Name: Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: Erfahren Sie, wie genetisch kodierte Molekularsonden mit p-Azido-L-Phenylalanin zur Untersuchung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht gezieltes Photocrosslinking und bioorthogonale Markierung für strukturbiologische Studien.

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1. Standortspezifische Genetische Einbau von unnatürlichen Aminosäuren in GPCRs <ol><li> Aufrechterhaltung HEK293T-Zellen in DMEM (4,5 g / l Glucose, 2 mM Glutamin), das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war, bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Atmosphäre. </li><li> Transfektion die Zellen 60-80% Konfluenz in einem 10-cm-Platte mit Lipofectamine Plus-Reagenz gewachsen. <ol><li> 750 ul DMEM, mit 10 ul Plus-Reagens, 3,5 ug GPCR-cDNA (pMT4. Rho oder pcDNA 3.1. CCR5), der das Amber-Stopcodon an einer gewünschten Position, 3,5 &amp;mgr; g des cDNA-Suppressor-tRNA (pSVB.Yam) und 0,35 ug der mutierten Aminoacyl-tRNA-Synthetase-cDNA für p-Azido-L-phenylalanin (pcDNA.RS). Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min. Auch eine ähnliche Transfektion mit der Gew. GPCR-cDNA (ein Amber-Stopp-Codon enthalten), um als Kontrolle dienen. Fügen Sie diese Mischung auf 750 ul DMEM mit 17 ul Lipofectamine. Nach Gleichgewichtseinstellung 15 min bei Raumtemperatur bringen dieGesamtvolumen von 4 ml. </li><li> Saugen Medien auf 10-cm-Platte gelten Transfektion Mischung, um Zellen und werden wieder zu 37 ° C in 5% CO 2-Atmosphäre. Nach 4-6 Stunden, ergänzen die Zellen mit 4 ml DMEM mit 20% FBS und 1 mM AZF. </li></ol></li><li> Am nächsten Tag ersetzt das Wachstumsmedium mit DMEM mit 10% FBS und 0,5 mM AZF. </li><li> Ernten Sie die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion die Expression zu analysieren, oder fahren Sie in den folgenden Abschnitten beschrieben Photo oder Markierungsverfahren. <ol><li> Expression des GPCR-Amber-Mutante bestätigt in Gegenwart von LF in den Wachstumsmedien. Wir tun dies durch Western-Immunoblot-Detektion. Lysieren das Zellpellet in 1% (w / v) Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 h bei 4 ° C Zentrifugieren Sie das Lysat bei 16.000 xg und zur Lösung der Überstand unter reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE. Übertragung auf eine PVDF-Membran und führen Immunoblotanalyse in voller Länge Rezeptor-Expression erkennen, mit the mAb 1D4 (National Cell Culture Center), die eine gentechnisch Epitop am C-Terminus des Rezeptors erkennt. 31 </li></ol></li></ol> 2. Zuordnen eines Ligandenbindungsstelle durch gezielte Photovernetzung <ol><li> 48 Stunden nach der Transfektion von Zellen, Medien absaugen und ersetzen mit 4 ml 1x Phosphate Buffered Saline (PBS). Rückkehr zu 37 º C für 15 min. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit 1x PBS und Transfer in ein Falcon-Röhrchen. Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 2 min auf die Zellen zu pelletieren, und saugen Sie den Überstand. </li><li> Zellpellet in 1 × Hanks gepufferte Salzlösung mit 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2% BSA und tritiierten Liganden bei Sättigungsbindungskonzentration für die erforderliche Zeitdauer und Temperatur, um Rezeptor-Liganden-Komplexbildung zu gewährleisten. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 24-Well-oder 96-Well-Platte für Photoaktivierung von AZF bei 365 nm (z. B. mit einem UV-A-Lampe) für 15 min bei 4 ° C Maintain die Platte auf Eis, um die Probenerwärmung und Zell-Lyse zu vermeiden. </li><li> Übertragen Sie die Zellen, um ein Eppendorf-Röhrchen, Zentrifugen, um die Zellen zu pelletieren, den Überstand und zur Analyse. Die Pellets können bei -20 ° C zur weiteren Verwendung gelagert werden. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in Lyse-Puffer, der 1% (w / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 und Protease-Inhibitoren. Nach 1-stündiger Inkubation bei 4 ° C zentrifugieren Sie das Zelllysat für 10 min bei 16.000 × g, und den Überstand in ein neues Röhrchen. </li><li> Hinzufügen mAb 1D4-Sepharose-2B-Harz zu dem Überstand und Inkubation über Nacht bei 4 ° C, um die GPCR immunopurify mit dem C-Terminus konstruiert mAb 1D4-Epitop. Am nächsten Tag Waschen der Kügelchen mehrmals mit Lyse-Puffer. Eluat-Proben mit 1% SDS bei 37 ° C für 1 Stunde unter Schütteln. </li><li> Übertragen eines Teils des Eluenten in ein 15 ml Fläschchen mit Szintillationsflüssigkeit und zählen auf einem Beta-Szintillationszähler, die Menge der spezifischen Bindung des tritiierten Liganden zu quantifizieren thE-Rezeptor. </li><li> Beheben Sie den restlichen mAb 1D4 Laufmittel gereinigt durch Standard-Gel-Elektrophorese. Wir verwenden ein 4-12% SDS-PAGE-Gel und dann halbtrockenen Transfer auf eine PVDF-Membran für Immunoblotting. Wir sind auch eine Spur mit Standard-Protein-Leiter, um visuelle Annäherung der Molekulargewicht zu führen. <ol><li> Sperrung der PVDF-Membran mit 5% Milch in TBS-Puffer, enthaltend 0,05% Tween-20. Sonde die Membran in voller Länge Rezeptor-Expression mit mAb 1D4 gefolgt von HRP-konjugierte Anti-Maus-IgG Sekundäranti bestätigen. </li><li> Behandeln mit verstärkter Chemilumineszenz (ECL)-Reagens und setzen Membran Autoradiographie Film Banden sichtbar. </li></ol></li><li> Schneiden der Membran mit einer Rasierklinge, um jede Probenspur zu trennen, gefolgt von Schneiden zu bestimmten Molekulargewichtsmarkern. Übertragen Membransegmente Fläschchen mit Szintillationsflüssigkeit. Quantifizierung der Menge an Tritium in jeder Membransegment durch Zählen auf einem Beta-Szintillationszähler. </li><li> Identifizieren Sie die positivephotovernetzen mit der Detektion von Tritium in der scheinbaren molekularen Masse gleich der Summe derjenigen der GPCR und dem Liganden. </li></ol> 3. Gezielte Epitop-Tagging und Zelloberflächen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) <ol><li> 24 Stunden nach der Transfektion, waschen Sie die Zellen mit 1 ml 1x PBS und trypsinize mit 1 ml 0,25% Trypsin für 3 min. Ergänzt mit 9 ml DMEM, enthaltend 10% FBS und 0,5 mM AZF. Die Zellen und zählen die Zelldichte. Wir verwenden eine Standard-Zählkammer. </li><li> Pre-Behandlung eine hohe Bindungs, klare Boden 96-Well-Platte mit 100 ml 0,01 mg / ml Poly-D-Lysin pro Vertiefung. Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur, immer wieder waschen mit 1x PBS und an der Luft trocknen. </li><li> Platte 200 ul der transfizierten Zellen in einer Dichte von 6 × 10 4 - 8 Stück 10 4 Zellen / Well auf 96-Well-Platte und zurück auf 37 ° C in 5% CO 2-Atmosphäre. </li><li> Am nächsten Tag vorbereiten Zellen für die Kennzeichnung. Behutsam dreimal mit 100 ul / 1x PBS to entfernen Sie AZF enthalten Wachstumsmedien. Sicherzustellen Zellen haften bleiben, zum Beispiel durch Verwendung von PBS, das Ca 2 + und Mg 2 +. </li><li> Bereiten 50-200 uM FLAG-Triarylphosphins Markierungsreagenzes in 1x HBSS / PBS aus einer Stamm 5-20 mM in PBS erhalten. Bewerben 60 ml in jede Vertiefung (in dreifacher Ausfertigung für jede Amber-Mutante) und zurück auf 37 ° C für 30 min bis 4 Stunden. Achten Sie auf eine Reihe von Brunnen ohne Label-Behandlung in 1x HBSS / PBS. Auch eine Gewichtskontrolle GPCR mit AZF-GPCR-Varianten vergleichen. </li><li> Waschen der Zellen 3-mal mit 100 &amp;mgr; l / Vertiefung Blockierungspuffer, BB (1x PBS, 0,5% BSA), um nicht umgesetztes Etikett vollständig zu entfernen. </li><li> Bewerben 100 ul / 4% Paraformaldehyd (aus einer 16% Lager in 1x PBS) zu den Zellen. Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur. Dreimal mit BB waschen. </li><li> Führen Sie Standard-Zelloberfläche ELISA-Protokoll, um markierten Rezeptor und Rezeptor-Expression zu erkennen. Inkubation mit primärem Antikörper für 1,5 h auf Eis, gefolgt von Sekundär eintibody Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde. <ol><li> 100 l Anti-FLAG-M2-Antikörper (z. B. 1:2000 Verdünnung des Antikörpers in BB) an FLAG-Peptid-Epitop des FLAG-Triarylphosphins Markierungsreagenzes zu erkennen. Sonde auch ohne Etikett behandelten Vertiefungen als Negativkontrolle. Hinzufügen anti-CCR5-2D7 (wir verwenden eine 1:500 Verdünnung)-Antikörper mit einem getrennten Satz von Vertiefungen, um zu bestimmen wt oder AZF-GPCR-Zelloberflächenexpression. </li><li> Mit BB waschen Zellen dreimal, und Inkubation mit 100 &amp;mgr; l HRP-konjugiertes Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (1:2000 Verdünnung). </li><li> Sorgfältig waschen Sie die Zellen fünfmal mit BB. In 50 ul Detektionspuffer: Amplex Rot, 20 mM H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 Verhältnis) und Inkubation 15 Minuten bei Raumtemperatur. Sammeln spektralen Daten auf einer Fluoreszenz Multi-Well-Plattenlesegerät bei λ ex = 530 und λ em = 590. </li></ol></li></ol> 4. Bioorthogonale Fluoreszenzmarkierung eines GPCR <ol><li> Lyse10 7 Zellen, geerntet oder AZF Gew.-Rhodopsin-Varianten in 1 ml Lösungspuffer, enthaltend 1% (w / v) DM, 50 mM HEPES oder Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 und Protease-Inhibitoren für 1 h bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Zelllysat bei 15.000 g für 10 min und sammeln die Überstandsfraktion. </li><li> 100 l-mAb 1D4 Sepharose 2B Rezeptor Harz erfassen mit Hilfe der C-Terminus entwickelt 1D4 Epitop. Inkubation für 12 Stunden bei 4 ° C. Dreimal mit 0,1% Das Harz (w / v) DDM in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,3. </li><li> Mit 0,1 mM Fluorescein-Phosphin in einem Gesamtvolumen von 0,3 - 0,5 mL an Rezeptor auf der Immun-Affinitätsmatrix (mAb 1D4-Sepharose 2B) immobilisiert beschriften. Inkubation für 12 Stunden bei Raumtemperatur. Zentrifuge und entfernen Stand. Das Harz, um nicht umgesetztes Etikett zu entfernen. </li><li> Eluieren des markierten Rezeptors mit 100 ml Elutionspuffer, enthaltend 0,1% (w / v) DDM und 0,33 mg / ml Nonapeptid (C9-Peptid gegen die Epitop 1D4)in 2 mM Phosphat-Puffer, pH 6,0 durch Inkubation auf Eis für 1 Stunde. </li><li> Beheben markierten Proben durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen. Kurz waschen Gele in PBS und dann visualisieren Kennzeichnung von AZF-GPCR durch in-Gel-Fluoreszenz. Verwenden Sie beispielsweise einen konfokalen Fluoreszenz-Scanners mit einem 488-nm-Laserwellenlänge an den Rezeptor mit Fluorescein modifizierte erkennen. </li></ol>

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Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben hier eine robuste Methode zur ortsspezifischen Einbau eines reaktiven Sonde, AZF, in GPCRs und zeigen drei nützliche Anwendungen dieses Werkzeug, um die Struktur und Dynamik von GPCRs zu studieren. Unsere Methode zur ortsspezifisch integrieren UAAs umgeht ein grundsätzliches Problem mit einer alternativen Strategie, die auf chemisch Beschriftung 32, 33 oder Anbringen Photovernetzer 34 zu einem einzigen zugänglichen Cystein-Mutante. Obwohl die chemischen Cysteinthiolgruppen Ziel verw...

Heptahelikalen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eine Superfamilie von hochdynamischen Membranproteine, die wichtige und vielfältige extrazelluläre Signale zu vermitteln. In der klassischen Paradigma wird Rezeptor-Aktivierung mit Liganden-induzierter Konformationsänderungen gekoppelt. 1, 2 Jüngste Fortschritte in der Strukturbiologie von GPCRs haben bedeutende Einblicke in die molekularen Mechanismen der Transmembran-Signalisierung zur Verfügung gestellt. 3-5 jedoch mit größerer Präzision der chemischen verstehen Funktionsmechanismus und Strukturdynamik von GPCR-Signalisierung wird ein Toolkit Ansätze erforderlich, um informative molekulare und chemische Sonden enthalten, um aktive Signalkomplexe zu verhören. Zu diesem Zweck angepasst wir eine Methode, um ortsspezifisch einzuführen nicht oder minimal störenden Sonden in exprimierten Rezeptoren basierend auf unnatürliche Aminosäure (LF) Mutagenese mit Amber-Codon Unterdrückung Technologie zuvor von Schultz und c Pionieroworkers. 6 Wir optimierten die UAA-Mutagenese-Methode, um eine High-Yield-Expression und Mutagenese-System für Proteine, wie zB GPCRs, die nur schwer in anderen als den meisten Säugetierzellen heterologen Systemen zum Ausdruck zu erzielen. Mit einem orthogonalen entwickelt Suppressor-tRNA und entwickelte sich Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paar für eine bestimmte UAA, wir ortsspezifisch eingeführt UAAs ausgedrückt Ziel GPCRs. Der erfolgreiche Einbau UAAs, p-Acetyl-L-Phenylalanin (ACF), p-Benzoyl-L-phenylalanin (BzF) und p-Azido-L-phenylalanin (AZF) wurde in unserem Modell GPCRs nachgewiesen - Rhodopsin und Menschen CC-Chemokin-Rezeptor CCR5. 7, 8 Im Prinzip kann ein UAA genetisch an beliebigen Stellen innerhalb der Proteinsequenz codiert werden, und diese Eigenschaft ist ein unschätzbares Werkzeug, wie es biochemische ermöglicht Single-Codon Abtastung eines Ziel GPCR. Wir konzentrieren uns hier speziell auf die Vielseitigkeit der UAA, AZF, die eine reaktive azi hatEinheit zu tun. Zusätzlich zur Funktion als eine einzigartige Infrarot (IR)-Sonde, 8, 9 AZF kann auch als photoaktivierbare Vernetzer dienen, indem sie mit benachbarten primären Aminen oder aliphatische Wasserstoffe dienen. Zusätzlich kann das biologisch inert Azidogruppe als selektive chemische Griff in bioorthogonalen Markierungsreaktionen teilnehmen. Hier präsentieren wir Ihnen Beispiele, die die nützlichen Anwendungen von ortsspezifischen Einbau von AZF in GPCRs, wie gezielte Photofalle zu einem Rezeptor-Liganden-Komplex, und Modifikation von GPCRs durch bioorthogonale Epitop-Tagging und Fluoreszenzmarkierungsstrategien. Photoaktivierbare Reagenzien sind verwendet worden, um biologische Systeme untersuchen seit den 1960er Jahren. 10 In diesem Zeitraum sind eine Fülle von Rezeptor-Ligand-Vernetzungsexperimente wurde berichtet, GPCR-Komplexe zu untersuchen, von denen die meisten bei dem durch Verwendung von Photoaffinitätsliganden. 11, 12 jedoch, diese Anwendungen sind technisch begrenzt, da sie requirE Synthese von Liganden mit einer Vernetzungsgruppe. 13-15 Zudem mit dem Vernetzer-Einheit in dem Liganden, es ist eine Herausforderung, die Position der auf der Querverbindung GPCR identifiziert. Ortsspezifisch Einführen Photogruppen UAAs in Proteine ​​unter Verwendung der Amber-Codon Unterdrückungstechnik ist ein wertvoller Fortschritt. 16, 17. Wir entwickelten eine Phototechnik, um die Bindungsschnittstelle an einen Rezeptor, der in der Bildung eines Rezeptor-Ligand-Komplex beteiligt ist, zu identifizieren lebende Zellen durch die Einführung von photolabilen Gruppen in GPCRs. 18, 19 Hier beschreiben wir die Versuchsprotokoll und Methode der Datenanalyse für die Anwendung dieses gezielte Photo Technologie, um die Bindungsstelle eines niedermolekularen Liganden, tritiiertes Maraviroc, auf CCR5 identifizieren. Dieses Verfahren nutzt die genaue Quantifizierung der radioaktiven Griff auf dem Liganden, die neben Beibehaltung der nativen chemischen Struktur des Liganden. Fluoreszenz-basierte Techniken unterstützen die präzise Kenntnis der strukturellen Basis der Rezeptor-Aktivierung durch direkte Erforschung der Konformation des Rezeptors. 20, 21 jedoch ortsspezifisch sind Techniken, die über die Flexibilität, um Fluoreszenzmarkierungen in GPCRs vorstellen begrenzt. Wir interessieren uns für den Einsatz bioorthogonale chemische Modifikation von Strategien zur Einzelmoleküldetektion (SMD) der GPCR-Signalkomplexe zu erleichtern. 22. Die Azidogruppe in bioorthogonale Chemikalien wie Staudinger-Ligation Bertozzi, 23, 24 kupferfreien Stamm-Azid-Teilnahme Alkin-Cycloaddition (SPAAC) 25 und Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) 26 Wir konzentrieren. hier auf der Staudinger-Bertozzi Ligationsreaktion, die die spezifische Reaktion zwischen einem Azid und einem Phosphin beinhaltet. Wir zeigen die Verwendung zweier unterschiedlicher Phosphin-Derivate, ein Peptid-Epitop (FLAG-Peptid) oder einer fluoreszierenden Markierung konjugiert(Fluorescein), um ortsspezifische Modifikation von GPCRs zu erreichen. Wir haben bereits optimiert die Bedingungen für die ortsspezifische Markierung von Rhodopsin AZF-Varianten mit Hilfe der Röntgenkristallstruktur und dynamische Simulationen, um Zielstellen, die Lösungsmittel ausgesetzt sind, zu wählen. 27, 28 Wir veranschaulicht auch die Möglichkeit, Hintergrundfreie Kennzeichnung zu erreichen durch Staudinger- Bertozzi Ligation. 29. Wir zeigen hier eingesetzt, um die Fluoreszenzmarkierung von einem Reinigungsmittel mit gelöstem Rezeptor, der auf einer Immun Matrix immobilisiert wird und anschließend durch in-Gel-Fluoreszenz sichtbar zu erzielen allgemeine Verfahren. Außerdem zeigen wir eine sinnvolle Erweiterung auf dieser Kennzeichnungsstrategie zu Positionen zugänglich Kennzeichnung auf einem Rezeptor unbekannter Struktur, CCR5 identifizieren. Dies wird unter Verwendung einer Zielpeptid-Epitop-Tagging-Strategie, die auf bioorthogonalen Modifikation AZF-GPCR-Varianten in einem zellbasierten semiHochDurchSatzFormat durchgeführt stützt. 30 DieserVerfahren nutzt die mehrstufige Detektionseigenschaften eines Zelloberflächen-ELISA zur Kennzeichnung Ereignisse überwachen. Die Methoden wir hier diskutieren, sind die allgemeinen und im Prinzip kann auf jeden GPCR mit AZF mit der Amber-Codon Unterdrückung Technologie integriert angewendet werden. In den Protokollen hier präsentierten wir detailliert die Schritte in Säugerzell Expression von Rezeptoren mit UAAs wie AZF mit der unnatürlichen Aminosäure-Mutagenese-Methode und ihre Folgeanträge auf strukturelle und dynamische Studien von GPCRs erleichtern eingebaut beteiligt.

<table><tbody><tr><td>Plasmid pSVB. Yam</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2008)</td></tr><tr><td>Plasmid pcDNA.RS für azF</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2009)</td></tr><tr><td>Plasmide pMT4.Rho und pcDNA 3.1.CCR5</td><td></td><td></td><td>Enthalten optional das bernsteinfarbene Stoppcodon (TAG) an einer gewünschten Position</td></tr><tr><td>HEK 293T-Zellen</td><td></td><td></td><td>Adhärente Zellen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10566</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Zwillinge Bio-Produkte</td><td>100-106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine Plus</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-azido-L-phenylalanin</td><td>Chem-Impex International</td><td>6162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabelle 1. Ortsspezifischer genetischer Einbau von unnatürlichen Aminosäuren in GPCRs-Materialien</td></tr><tr><td>Maxima ML-3500S UV-A-Lampe</td><td>Spectronics Corporation</td><td></td><td>azF wird durch 365-nm-Licht aktiviert</td></tr><tr><td>Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tritium-markierter Ligand</td><td></td><td></td><td>Von einem Mitarbeiter (Grunbeck et al., 2012)</td></tr><tr><td>1% (w/v) n-Dodecyl-&beta;-D-Maltosid</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1D4-Sepharoseharz</td><td></td><td></td><td>1D4 mAb, immobilisiert auf CNBr-aktiviertem Sepharose-2B-Harz</td></tr>, <tr><td>1% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS-Gele</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE durchgeführt auf NuPAGE-Gerät</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD-Gerät</td><td>Biorad</td><td></td><td>Gerät für den halbtrockenen Transfer</td></tr><tr><td>Immobilon Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fettfreie Milch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9934262</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Aldrich</td><td>274348</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td>Szintillationsflüssigkeit</td></tr><tr><td>Szintillationsfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>333726</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Flüssigszintillationszähler</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Beta-Szintillationszähler</td></tr><tr><td>Anti-Rhodopsin 1D4 mAb</td><td>National Cell Culture Center</td><td>custom</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Anti-Maus-IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1806</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyblot CL AR Folie</td><td>Denville</td><td>E3018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabelle 2. Gezielte Photovernetzungsmaterialien</td></tr><tr><td>0,25% Trypsin</td><td>Invitrogen</td><td>15050065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FLAG-Triarylphosphin</td><td>Sigma</td><td>GPHOS1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>M2 FLAG</td><td>mAb Sigma</td><td>F1804</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CCR5 2D7 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555990</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Costar</td><td>3601</td> Transparenter <td>Boden, hohe Bindung EIA/RIA</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Calcium, Magnesium)</td><td>Gibco</td><td>14040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>28908</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HRP-konjugierte</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>;</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>;</td></tr><tr><td>Amplex Rot</td><td>Invitrogen</td><td>A12222</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>DE Healthcare Products</td><td>97-93399</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CytoFluor II Fluoreszenz-Multiwell-Platten-Reader</td><td>Perseptive Biosystems</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials</td></tr><tr><td>Fluorescein-phosphine</td><td></td><td></td><td>(Huber et al., submitted 2012)</td></tr><tr><td>Nonapeptide (C9 peptide)</td><td>AnaSpec</td><td>62190</td><td>Peptidemime the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH</td></tr><tr><td>1% (w/v) n-dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1D4-Sepharoseharz</td><td></td><td></td><td>1D4 mAb, immobilisiert auf CNBr-aktiviertem Sepharose 2B-Harz</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS-Gele</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE durchgeführt auf NuPAGE-Gerät</td></tr><tr><td>Konfokaler Typhoon 9400 Fluoreszenzscanner</td><td>GE Healthcare</td><td>eingestellt</td><td>Scanner mit 488-nm-Wellenlängenlaser</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Tabelle 4. Fluoreszierende Markierungsmaterialien</td></tr></tbody></table>

genetisch kodierte molecular probes, um g-protein-gekoppelte rezeptoren studieren

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Um strukturelle und dynamische Untersuchungen von G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-Signalkomplexe zu erleichtern, sind neue Ansätze erforderlich, um informative Sonden oder Etiketten in exprimierten Rezeptoren, die Rezeptor-Funktion nicht stören, nicht vorstellen. Wir verwendeten Amber-Codon Unterdrückungstechnologie genetisch codieren die unnatürlichen Aminosäure-, p-Azido-L-phenylalanin (AZF) an verschiedenen Positionen in gezielter GPCRs heterolog in Säugerzellen exprimiert. Die Vielseitigkeit der Azidogruppe ist hier in verschiedenen Anwendungen dargestellt, dass GPCRs in ihrer Mutterzellumgebung oder unter Reinigungsmittel gelösten Bedingungen zu studieren. Zuerst zeigen wir eine zellbasierte Zielphototechnik, um die Rückstände in den Liganden-Bindungstasche von GPCR wo ein Tritium-markierten niedermolekularen Liganden mit einem genetisch codierte Aminosäure Azido vernetzt identifizieren. Wir haben dann zeigen, ortsspezifische Modifikation von GPCRs durch die bioorthogonale Staudinger-Ligation Bertozzi Reaktionention, die die Azidogruppe zielt mit Phosphin-Derivate. Wir diskutieren eine allgemeine Strategie zur gezielten Peptid-Epitop-Tagging von exprimierten Membranproteinen in-Kultur und ihrer Erkennung mit Hilfe eines Ganzzell-ELISA-basierten Ansatz. Schließlich zeigen wir, dass AZF-GPCRs selektiv mit fluoreszierenden Sonden markiert werden. Die diskutierten Methoden sind die allgemeinen, in dass sie sich grundsätzlich an jede Aminosäureposition in jedem angewendet werden, ausgedrückt GPCR aktive Signalkomplexe zu verhören.

Wir beschäftigten die unnatürliche Aminosäure Mutagenese Methode zur ortsspezifisch molekulare Sonden einzuführen in ein GPCR mit der Amber-Codon Unterdrückung Technologie. Das Schema in Abbildung 1 skizziert die wesentlichen Schritte der Methodik und die verschiedenen Anwendungen der Einbeziehung der vielseitige UAA, p-Azido-L-Phenylalanin (AZF) in GPCRs. Die Expression von AZF-GPCRs in Säugerzellen ermöglicht eine gezielte Photoliganden und gezielte Peptid-Epitop-Tagging oder fluoreszierenden...

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine einzelne aussagekräftige Sonde in Ziel-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren einzuführen, um strukturelle und dynamische Untersuchungen von Signalisierungskomplexen zu erleichtern. Dies wird erreicht, indem Zellen mit den Plasmiden durchsetzt werden, die für die Expression der erforderlichen Translationsmaschinerie notwendig sind, um die nichtnatürliche Aminosäure Zeto-Phenylalanin oder Zeto-Fee in einen exprimierten GPCR einzubauen. Die GPCR-Variante mit Zeto-Fee kann anschließend auf drei verschiedene Arten genutzt werden, um Struktur und Funktion des Rezeptors zu untersuchen.Zunächst wird das Zeto-Fee als photoaktivierbarer Vernetzer beim GPCR verwendet, was die Identifizierung der Bindungsstelle eines tritiierten Liganden ermöglicht. Anschließend kann das Zeto-Fee als reaktiver chemischer Griff genutzt werden, um über bio-orthogonale Markierungschemien ein Peptid-konjugiertes oder fluoreszierendes Probe am GPCR anzubringen. Es werden Ergebnisse erzielt, die den Einsatz der molekularen Sonde Zeto-Fee bei gezielter Photo-Vernetzung, gezielter Epitop-Markierung und fluoreszierender Markierung von GPCRs auf der Grundlag

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Einfache Methoden zum Nachweis der selektiven Aktivierung von G-Proteinen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren stellen nach wie vor eine herausragende Herausforderung bei der zellulären Signalübertragung dar. Hier wurden Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) Biosensoren entwickelt, indem ein GPCR an G-Proteinpeptide paarweise gebunden wurde, um Konformationsänderungen bei kontrollierten Konzentrationen in lebenden Zellen zu untersuchen.

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ 35 S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphats ([ 35 S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

Beschriebenen zelluläre Assay dient zur Identifizierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4)-interaktiver Agenten, die hemmen oder fördern, kompetitiv oder allosterically, die intrazelluläre Ca2 + Release von CXCR4 Aktivierung initiiert.

Eine kinetische Fluoreszenz basierenden Ca2 + Mobilisierung Assay, G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten allosterische Modulatoren zu identifizieren

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Da GPCRs attraktive arzneimittelfähige Ziele sind, ist das GPCR-Ligandenscreening daher für die Identifizierung von Bleiverbindungen und für Deorphanisierungsstudien unerlässlich. Im Rahmen dieser Bemühungen beschreiben wir PRESTO-Tango, eine Open-Source-Ressourcenplattform, die für die gleichzeitige Profilierung der vorübergehenden Rekrutierung von "Arrestin2" bei ca. 300 GPCRs mit einem TEV-basierten Reportertest verwendet wird.

Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

Dieses Protokoll nutzt die Agaroseschwellung als eine leistungsfähige und generalisierbare Technik zum Einbau von integralen Membranproteinen (IMPs) in riesige unilamellare Lipidvesikel (GUVs), wie hier für die Rekonstitution des menschlichen 1A-Serotoninrezeptorproteins (5-HT1AR), einer der Klassen pharmakologisch wichtiger G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, beschrieben.

Konstruktion von Modelllipidmembranen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von BRET-basierten Biosensoren zur Echtzeitmessung der G-Protein-Aktivierung in lebenden HEK293-Zellen nach Stimulation durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorliganden. Hier dienen der β2-adrenerge Rezeptor und der Cannabinoid-Typ-1-Rezeptor als Beispiele, um die Effizienz von Sensoren für mehrere G-Protein-Subtypen und über verschiedene GPCRs hinweg zu demonstrieren.

BRET-basierte G-Protein-Biosensoren zur Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoraktivität in lebenden Zellen

Testen visuelle Empfindlichkeit in Echsen mit einem operante Konditionierung, die Video-Wiedergabe von random-dot kinematograms und computer-generierte Wirbellosen beschäftigt.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Erfahren Sie, wie genetisch kodierte Molekularsonden mit p-Azido-L-Phenylalanin zur Untersuchung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht gezieltes Photocrosslinking und bioorthogonale Markierung für strukturbiologische Studien.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

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