Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Peptide aus formalinfixierten und paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben zu gewinnen und vorab fraktionieren, um eine proteomische Analyse durchzuführen. Dies wird erreicht, indem das gewünschte Gewebe durch Mikrodissektion isoliert und anschließend die Zellen lysiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, durch Probenaufbereitung Peptide zu erzeugen.

Unter Verwendung der multienzymatischen Verdau-gefilterten Probenvorbereitung. Die Peptide werden anschließend durch Messung ihrer Tryptophan-Fluoreszenz quantifiziert. Der letzte Schritt ist die Fraktionierung der Peptide mithilfe einer auf starken Anionenaustauschern basierenden Trenntechnik zur Peptidfraktionierung.

Letztlich ermöglichen die hergestellten Proben die Analyse von Proteomen aus geringsten Materialmengen bis zu einer Tiefe von 10.000 Proteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Gelelektrophorese oder der Verdauung in Lösung, liegt darin, dass sie auf geringste Mengen klinischer Proben anwendbar ist, beispielsweise laser-mikrodissektierte Zellen. Die Methode liefert Proben, die vollständige und reine Peptide enthalten.

Was ermöglicht die proteomische Erforschung menschlicher Gewebe und Krankheiten? Die gesamte Protokollabfolge besteht aus Techniken, die in der Vergangenheit entwickelt und veröffentlicht wurden. Dazu gehören die Hochausbeute-FASP, die Pipettenspitzen-basierte Extraktion sowie die Bestimmung des Peptidgehalts anhand der Tryptophan-Fluoreszenz, wodurch gezeigt wird, dass das Verfahren funktionstüchtig ist.

Catina, eine Technikerin aus unserem Labor, bereitet Gewebeschnitte für die Mikrodissektion vor, indem sie Schnitte mit einem Mikrotom anfertigt. Die Dicke der Schnitte hängt von der Probe ab. Gewöhnlich eignen sich für die Mikrodissektion Schnitte mit einer Dicke von sieben bis zehn Mikrometern.

Nach der Bestrahlung der Membranobjektträger mit UV-Licht für 45 Minuten die Schnitte aufbringen und vor dem Trocknen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden trocknen lassen. Die aufgebrachten Schnitte durch zwei aufeinanderfolgende Inkubationen in aufeinanderfolgenden Gefäßen mit Xylol für zweieinhalb Minuten und eineinhalb Minuten entparaffinieren. Anschließend die Schnitte durch aufeinanderfolgende Schritte rehydrieren.

Einminütige Inkubationen in absolutem Ethanol, 70 % Ethanol und abschließend in Wasser. Nach der Färbung der Schnitte mit Meyer's Hämatoxylin für 20 Sekunden.

Mit Wasser eine Minute lang spülen und an der Luft trocknen lassen. Sammeln Sie die gewünschte Zellpopulation mithilfe eines Laserschneide-Mikrodissektionsystems. Bei Verwendung des PALM-Instruments sammeln Sie die Proben in den Klebekappen unter Verwendung von drei Mikrolitern Puffer zur Gewebelyse für 10 Nanoliter des mikrodissekierten Gewebes.

Tragen Sie das Puffermedium auf das mikrodissezierte Material im Deckel auf und schließen Sie das Röhrchen. Sammeln Sie die Suspension nach einer kurzen Zentrifugation. Danach inkubieren Sie das mikrodissezierte Gewebe eine Stunde lang bei 99 Grad Celsius in einem Heizblock mit Rühren.

Klären Sie das rohe Extrakt durch Zentrifugation bei 16.000 G und 18 Grad Celsius für 10 Minuten. Geben Sie bis zu 50 Mikroliter des geklärten Lysats mit 200 Mikrolitern der UA-Lösung in eine Ultrafiltrationseinheit. Anschließend zentrifugieren Sie bei 14.000 G, bis weniger als 10 Mikroliter der Lösung im Filter verbleiben.

In der Regel erfordert dieser Schritt 10 bis 15 Minuten Zentrifugation. Danach pipettieren Sie 200 Mikroliter der UA-Lösung in die Ultrafiltrationseinheit und zentrifugieren. Wie zuvor leeren Sie das Sammelröhrchen, bevor Sie 50 Mikroliter der IAA-Lösung in die Ultrafiltrationseinheit pipettieren.

Mischen Sie 1 Minute lang bei 600 U/min in einem Thermomischer bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie. Wie zuvor beschrieben, führen Sie die Ultrafiltrations- und Zentrifugationsschritte gemäß der schriftlichen Anleitung durch, die diesem Video beiliegt. Danach überführen Sie die Filtrationseinheiten in neue Sammelgefäße.

Pipettieren Sie 40 Mikroliter Digestionspuffer mit Endoproteinase Lys C, mischen Sie anschließend eine Minute lang bei 600 U/min im Thermomischer. Inkubieren Sie die Einheiten 18 Stunden lang in einer feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren der Filtereinheiten wie zuvor durchgeführt, pipettieren Sie 160 Mikroliter des DB-Puffers und zentrifugieren erneut.

Die Filtereinheiten, durch die der gepoolte Durchlauf strömt, enthalten die Peptide, die durch die Endoprotease Lic C freigesetzt wurden. Sammeln Sie danach die Triptich-Peptide gemäß der schriftlichen Protokollbeschreibung. Die Bestimmung des Peptidgehalts in den Proteinverdauungen kann in verdünntem Puffer durchgeführt werden, da die Tryptophan-Reste gut für das Lösungsmittel zugänglich sind. Um Peptide zu quantifizieren, pipettieren Sie zunächst 0,2 Milliliter Assay-Puffer DB in die Quarz-Küvette.

Platzieren Sie anschließend die Q vet in den QVE-Halter des Instruments und nehmen Sie das Emissionsspektrum für die Blindprobe auf. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve in Schritten von 0,1 Mikrogramm, indem Sie Aliquote von je einem Mikroliter der Tryptophan-Standardlösung zur Q vet hinzufügen und vorsichtig mit dem Puffer db mischen. Nach der Reinigung der Q vet pipettieren Sie die Probe hinein und nehmen Sie das Spektrum der Probe auf.

Fahren Sie mit der Berechnung der Protein- und Peptidkonzentration gemäß der schriftlichen Anleitung vor der Fraktionierung fort. Bereiten Sie die SAX-Tip-Säule vor, indem Sie sechs Schichten der EM.Import-Ionenaustauschmembran in eine übliche 0,2-Milliliter-Pipettenspitze stapeln. Stellen Sie zwei SAX-Tip-Säulen pro Probe her.

Bereiten Sie als Nächstes die Stufenspitze vor, indem Sie drei Schichten von M vier C 18 stapeln. Stellen Sie in einer 0,2-Milliliter-Pipettenspitze sechs Stufenspitzen pro Probe her. Um zu beginnen.

Fractionierung: Verdünnen Sie die durch die Verdauung mit Ly C erhaltenen Peptidlösungen mit 0,2 Milliliter BRI- und Robinson-Puffer, pH 11. Verdünnen Sie die durch die Verdauung mit Trypsin erhaltenen Peptidlösungen ebenfalls mit 0,2 Milliliter Britton- und Robinson-Puffer, pH 5. Bauen Sie die SAX-Tipp-Säule in den Zentrifugenröhrchen-Adapterdeckel ein, bevor Sie die SAX-Tipp-Säule und die C18-Stage-Tips gemäß dem schriftlichen Protokoll waschen und äquilibrieren.

Als Nächstes die SAX-Spitzen-Säule in der C18-Stufen-Spitze zusammenbauen. Die Probelösungen in die äquilibrierten SAX-Spitzen-Säulen geben und die Säulen drei Minuten lang bei 5.000 G zentrifugieren. Die Pipettenspitzen-Säulen mit 0,1 Milliliter der verdünnten Proben waschen.

Unterstützen Sie den Durchfluss durch Zentrifugation bei 5.000 G. Überführen Sie die SAX-Tip-Säule in die nächste C18-Stagetip-Säule und fahren Sie mit der Elution der Peptide gemäß der schriftlichen Protokollbeschreibung fort. Nach dem Waschen der C18-Stagetips mit 0,05 Milliliter Puffer A eluieren Sie die Fraktionen mit 0,05 Milliliter Puffer B in Vials, die später für die Injektion der Proben in ein mit einem repräsentativen Massenspektrometer ausgestattetes Flüssigkeitschromatographiesystem verwendet werden. Ergebnisse der Proteinextraktion und -verdauung werden hier gezeigt.

Die Lyse von 250 Nanolitern Gewebe, was einem mikrodissekierten Bereich von 25 Quadratmillimetern aus einer 10-Mikrometer-Schnitt entspricht, führt nach der zweistufigen, aufeinanderfolgenden Verdauung im FAST-Format mit der Endoprotease Lys-C und Trypsin zu einer Ausbeute von mehr als 50 % des Gesamtproteins, was etwa 45 Mikrogramm entspricht. Dargestellt ist hier eine repräsentative Fluoreszenzmessung des Peptidgehalts; die Spektren des Tryptophan-Standards und der Probe zeigen Maxima bei 350 bis 360 Nanometern. Die Intensität der Fluoreszenz ist proportional zum Tryptophangehalt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben aus hochwertigem Gewebe für die proteomische Analyse mithilfe der Mikrodissektionstechnik, der Probenvorbereitung und der Peptidfraktionierung vorbereitet. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei bis vier Stunden durchgeführt werden, zuzüglich der Zeit, die für die Proteinverdauung benötigt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets frisch präparierte Gewebeschnitte unmittelbar nach ihrer Herstellung zu verwenden. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Proteomik den Weg, um die Proteome von Geweben und Zellen sowie deren Abnormalitäten beim Menschen anhand von formalinfixiertem und paraffineingebettetem Material zu untersuchen.