Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Isolierung und Markierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark der Maus für nachgelagerte funktionelle Studien und adoptive Transferexperimente. Dies wird erreicht, indem zunächst die Knochenmarkzellen von Mausen, Femuren und Tibia entnommen werden. Im zweiten Schritt werden die roten Blutkörperchen osmotisch geschnürt, indem sie nacheinander in 0,2%igen bzw. 1,6%igen Natriumchloridlösungen suspendiert werden.

Anschließend werden die Neutrophilen durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Im letzten Schritt werden die Neutrophilen mit Zell-Tracker-Farbstoffen markiert. Letztendlich kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um die Anzahl der adoptiv übertragenen Neutrophilen zu bestimmen, die in verschiedene Mausgewebe rekrutiert werden.

Der Hauptvorteil der Isolierung von Maus-Neutrophilen aus dem Knochenmark gegenüber dem Blut oder dem Peritoneum besteht darin, dass die große Anzahl von Zellen, die für nachgelagerte funktionelle Studien und adoptive Transferexperimente ausreicht, sowohl während des Steady State als auch nach der Infektion aus dem Knochenmark gewonnen werden kann. Der Vorteil der Verwendung einer Gradientenzentrifugationstechnik zur Isolierung von Maus-Neutrophilen gegenüber der immunomagnetischen Selektion der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung besteht darin, dass sie schnell und wirtschaftlich ist und die Markierung der Neutrophilen mit Antikörpern vermeidet, die eine Neutrophilenaktivierung induzieren können. Das Verfahren wird von muca swami us, einem Techniker aus meinem Labor, demonstriert, nachdem er eine euthanasierte Maus mit 70% Ethanol besprüht hat.

Machen Sie einen Schnitt in der mittleren Bauchregion der Haut des Tieres und entfernen Sie dann das Hautgewebe aus dem distalen Teil des Tieres, einschließlich der unteren Extremitäten. Schneiden Sie anschließend mit einer Schere die Muskeln von den Hintergliedmaßen des Tieres ab und verrenken Sie dann vorsichtig das ACE-Bum aus dem Hüftgelenk, um einen Bruch des Oberschenkelkopfes zu vermeiden. Verwenden Sie dann die Schere in einem Skalpell, um den restlichen Muskel aus dem Oberschenkelknochen und dem Schienbein zu entfernen.

Trennen Sie die Beinknochen am Kniegelenk, achten Sie darauf, dass die Knochenenden nicht brechen, und legen Sie die Knochen dann in eine Petrischale mit eiskaltem RPMI 1 6 4 oh. Ergänzen Sie mit FBS und Antibiotika. Übertragen Sie die Schale in eine Gewebekulturhaube und sterilisieren Sie dann die Außenseite jedes Knochens mit 70 % Ethanol in einer neuen Petrischale.

Spülen Sie nach etwa 10 bis 15 Sekunden das Ethanol von der Oberfläche jedes Knochens mit drei aufeinanderfolgenden Wäschen in eiskaltem, sterilem PBS. Schneiden Sie dann die Epiphyse von jedem der Knochen ab und geben Sie sie in eine neue sterile Petrischale. Befestigen Sie als Nächstes eine 25-Gauge-Nadel an einer 12-cm³-Spritze, die mit 10 Millilitern RPMI gefüllt ist.

Ergänzung mit FBS und EDTA. Spülen Sie dann die Knochenmarkzellen von beiden Enden des Schaftes jedes Femurschienbeinpaares auf ein 50-Milliliter-Falcon-Rohr mit Schraubverschluss, das mit einem 100-Mikrometer-Filter verblasst ist, um alle Zellen zu entfernen. Kratzen Sie mit der Nadelspitze die Innenflächen der Knochen ab.

Wenn die Knochen blanchiert erscheinen, sind die Zellen ausreichend entfernt. Schneiden Sie nun mit einem Skalpell die Knochenepiphysen in kleine 0,5 bis einen Millimeter große Q-Stücke und zerschlagen Sie sie dann mit dem hinteren Ende einer 2,5-Milliliter-Einor-Kammspitze plus BioPure-Pipettenspitze durch den 100-Mikrometer-Filter. Nach dem Schleudern der geernteten Zellen für sieben Minuten bei 427-facher G und vier Grad Celsius werden die roten Blutkörperchen in 20 Milliliter 0,2%-Natriumchlorid für etwa 20 Sekunden eingespeist.

Stoppen Sie dann die Lyse mit 20 Millilitern 1,6% Natriumchlorid, schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren Sie dann das Pellet in RPMI 1 6 4 oh Ergänzung mit FBS und EDTA. Zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie das gewaschene Pellet nach dem erneuten Schleudern mit nicht mehr als 100 mal 10 bis sechs Zellen pro einem Milliliter Eis. Kaltsteriles PBS Geben Sie nun drei Milliliter mit 18 bis 26 Grad Celsius, sein undurchsichtiges 1 1 1 9 in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und überlagern Sie dann langsam drei Milliliter mit 18 bis 26 Grad Celsius.

Seine undurchsichtigen 1 0 7 7. Vermeiden Sie das Mischen der beiden Dichten unmittelbar nach der Herstellung der undurchsichtigen sorgfältig Schicht der Knochenmarkzellsuspension auf die undurchsichtige 1 0 7 7 Zentrifuge, den Dichtegradienten für 30 Minuten bei 834 mal G und 25 Grad Celsius ohne die Unterbrechung, und sammeln Sie dann die Neutrophilen an der Grenzfläche der undurchsichtigen 1 1 1 9 und 1 0 7 7 Schichten. Nach dem zweimaligen Waschen der gesammelten Neutrophilen in RPMI 1 6 4 oh FBS und Antibiotika Resus suspendieren die Zellen bei fünfmal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter in PBS auf 37 Grad Celsius.

Nach dem Zählen der Zellen wird von jeder Versuchsprobe ein kleines Aliquot reserviert, um die Reinheit und Lebensfähigkeit durch Durchflusszytometrie zu bestimmen, und dann die verbleibenden Neutrophilen mit einem Zelltracker-Farbstoff in einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Schüttelwasserbad im Dunkeln markieren. Waschen Sie die Zellen schließlich zweimal mit eiskaltem RPMI 1 6 4 oh Supplement mit FBS und Antibiotika, um eine Kreuzkontamination von Farbstoffen zu vermeiden, bevor Sie die differentiell markierten Neutrophilenpopulationen für nachgeschaltete kompetitive Repopulationsstudien mischen. Hier sind repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von Neutrophilen mit isoliertem Dichtegradienten aus dem Knochenmark von einer nicht infizierten C 57 Black Six-Maus in diesem Panel dargestellt. Das initiale Gating, das für die Knochenmarkzellen verwendet wird, die aus der Grenzfläche von Histopath 1 1 1 9 und Histopath 1 0 7 7 entnommen wurden.

Unter Verwendung von Vorwärts- und Seitenstreuung wird gezeigt, dass die durch den Dichtegradienten getrennten Neutrophilen mindestens vier Stunden nach dem adoptiven Transferzelltracker mehr als 90 % rein und mehr als 95 % lebensfähig sind. DIA-markierte Neutrophile können bei verschiedenen Mausproblemen durch Durchflusszytometrie verfolgt werden. Zum Beispiel können im Blut, Knochenmark und in den Nieren der mit Candida infizierten C 57 black six Maus, die in diesem Experiment durch Gating auf den lebenden CD 45 LY sechs G CD 11 B-Zellen gezeigt wurde, diese repräsentativ adoptiv übertragenen C-M-T-M-R-markierten Neutrophilen von den nativen C-M-T-M-M-R und PE negativen Neutrophilen der Empfängermaus durch ihre PE-Expression unterschieden werden.

Einmal gemeistert, kann die Isolierung und Markierung der Neutrophilen des Knochenmarks der Maus in drei Stunden abgeschlossen werden.