Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, pathogene Hefen in Verbindung mit Wirtszellen zu quantifizieren, ohne koloniebildende Einheiten zu plattieren. Zuerst infizieren Sie die Makrophagenzellen mit H-Verkapselung oder C albicans-Hefezellen färben Sie die infizierten Makrophagenzellen mit Aine-Orange und Propidiumiodid, um lebensfähige Hefezellen hervorzuheben. Nehmen Sie dann mit einem bildgebenden Zytometer eine Reihe von Bildern auf und analysieren Sie die Größen- und Formparameter, um die Hefezellen genau zu zählen.

Ergebnisse aus der Bildzytometrie können effektiv genutzt werden, um pathogene Hefen in Verbindung mit Wirtszellen zu quantifizieren. Die Idee zu dieser Methode kam mir zum ersten Mal bei einer Forschung auf dem Gebiet der Pilzpathogenese, bei der ich zur Quantifizierung des pathogenen Pilzes Histoplasma-Kapsel immer wieder koloniebildende Einheiten plattieren und zählen musste. Der Hauptvorteil der Bildzytometrie gegenüber der Standardmethode der KBE-Zählung ist ihre erhöhte Geschwindigkeit, da sie die arbeits- und zeitintensiven Schritte des Plattierens, Inkubierens und Zählens mehrerer serieller KBE-Verdünnungen beim Vergleich des Wachstums von Wildtyp- und Mutantenstämmen innerhalb von Wirtszellen eliminiert.

Diese Methode eliminiert die potenzielle Verzerrung, die durch unterschiedliche Fähigkeiten zur Initiierung von Qualitätswachstum auf festen Medien entsteht. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, durch die Bildzytometrie herausgefordert werden. Instrumentierung und Software.

Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die Makrophagen in der gewünschten Dichte kultivieren. In 24-Well-Platten werden die Pilzzellen in der logarithmischen Phase zugegeben und dann 90 Minuten lang inkubiert, um eine Phagozytose zu ermöglichen. Als nächstes waschen Sie die Makrophagen dreimal mit PBS, um die extrazellulären Pilze zu entfernen, inkubieren für die experimentell definierten Zeitpunkte vor der Probenanalyse bei geringer Infektionsvielfalt, die infizierten Makrophagenzellen bleiben mehrere Tage lang lebensfähig und die Proben können etwa alle 12 bis 24 Stunden analysiert werden.

Geben Sie nach drei Wäschen mit PBS 0,5 Milliliter steriles Wasser zu den infizierten Makrophagenzellen. Inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Pilze von den Makrophagenzellen zu befreien. Ernten Sie dann das Lysat in ein steriles Röhrchen und bewahren Sie es auf Eis auf.

Übertragen Sie 20 Mikroliter des Lysats in ein separates Röhrchen. Fügen Sie 20 Mikroliter Ain-Orangenpropidiumiodid-Lösung für die sofortige bildzytometrische Analyse hinzu. Führen Sie eine zehnfache Verdünnung der Lysate in Medien durch.

Dann flättieren Sie 100 Mikroliter jeder Verdünnung in doppelter Ausführung. Auf HMM-Platten. Inkubieren Sie die Platten in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für sieben bis acht Tage.

Zählen Sie die Kolonien manuell auf den Tafeln, wobei mindestens 100 und maximal 1000 verschiedene Kolonien angezeigt werden. Um die lebenden Makrophagen zu sammeln, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Dann 0,5 Milliliter PBS hinzufügen und 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.

Entfernen Sie die Makrophagen durch schonendes Pipettieren aus den Gewebekulturvertiefungen. Füllen Sie die Flüssigkeit in ein steriles Röhrchen und lagern Sie sie auf Eis. Um das Beschleunigungsmessgerät einzurichten, setzen Sie die Fluoreszenzoptikmodule in das System ein und stellen Sie sicher, dass sie eingerastet sind.

Schalten Sie das Bildzytometer im Assay-Dropdown-Menü der Software ein. Wählen Sie den voreingestellten Assay-Typ und den Zelltyp aus, um die Durchführbarkeit zu gewährleisten. Der Assay ist für den Nachweis von Ain-Orange und Propidiumiodid zum Nachweis einer Candida albicans-Infektion optimiert.

Der Assay ist für den GFP-Nachweis optimiert. Öffnen Sie nun die Registerkarte Optionen und klicken Sie auf Hintergrundbild aufnehmen Nachdem der Vorgang abgeschlossen ist, klicken Sie auf Vorschau-Hellfeldbild für die A-OPI-Viabilitätsmessung. Mischen Sie 20 Mikroliter der Probe mit 20 Mikrolitern A OPI und pipettieren Sie sie in die Abrechnungskammer für die Infektionsrate von Candida albicans.

Mischen Sie die Probenvertiefung und pipettieren Sie sie direkt in die Zählkammer. Nachdem sich die Zellen in der Kammer niedergelassen haben, setzen Sie die Zählkammer zur Bildaufnahme in das Bildzytometer ein. Bringen Sie die Probe in den Fokus und klicken Sie dann auf Zählung.

Wenn der Bildaufnahmevorgang abgeschlossen ist, entfernen Sie die Einweg-Zählkammer und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß. Bei einer A-OPI-Messung werden die Konzentrations- und Viabilitätsergebnisse auf der Seite mit den Zählergebnissen angezeigt, um die Infektionsrate von Candida albicans zu bestimmen. Nachdem Sie die Zählergebnisse erhalten haben, klicken Sie auf Exportieren.

Senden Sie dann die Daten an FCS express four zur Zellpopulationsanalyse von GFP. Importieren Sie in FCS express die Datendatei und stellen Sie die Ergebnisse in einem Fluoreszenzhistogramm dar. Wenden Sie als Nächstes ein Zellpopulationstor auf das Histogramm an, um den Populationsanteil der mit Candida albicans infizierten Zellen zu bestimmen.

Dieses Experiment beobachtet das Wachstum von Makrophagenzellen, die mit hcaps Lotum-Hefe infiziert sind, zu definierten Zeitpunkten. Die Proben werden gefärbt und mittels bildbasierter Zytometrie analysiert. Die freigesetzten Hefezellen aus geschnürten Makrophagen werden von der Soter Vision Software identifiziert.

Hier ist die absolute Anzahl der nachgewiesenen Lebendhefen größer als die Anzahl der Hefen, die auf festem Medium zur Koloniebildung fähig sind. Diese Daten unterstreichen das Vorhandensein einer signifikanten Anzahl lebensfähiger, aber nicht kultivierbarer Zellen. Diese aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen wurden mit C-Albican-Hefezellen infiziert, die unter der Kontrolle des A DH-1-Promotors grün fluoreszierendes Protein exprimieren.

Eine Vielzahl von Infektionen im Bereich von 0,1 bis 10 führte zu einem inkrementellen Anstieg der GFP-Intensität bei infizierten Makrophagen sowie des Gesamtprozentsatzes der infizierten Makrophagen Nach der Beherrschung. Diese Technik kann in nur wenigen Minuten pro Probe durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Parameter so einzustellen, dass nur Pilzzellen, keine Wirtszellen, gezählt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Bildzytometrie zur Quantifizierung pathogener Hefen in Verbindung mit Wirtszellen verwenden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit pathogenen Pilzen extrem gefährlich sein kann, also tragen Sie persönliche Schutzausrüstung und befolgen Sie die ordnungsgemäßen Entsorgungsverfahren für biologisch gefährliche Abfälle.