Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Neutrophile aus der Knochenmark von Mäusen zu isolieren und zu markieren, um sie anschließend in funktionellen Untersuchungen und adoptiven Transferexperimenten einzusetzen. Zunächst werden dazu die Knochenmarkzellen aus den Femora und Tibiae von Mäusen gewonnen. Im zweiten Schritt werden die roten Blutkörperchen osmotisch lysiert, indem sie nacheinander in 0,2 %iger und 1,6 %iger Natriumchloridlösung suspendiert werden.

Anschließend werden die Neutrophilen durch Zentrifugation über eine Dichtegradienten isoliert. Im letzten Schritt werden die Neutrophilen mit Zelltracern markiert. Letztendlich kann die Anzahl der adoptiv übertragenen, in verschiedene Mausgewebe rekrutierten Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden.

Der Hauptvorteil der Isolierung von Maus-Neutrophilen aus dem Knochenmark gegenüber Blut oder Peritoneum besteht darin, dass sowohl im Ruhezustand als auch nach einer Infektion eine große Zellanzahl gewonnen werden kann, die für nachgeschaltete funktionelle Untersuchungen und Adoptivtransfer-Experimente ausreichend ist. Der Vorteil der Verwendung einer Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von Maus-Neutrophilen gegenüber der immunmagnetischen Selektion oder der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung liegt darin, dass sie schnell und kostengünstig ist und es vermeidet, die Neutrophilen mit Antikörpern zu markieren, was eine Neutrophilenaktivierung auslösen könnte. Die Demonstration des Verfahrens wird muca swami us, eine Technikerin aus meinem Labor, durchführen, nachdem sie eine euthanasierte Maus mit 70%igem Ethanol besprüht hat.

Erstellen Sie einen Schnitt im mittleren Bauchbereich der Haut des Tieres und entfernen Sie anschließend das Hautgewebe vom distalen Teil des Tieres einschließlich der unteren Extremitäten. Danach schneiden Sie mit einer Schere die Muskulatur der Hintergliedmaßen des Tieres durch und lösen dann vorsichtig das Hüftbein aus dem Hüftgelenk, wobei darauf zu achten ist, den Femurkopf nicht zu beschädigen. Entfernen Sie anschließend mit der Schere in Skalpelltechnik die restliche Muskulatur vom Femur und Schienbein.

Trennen Sie die Beinknochen am Kniegelenk, wobei darauf geachtet werden sollte, die Knochenenden nicht zu beschädigen, und legen Sie die Knochen dann in eine Petrischale mit eiskaltem RPMI 1640. Mit FBS und Antibiotika supplementieren. Bringen Sie die Schale in eine Gewebekulturhaube und desinfizieren Sie anschließend die Außenseite jedes Knochens mit 70 % Ethanol in einer neuen Petrischale.

Nach etwa 10 bis 15 Sekunden spülen Sie das Ethanol von der Oberfläche jedes Knochens mit drei aufeinanderfolgenden Waschungen in eiskalter, steriler PBS ab. Schneiden Sie danach die Epiphyse von jedem Knochen ab und legen Sie sie in eine neue sterile Petrischale. Befestigen Sie anschließend eine 25-Gauge-Nadel an einer 12-cc-Spritze, die mit 10 Milliliter RPMI gefüllt ist.

Mit FBS und EDTA versetzen. Anschließend die Knochenmarkzellen von beiden Enden des Schafts jedes Femur-Tibia-Paares in ein 50-Milliliter-Schraubverschluss-Falcon-Röhrchen spülen, das mit einem 100-Mikrometer-Filter vorgeschwächt ist, um alle Zellen zu entfernen. Die inneren Oberflächen der Knochen mit der Nadelspitze abschaben.

Wenn die Knochen blass erscheinen, wurden die Zellen ausreichend entfernt. Schneiden Sie nun mit einem Skalpell die Knochenepiphysen in kleine Stücke von 0,5 bis einem Millimeter Q und zerstoßen Sie diese anschließend mit dem stumpfen Ende einer 2,5-Milliliter-Einor-Kamm-Spitze plus BioPure-Pipettenspitze durch den 100-Mikrometer-Filter. Nachdem die gewonnenen Zellen sieben Minuten bei 427 × g und 4 °C zentrifugiert wurden, lysieren Sie die roten Blutkörperchen in 20 Milliliter 0,2 %iger Natriumchloridlösung für etwa 20 Sekunden.

Anschließend die Lyse mit 20 Milliliter 1,6 %iger Natriumchloridlösung stoppen, die Zellen abzentrifugieren und dann das Pellet in RPMI 1640, ergänzt mit FBS und EDTA, resuspendieren. Die Zellen zählen und nach erneutem Abzentrifugieren das gewaschene Pellet mit maximal 100 × 10⁶ Zellen pro Milliliter eiskalter, steriler PBS resuspendieren. Nun drei Milliliter einer 18 bis 26 °C warmen, trüben Lösung von Histopaque®-1077 in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen geben und langsam drei Milliliter der 18 bis 26 °C warmen Histopaque®-1077-Lösung darauf aufschichten.

Sein opakes 1 0 7 7. Um eine Vermischung der beiden Dichten unmittelbar nach der Herstellung des opaken Mediums zu vermeiden, vorsichtig die Knochenmarkzell-Suspension auf das his-opaque-1-0-7-7-Medium aufschichten, zentrifugieren die Dichtegradienten 30 Minuten bei 834 × g und 25 °C ohne Bremse und sammeln dann die Neutrophilen an der Grenzfläche zwischen den his-opaque-1-1-1-9- und 1-0-7-7-Schichten. Nachdem die gesammelten Neutrophilen zweimal in RPMI 1640 mit FBS und Antibiotika gewaschen wurden, die Zellen in PBS erneut suspendieren und auf eine Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter einstellen. Das PBS vorher auf 37 °C vorwärmen.

Nach der Zellzählung wird eine kleine Aliquotprobe jeder experimentellen Probe zurückbehalten, um Reinheit und Vitalität mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen; anschließend werden die verbleibenden Neutrophilen mit einem Zelltracierungsfarbstoff bei einer Endkonzentration von fünf µM für 10 Minuten bei 37 °C unter Schütteln im Dunkeln markiert. Abschließend werden die Zellen zweimal mit eiskaltem RPMI 1640, ergänzt mit FBS und Antibiotika, gewaschen, um eine Farbstoffübertragung zu vermeiden, bevor die unterschiedlich markierten Neutrophilenpopulationen für nachfolgende kompetitive Rebesiedelungsstudien gemischt werden. In diesem Panel sind repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von aus dem Knochenmark isolierten, mittels Dichtegradiententrennung gewonnenen Neutrophilen einer nicht infizierten C57BL/6-Maus dargestellt. Die anfängliche Gating-Strategie erfolgte anhand der aus der Grenzfläche von Histopaque 1119 und Histopaque 1077 gewonnenen Knochenmarkzellen.

Mithilfe von Forward- und Side-Scatter wird gezeigt, dass die durch Dichtegradienten getrennten neutrophilen Granulozyten über 90 % rein und über 95 % vital für mindestens vier Stunden nach der adoptiven Übertragung mit einer Zellmarkierung sind. Mit DIA markierte neutrophile Zellen können mittels Durchflusszytometrie in verschiedenen Mausgeweben verfolgt werden. Beispielsweise im Blut, Knochenmark und Nieren der empfangenden, mit Candida infizierten C57BL/6-Maus, wie in diesem Experiment durch Gating auf lebende CD45+, Ly6G+, CD11b+ Zellen gezeigt wird, können sich diese repräsentativen adoptiv übertragenen, mit CMTMR markierten neutrophilen Zellen von den endogenen, CMTMR- und PE-negativen neutrophilen Zellen der Empfängertiere durch ihre PE-Expression unterscheiden.

Nach Beherrschung der Technik kann die Isolierung und Markierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark der Maus innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden.