Question 1

Was ist ein Plasmid und warum wird es bei der bakteriellen Transformation verwendet?

Accepted Answer

Ein Plasmid ist ein kleines, kreisförmiges, doppelsträngiges DNA-Molekül, das seine Größe durch Überwicklung reduzieren kann, sodass es durch bakterielle Zellmembranporen passieren kann. Plasmide enthalten eine multiple Klonierungsstelle zum Einfügen DNA-Fragmente, einen Replikationsursprung für die DNA-Vervielfältigung und ein Antibiotikaresistenzgen, das transformierten Zellen das Überleben in Antibiotika-haltigen Medien ermöglicht.

Question 2

Wie macht Calciumchlorid bakterielle Zellen kompetent?

Accepted Answer

Calciumchlorid schafft eine calciumreiche Umgebung, in der positive Calciumionen negative Ladungen sowohl auf der Plasmid-DNA als auch auf der bakteriellen Zellwand neutralisieren. Diese Neutralisation reduziert die elektrostatische Abstoßung und schwächt die Zellwand, wodurch die Zellen darauf vorbereitet werden, fremde DNA während des Hitzeschock-Verfahrens aufzunehmen.

Question 3

Was passiert während des Heat-Shock-Schritts der bakteriellen Transformation?

Accepted Answer

Ein plötzlicher Temperaturanstieg auf 42°C für 30 Sekunden erzeugt einen Druckunterschied zwischen dem Inneren und Äußeren der Zelle, was die Porenbildung in der bakteriellen Membran induziert. Supergewundene Plasmid-DNA tritt durch diese Poren ein. Nach dem Hitzeschock werden die Zellen sofort auf Eis gekühlt, was der Zellwand ermöglicht, sich selbst zu heilen und das Plasmid im Inneren zu stabilisieren.

Question 4

Was ist Transformationseffizienz und wie wird sie berechnet?

Accepted Answer

Die Transformationseffizienz misst die Erfolgsrate des Transformationsverfahrens. Sie wird berechnet, indem die Anzahl der erfolgreichen Transformanten (Kolonien, die das Plasmid enthalten) durch die Gesamtmenge der ausgebrachten DNA geteilt wird. Diese Kennzahl hilft Forschern zu bewerten, wie effektiv die Hitzeschockmethode Plasmide in Bakterienzellen eingebracht hat.

Question 5

Wie werden chemisch kompetente Zellen vor der Wärmeschock-Transformation vorbereitet?

Accepted Answer

Bakterien werden bis zur mittleren logarithmischen Phase kultiviert, dann zentrifugiert und mehrfach mit kalter Calciumchlorid-Lösung gewaschen, um das Wachstumsmedium zu entfernen. Nach der letzten Wäsche werden die Zellen in Calciumchlorid plus 15% Glycerin resuspendiert, in Mikrozentrifugenröhrchen verteilt und bei -80°C aufbewahrt, bis sie für die Transformation benötigt werden.

Question 6

Warum ist eine aseptische Technik während der bakteriellen Transformation wichtig?

Accepted Answer

Aseptische Technik erhält die Sterilität während des gesamten Transformationsverfahrens, indem verhindert wird, dass Luftverunreinigungen in den Arbeitsbereich eindringen. Ein Bunsenbrenner sterilisiert Instrumente und Reagenzien und erzeugt gleichzeitig einen Konvektionsstrom, der Verunreinigungen fernhält. Dies stellt sicher, dass nur die gewünschten transformierten Bakterien auf Agarplatten wachsen.

Question 7

Was passiert, nachdem transformierte Bakterien aufgetragen wurden und was ist der nächste Schritt?

Accepted Answer

Platten werden über Nacht bei 37°C kopfüber inkubiert, um eine Kondensation zu verhindern. Am nächsten Tag sind Kolonien, die das Plasmid enthalten, sichtbar und können gezählt werden, um die Transformationseffizienz zu berechnen. Ausgewählte Kolonien können dann in Antibiotika-enthaltendem flüssigen Medium für Plasmid-Reinigung Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA für weitere Experimente kultiviert werden.

Transformation von Bakterien: die Hitzeschock-Methode - Bewertungsquiz