Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Modell der zellulären Transplantation basierend auf dem Einsatz von Riech- und Hüllzellen in einem Modell einer Kehlkopfnervverletzung vorzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Nervus laryngeus recurrens durchtrennt und anschließend eine Anastomose durchgeführt wird. Danach werden die aus der Riechschleimhaut oder den Riechbulben gewonnenen Riech- und Hüllzellen transplantiert.

Dann werden die Tiere zwei bis drei Monate nach der Operation mittels Laryngoskopie und Elektromyographie untersucht. Schließlich wird der Nervus laryngeus recurrens für histologische Untersuchungen isoliert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass olfaktorische und Hüllzellen das axonale Nachwachsen des Nervus laryngeus recurrens sowie die funktionelle Erholung der Stimmbänder mittels Laryngoskopie, Elektromyographie und histologischer Messungen verbessern.

Diese Methode kann zentrale Fragen auf dem Gebiet der peripheren Nervenverletzung beantworten, die die Messung des axonalen Wachstums und die Fähigkeit zur Quantifizierung der Funktionalität der Erholung betreffen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die wiederholte Anastomose des N. lal mikrochirurgische Fähigkeiten erfordert. Nachdem GFP-markierte Primärkulturen der Riechbülben (OB) und der Riechschleimhaut (OM) wie im schriftlichen Protokoll beschrieben erzeugt wurden, bereiten Sie die Operation vor, indem Sie alle Instrumente im Autoklaven sterilisieren.

Nachdem die Ratte durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin und Chlorpromazin anästhesiert wurde, überprüfen Sie den Sedierungsgrad durch eine Zehenquetschung, rasieren Sie die Operationsstelle und positionieren Sie die Ratte in Rückenlage. Desinfizieren Sie die Haut durch abwechselndes Abwaschen mit Alkohol und Betadine-Lösung. Danach bereiten Sie eine sterile chirurgische Umgebung vor und wahren Sie sterile Verfahren während der gesamten Operation.

Verwenden Sie ein Skalpell, um einen zwei Zentimeter langen medialen zervikalen Hautschnitt anzulegen. Führen Sie anschließend entlang der mittleren weißen Linie einen vertikalen Schnitt durch die infrahyoidalen Muskeln durch, wobei ein orthostatischer Retraktor zwischen den infrahyoidalen Muskeln platziert wird. Legen Sie den Kehlkopf und danach den Nervus laryngeus recurrens oder RLN frei.

Danach unter einem Operationsmikroskop mit Mikroscheren den Nerven vollständig auf der Höhe des siebten Trachealrings mit einer 11-T-Naht durchtrennen. Führen Sie die Anastomose durch, um den Kehlkopf kurz vor der Transplantation zu denervieren. Verwenden Sie 0,05 % Trypsin-EDTA, um die OB- und OM-Zellen von den Schalen zu lösen.

Um die Verdauung zu stoppen, nachdem die Zellen fünf Minuten bei 432 ×g zentrifugiert wurden, fünf Milliliter warmes Medium hinzufügen. Die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und die Zellkonzentration in diesem Modell zwischen 1,2 und 6 × 10⁶ Zellen einstellen; 30 Mikroliter D-MEM-F12 wurden in einem Mikrozentrifugenröhrchen verwendet. Ein Verhältnis von eins zu zwei von Zellen zu Wachstumsfaktor, reduziertem Matrigel herstellen und kurz vor der Transplantation auf Eis stellen.

Entfernen Sie das Gefäß vom Eis und halten Sie es, um die Mischung zu erwärmen. Geben Sie die Zell-Matrigel-Lösung mithilfe einer Pipette auf die Anastomosestelle und lassen Sie die Mischung sich an der verletzten Nervenstelle selbständig organisieren, sobald sie erstarrt ist. Verschließen Sie die Muskeln und die Haut mit vier Null-Nähten.

Stellen Sie die Ratte in einen individuellen Käfig und halten Sie sie 24 Stunden lang unter einer Wärmelampe. Verabreichen Sie in den nächsten fünf Tagen Schmerzmittel, ungefähr zwei Monate nach der Operation nach erneuter Anästhesie. Überprüfen Sie bei den Ratten, wie zuvor in diesem Video beschrieben, die Sedierung mittels Zehenquetschung.

Legen Sie die Ratte in Rückenlage, bevor Sie ein 30-Grad-Video einsetzen. Stellen Sie das Laryngoskop so ein, dass die beste Sicht auf den Kehlkopf erzielt wird, um bei jeder Aufnahme dieselbe Ansicht zu reproduzieren. Bestimmen Sie anatomische Referenzpunkte wie die hintere Kommissur, die rechte Stimmlippe an ihrer Ansatzstelle an der Stimmbogen-Apophyse des OID und die linke fokale Stimmlippe an ihrer Ansatzstelle an der Stimmbogen-Hypothese des OID.

Zeichnen Sie die Stimmlippenbewegungen auf, indem Sie drei Sequenzen aus aufeinanderfolgenden maximalen Abduktionen und maximalen Adduktionen auswählen. Zur Analyse der Larynxfunktion bestimmen Sie die absolute Winkelbewegung, indem Sie die Differenz zwischen der Bewegung bei maximaler Abduktion und maximaler Adduktion der Stimmlippen messen. Ermitteln Sie die dynamische Punktzahl durch Messung der Bewegungsamplitude und die funktionelle Punktzahl durch Beurteilung von Synkinesen und paradoxen Bewegungen, um eine Elektromyographie durchzuführen.

Platzieren Sie eine Elektrode am Hamstring-Muskel der Ratte, nachdem der Kehlkopf und die Luftröhre wie bei der Anastomose des Nervus recurrens demonstriert freigelegt wurden. Freilegen des Cricothyroid-Knorpels. Öffnen Sie anschließend mit einer Mikroschere den Cricothyroid-Knorpel, um den hinteren cricothyroidalen oder PCA-Muskel freizulegen.

Führen Sie eine monopolare Nadelelektrode in den Muskel ein, während das Tier unter spontaner Beatmung steht. Verwenden Sie ein Erfassungssystem, um die elektrische muskuläre Aktivität des PCA-Muskels aufzuzeichnen. Analysieren Sie die muskuläre Aktivität hinsichtlich ihrer Vielfalt und Synchronisation mit der Atmung, indem Sie eine qualitative Bewertung von null bis drei anhand der folgenden Skala vergeben.

Null entspricht einer unausgeprägten Ableitung ohne Zunahme während der Inspiration. Eins entspricht einer rhythmischen Ableitung mit zunehmender Aktivität während der Inspiration, jedoch geringer Qualität; zwei entspricht einer rhythmischen Ableitung mit stärkerer Aktivität und drei entspricht einer rhythmischen Ableitung, die sehr reichhaltig ist und ein Interferenzmuster aufweist, vergleichbar mit einer maximalen willkürlichen Aktivität.

Danach, um den N. laryngeus recurrens aufgrund seiner geringen Größe nicht zu beschädigen, exponieren Sie den N. vagus, setzen Sie eine Elektrode an und stimulieren Sie an dieser Stelle. Notieren Sie die Latenzzeit und die Dauer des Potentials im Musculus cricoarytaenoideus posterior. Schließlich, nachdem das Tier unter dem Mikroskop durch eine Überdosis Pentobarbital euthanasiert wurde, lokalisieren Sie die Anastomose, nähen Sie und entfernen Sie den distalen Stumpf des N. laryngeus recurrens zwischen der Anastomose und dem Kehlkopf.

Führen Sie die histologische Analyse gemäß dem hier dargestellten Textprotokoll durch, nachdem Zellen aus Primärkulturen der Riechschleimhaut und der Riechbulbi transplantiert wurden, wobei Beispiele von EMG-Ableitungen im PCA-Muskel während der Atmung gezeigt sind. Tiere der Kontrollgruppe zeigten eine intensive elektrische Muskelaktivität mit einem Anstieg während der Inspiration, der in der Rerated-Gruppe nicht vorhanden war. In dieser Abbildung zeigen histologische Analysen des RLN mittels Toluidinblau-Färbung typische Faserprofile von normalerweise reinnervierten und transplantierten Tieren.

Diese Messung ermöglicht die Quantifizierung der Anzahl myelinisierter Fasern, der mittleren Fasergröße sowie der mittleren Myelindicke, wie hier gezeigt. Zur Durchführung der histologischen Analysen wurde das Tracking von GFP-positiven Zellen nach intra nervöser Transplantation im Nervus ischiadicus durchgeführt.

Dieser Ort wurde anstelle des RLN gewählt, da die geringe Größe des RLN eine intra-neuronale Transplantation verhindert. Eine mikrochirurgische Anastomose des Nervus recurrens kann innerhalb von 15 Minuten durchgeführt werden, wenn sie nach der Einarbeitung korrekt ausgeführt wird. Diese Techniken ebneten Forschern auf dem Gebiet der peripheren Nervenverletzungen den Weg, die zelluläre Transplantation in einem Rattenmodell zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen im Modell der wiederkehrenden Nervenverletzung transplantiert und die funktionelle Erholung der Stimmbänder mittels Elektromyographie, Labor-Endoskopie und histologischen Messungen bewertet.