blutneutrophilen übertreffen.

Einzigartiger Ansatz zur Isolierung von Neutrophilen im Knochenmark von Ratten mit vergleichbarer Kapazität

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Dieses Manuskript skizziert ein Protokoll zur Erstellung einer ATAC-seq-Bibliothek von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen, mit dem Ziel, eine optimale Lebensfähigkeit der Neutrophilen und eine hohe Bibliotheksqualität zu gewährleisten. Es bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur BMC-Vorbereitung, zur immunomagnetischen Sortierung und zum Aufbau von Bibliotheken und dient insbesondere für Neueinsteiger in die Erforschung von Neutrophilen als wertvolle Anleitung.

ATAC-Seq-Bibliothek Präparation von aus dem Knochenmark gewonnenen Neutrophilen der Maus

Lernen Sie die Isolierung und Kennzeichnung von Neutrophilen aus dem Knochenmark der Maus mittels Dichtegradientenzentrifugation und CellTracker-Farbstoffen. Diese Methode ermöglicht funktionelle Studien und adoptive Transferexperimente.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer (Video) | JoVE Journal

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

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