Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine einzelne aussagekräftige Sonde in Ziel-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren einzuführen, um strukturelle und dynamische Untersuchungen von Signalisierungskomplexen zu erleichtern. Dies wird erreicht, indem Zellen mit den Plasmiden durchsetzt werden, die für die Expression der erforderlichen Translationsmaschinerie notwendig sind, um die nichtnatürliche Aminosäure Zeto-Phenylalanin oder Zeto-Fee in einen exprimierten GPCR einzubauen. Die GPCR-Variante mit Zeto-Fee kann anschließend auf drei verschiedene Arten genutzt werden, um Struktur und Funktion des Rezeptors zu untersuchen.

Zunächst wird das Zeto-Fee als photoaktivierbarer Vernetzer beim GPCR verwendet, was die Identifizierung der Bindungsstelle eines tritiierten Liganden ermöglicht. Anschließend kann das Zeto-Fee als reaktiver chemischer Griff genutzt werden, um über bio-orthogonale Markierungschemien ein Peptid-konjugiertes oder fluoreszierendes Probe am GPCR anzubringen. Es werden Ergebnisse erzielt, die den Einsatz der molekularen Sonde Zeto-Fee bei gezielter Photo-Vernetzung, gezielter Epitop-Markierung und fluoreszierender Markierung von GPCRs auf der Grundlage von Methoden an lebenden Zellen und biochemischen Verfahren zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Photoaffinitätsliganden oder der Cysteinmarkierung liegt in der Flexibilität, gezielt eine biologisch inerte und reaktive, unnatürliche Aminosäure, p-Zeto-Phenol-Alanin, an einer bekannten Position in einem Zielrezeptor einzuführen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der GPCR-Signaltransduktion zu beantworten, beispielsweise durch die Kartierung der Interaktionsstellen in einem Rezeptor-LIG-Komplex im nativen Membranmilieu sowie durch die Erleichterung von Einzelmolekül-Fluoreszenzuntersuchungen, indem Positionen im A-G-P-C-R identifiziert werden, die für eine bioorthogonale Markierung geeignet sind. Drittens kann diese Methode Einblicke in den molekularen Wirkmechanismus von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren liefern und ist außerdem auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise eine Vielzahl zellulärer und membranständiger Proteine. Vor Beginn dieses Experiments sollten HEC 2 9 3 T-Zellen in KO's modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, bei 37 Grad Celsius in einer 5%igen CO2-Atmosphäre kultiviert werden.

Transfizieren Sie Zellen bei 60 bis 80 % Konfluenz in einer 10 cm-Platte mit G pcr, r CD, NA unter Verwendung des Lipectomy-Plus-Reagenzes, wie im Textprotokoll beschrieben. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch DMEM, das 10 % FBS und 0,5 Millimolar Fee enthält. Analysieren Sie 48 Stunden nach der Transfektion die Expression, wie im Text beschrieben.

Fahren Sie mit den in der weiteren Videosequenz beschriebenen Verfahren zur Fotografie, Vernetzung oder Markierung fort. 48 Stunden nach der Transfektion das Zellkulturmedium abziehen und durch vier Milliliter 1 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ersetzen. Anschließend 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit sich die Zellen von der Platte lösen. Danach die Zellen in 1 x PBS resuspendieren und in ein Falcon-Röhrchen überführen. Zentrifugieren bei 1500 U/min für zwei Minuten.

Um die Zellen zu pelletieren, aspirieren Sie das Überstand, bevor Sie das Zellpellet in einer x Hanks-Pufferlösung mit Salz suspendieren, die den tritiummarkierten Liganden in saturierender Bindungskonzentration enthält, wie im Textprotokoll beschrieben. Inkubieren Sie das Pellet für die erforderliche Dauer bei 37 Grad Celsius, um die Bildung des Rezeptor-Ligand-Komplexes sicherzustellen, was von dem spezifischen Rezeptor und Liganden abhängt. Danach überführen Sie die Zellsuspension in eine 24-Well- oder 96-Well-Platte.

Danach das Zeto-Fee mit einer Ultraviolett-Lampe bei 365 Nanometern für 15 Minuten bei vier Grad Celsius photoaktivieren, wobei die Platte auf Eis gehalten wird, um eine Erwärmung der Probe und eine Zelllyse zu vermeiden. Nach der Photoaktivierung die Zellen in ein Einohr-Gefäß überführen und zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren. Den Überstand entfernen und mit der Analyse fortfahren.

Suspendieren Sie das Zellpellet in Puffer zur Zelllyse und inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie danach das Zelllysat zehn Minuten lang bei 16.000 ×g. Bevor Sie das Überstand auf ein neues Röhrchen überführen, geben Sie 1D4 monoklonalen Antikörper-modifizierte SROs zwei B Harz zum Überstand hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius, um den GPCR mittels des konstruierten C-terminale 1D4 monoklonalen Antikörper-Epitops zu immunreinigen. Am nächsten Tag waschen Sie die Harzperlen mehrmals mit Puffer zur Zelllyse. Eluieren Sie die Proben mit 1 % SDS bei 37 Grad Celsius eine Stunde lang unter Schütteln.

Überführen Sie einen Teil des EENT in ein 15-Milliliter-Gefäß, das Szintillationsflüssigkeit enthält, und zählen Sie es an einem Beta-Szintillationszähler, um die Menge der spezifischen Bindung des tritierten Liganden an den Rezeptor zu quantifizieren. Trennen Sie das verbleibende gereinigte EENT durch Standard-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 4–12%-SDS-Gels mit Standard-Proteinladder. Anschließend übertragen Sie es halbtrocken auf eine A-P-V-D-F-Membran zur Immundetektion.

Blocken Sie die PVDF-Membran mit 5 % Milch in TBS-Puffer, der 0,05 % Tween 20 enthält. Untersuchen Sie die Membran auf Expression des vollständigen Rezeptors mit dem monoklonalen Antikörper 1D vier, gefolgt von einem HRP-konjugierten sekundären anti-US-IgG-Antikörper. Anschließend behandeln Sie die Membran mit einem verbesserten Chemilumineszenzreagenz.

Legen Sie die Membran auf ein Autoradiographiefilm, um die Banden sichtbar zu machen. Schneiden Sie anschließend die Membran mit einer Rasierklinge entlang der Probenbahnen auseinander und danach an spezifischen molekulargewichtsspezifischen Markern. Überführen Sie die Membranabschnitte in Vials, die Szintillationsflüssigkeit enthalten, und quantifizieren Sie die Menge an Tritium in jedem Membranabschnitt durch Zählung an einem Beta-Szintillationszähler.

Identifizieren Sie die positive fotochemische Vernetzung durch den Nachweis von Tritium bei der scheinbaren molekularen Masse, die der Summe aus GPCR und Ligand entspricht. Nach dem Waschen und Zählen der Zellen beschichten Sie eine 96-Well-Hochbindungsplatte mit klarem Boden vorab mit 100 Mikrolitern von 10 Mikrogramm pro Milliliter Poly-D-Lysin pro Vertiefung und inkubieren 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Danach wiederholt mit einem XPBS waschen, bevor die transfizierten Zellen bei einer Dichte von 60.000 bis 80.000 Zellen pro Vertiefung in 200 µL auf eine Platte gegeben und bei 37 °C in einer 5 % CO2-Atmosphäre inkubiert werden. Am nächsten Tag.

Bereiten Sie die Zellen zur Markierung vor. Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit je 100 Mikrolitern pro Vertiefung mit einem XPBS, um jegliche Wachstumsmedien mit Zeto-Fee zu entfernen. Bereiten Sie einen Puffer mit 50 bis 200 Mikromolar Flag-Tri-AAL-PHOSPHIN-Markierungsreagenz gemäß dem schriftlichen Protokoll vor.

Geben Sie 60 Mikroliter auf jedes Loch. Führen Sie eine Reihe von Löchern ohne Markierungsbehandlung und mit Puffer durch. Schließen Sie außerdem eine Wildtyp-GPCR-Kontrolle ein, um sie mit einer Zeto-Futter-GPCR-Variante zu vergleichen.

Bringen Sie die Platte nach der Inkubation zwischen 30 Minuten und vier Stunden wieder auf 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen dreimal mit je 100 Mikroliter Blockierpuffer pro Mulde, um die nicht reagierten Markierungen vollständig zu entfernen. Anschließend geben Sie nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur je 100 Mikroliter 4 % Paraformaldehyd pro Mulde zu den Zellen.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit Blockierpuffer. Führen Sie ein standardmäßiges Zelloberflächen-EISA-Protokoll zur Detektion des markierten Rezeptors und der Rezeptorexpression durch, indem Sie zunächst 1,5 Stunden auf Eis mit dem primären Antikörper inkubieren. Anschließend folgt eine Inkubation mit dem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde.

Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter verdünnter Anti-Flag M2-Antikörper hinzu, um das Flag-Peptid-Epitop des Flag-Tri-AAL-Phosphinmarkierungsreagens nachzuweisen. Verwenden Sie außerdem nicht markierte, behandelte Vertiefungen als negativen Kontrollansatz.

Anschießend verdünnte anti-CCR5-2D7-Antikörper zu separaten Sätzen von Vertiefungen hinzufügen, um die Expression von Wildtyp- oder Zeto-Fee-GPCR auf der Zelloberfläche zu bestimmen. Die Zellen dreimal mit Blockierpuffer waschen und mit 100 µL verdünntem HRP-konjugierten anti-US-IgG-Antikörper inkubieren.

Nachdem die Zellen fünfmal vorsichtig mit Blockierpuffer gewaschen wurden, 50 Mikroliter Detektionspuffer hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Abschließend spektrale Daten mit einem fluoreszenzbasierten Mehrfach-Well-Plattenreader bei einer Anregungswellenlänge von 530 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 590 Nanometern erfassen. Beginnen Sie den Markierungsprozess, indem Sie 10 Millionen geerntete Zellen lysieren, die den Wildtyp oder zeto fee exprimieren.

Rod-Opsin-Varianz in einem Milliliter Solubilisierungspuffer für eine Stunde bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie die überstehende Fraktion nach der Zentrifugation des Zelllysats bei 15.000 ×g für 10 Minuten. Geben Sie dann 100 Mikroliter der 1D4-monoklonalen Antikörper-modifizierten Spheros-2B-Harzes hinzu, um den Rezeptor mittels des konstruierten C-terminalen 1D4-Epitops zu isolieren.

Nach einer Inkubation für 12 Stunden bei vier Grad Celsius wird das Harz dreimal gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll gewaschen. Als Nächstes wird der an der Immunoaffinitätsmatrix immobilisierte Rezeptor markiert, indem 0,1 Millimolar Fluoresceinphosphin zu einem Gesamtvolumen von 0,3 bis 0,5 Milliliter hinzugegeben wird, gefolgt von einer Inkubation für 12 Stunden bei Raumtemperatur, bevor nach Entfernung des Überstandes zentrifugiert wird. Das Harz wird gewaschen, um nicht umgesetzte Markierung zu entfernen, und der markierte Rezeptor mit 100 Mikrolitern Elian-Puffer durch Inkubation auf Eis für eine Stunde eluiert.

Trennen Sie markierte Proben per SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen. Waschen Sie die Gele kurz in PBS, bevor Sie einen Zeto-Fee markieren. GPCR durch Ingel-Fluoreszenz unter Verwendung eines konfokalen Fluoreszenzscanners mit einem Laser der Wellenlänge 488 Nanometer, um den mit Fluorescein modifizierten Rezeptor nachzuweisen.

Die Methode der Mutagenese mit nichtnatürlichen Aminosäuren wurde verwendet, um gezielt molekulare Sonden mittels Amber-Codon-Suppressionstechnologie an der C-Seite in den A-G-P-C-R einzuführen. Anschließend kann die photochemische Vernetzungstechnik eingesetzt werden, um die strukturellen Aspekte von GPCR-Ligand-Komplexen in lebenden Zellen zu untersuchen, wobei ein radioaktiv markierter kleiner Molekül-Ligand, Tritium-markiertes Ravi Rock, verwendet wurde, um dessen Bindungsstelle am G-P-C-R-C-C-R fünf zu identifizieren.

In diesem Beispiel führt die UV-Bestrahlung von Zellen, die zeto fee exprimieren, sowie der CCR-fünf-Variante, die vorab mit tritiiertem Ravi inkubiert wurden, zu kovalent vernetzten Komplexen, die mithilfe des empfindlichen radioaktiven Markers am Liganden identifiziert werden können.

Unter den verschiedenen an CCR5 getesteten Positionen konnten Lucin 28 Zeto-Fee und Tryptophan 86 Zeto-Fee photochemisch mit tritiiertem Ravi Rock vernetzt werden, wie durch signifikant höhere Szintillationszählergebnisse dargestellt. Der Wildtyp-Rezeptor zeigte keine Vernetzung mit dem radioaktiven Liganden. Bio-orthogonale Markierungschemien können verwendet werden, um eine Zeto-Fee-Stelle gezielt zu modifizieren.

Bei der GPCR-Variante besteht eine Strategie darin, den gezielten Epitop-Tagging von A-G-P-C-R in lebenden Zellen unter Verwendung eines Peptid-konjugierten Markers, des Flag-Peptids, durchzuführen. Das Tri-AAL-PHOSPHIN-Markierungsmittel wird verwendet, um spezifisch und selektiv ein Zeto-Fee zu modifizieren. Die hier gezeigte CCR5-Variante zeigt repräsentative Daten einer empfindlichen und mehrstufigen EISA-Nachweisstrategie, die zur Identifizierung von Positionen eingesetzt wird, die mit dem Flag-Peptid markiert sind.

Unter den auf CCR5 untersuchten Positionen waren alle Zeto-Fees. CCR5-Varianten wurden an der Zelloberfläche exprimiert, und ungefähr die Hälfte von ihnen durchlief erfolgreich eine gezielte Epitopmarkierung; der Wildtyp CCR5 diente als negativer Kontrollwert für die Epitopmarkierung und zeigte kein Anti-Flag-Signal. In einer alternativen Strategie wurden mit Detergens solubilisierte Zeto-Fee-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die auf einer Immunoaffinitätsmatrix wie dem anti-1D4 monoklonalen Antikörper, konjugiert mit Spheros 2B Harz, immobilisiert waren, mit einem Fluoro4-konjugierten Marker markiert.

Das Ingel-Fluoreszenzbild zeigt die erfolgreiche fluoreszente Markierung des GPCR-Opsins an drei verschiedenen Positionen, wie erwartet; das Wildtyp-Opsin zeigte keine Hintergrundmarkierung, was durch das Fehlen eines fluoreszierenden Bands bei dem erwarteten molekularen Gewicht des Rezeptors sichtbar wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die vollständige Linsenexpression des Ziel-GPCRs mit einer bestimmten, spezifisch eingeführten Säure AOL Alanin zu bestätigen. Nach seiner Entwicklung.

Diese Technik wird es Forschern auf dem Gebiet der Rezeptorbiologie ermöglichen, beliebige Rezeptor-Ligand-Komplexe zu untersuchen oder einen Zielrezeptor zu markieren. Dabei wird die gezielt eingeführte unnatürliche Aminosäure p-Azetophenolalanin als reaktive Sonde verwendet. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mittels der Neogenese unnatürlicher Aminosäuren eine molekulare Sonde in einen GPCR einführt, um strukturelle und dynamische Untersuchungen von GPCR-Signalkomplexen mithilfe gezielter photochemischer Vernetzung und bio-orthogonaler Markierungstechniken zu ermöglichen.