Name: Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Lernen Sie die Bildzytometrie zur Quantifizierung pathogener Hefen in Makrophagen kennen. Diese Methode ersetzt zeitaufwändige KBE-Zählungen und beschleunigt die Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen erheblich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Die Infektion von Makrophagen mit H. capsulatum, C. albicans <ol><li> 16 Stunden vor der Infektion, Samen Makrophagen an gewünschten Dichte in 24-Well-Platten. In diesem Protokoll wurde eine Dichte von 3,0 x 10 5 Zellen / Vertiefung verwendet. </li><li> In Pilzzellen in log-Wachstumsphase bei einer gewünschten Multiplizität der Infektion (MOI). Dieses Protokoll bietet Platz für eine Reihe von MOI (0,2-5,0). Für die Infektion von Makrophagen mit RAW264.7 H. capsulatum, verwendeten wir eine MOI von 0,2. </li><li> Nach 1,5 Stunden für Phagozytose erlauben, waschen Makrophagen dreimal mit PBS an extrazelluläre Pilze zu entfernen. </li><li> Inkubieren gewünschte Anzahl von Stunden vor Probenanalyse. Bei niedrigen MOI (0.2 in unserem Experiment), bleiben infizierten Makrophagen für mehrere Tage lebensfähig, und die Proben können etwa alle 12-24 Stunden analysiert werden. </li></ol> 2. Makrophagen Lysis <ol><li> Um Pilze aus Makrophagen befreien, entfernen Medien, 3 x waschen mit PBS, und0,5 ml sterilem Wasser. Unter diesen Bedingungen wird Makrophagen lysieren und Pilzzellen bleiben erhalten. </li><li> Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur gerührt. </li><li> Übertragen Lysat sterilen Röhrchen, halten auf dem Eis. </li><li> Übertragen Sie 20 ul Lysat zu einem separaten Röhrchen, dann fügen Sie 20 ul AO / PI-Lösung. Gehen Sie direkt zu Schritt 5: &quot;Probenvorbereitung für Bild Cytometric Analysis&quot; </li></ol> 3. CFU Plating <ol><li> Führen zehnfache Verdünnung der Lysate (aus Schritt 2.3) in den Medien. </li><li> Platte 100 ul jeder Verdünnung in zweifacher Ausfertigung auf HMM-Agaroseplatten. Die Platten in einer feuchten Kammer bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 7-8 Tage. </li><li> Manuelles zählen Kolonien auf Platten Darstellung von mindestens 100 und maximal 1000 verschiedene Kolonien. </li></ol> 4. Visualization of Fungi innerhalb Live-Makrophagen <ol><li> Um Live-Makrophagen sammeln, waschen Sie die Zellen 3 mal mit PBS. 0,5 ml PBS und Inkubation für 30 min bei 4 ° C.</li><li> Um Makrophagen aus Gewebekulturvertiefungen entfernen, sanft und Abpipettieren mehrmals. Übertragen Flüssigkeit sterilen Röhrchen, halten auf dem Eis. </li><li> Übertragen Sie 20 ul Probe auf einem separaten Röhrchen, dann fügen Sie 20 ul AO / PI-Lösung. Gehen Sie direkt zu Schritt 5: &quot;Probenvorbereitung für Bild Cytometric Analysis&quot;. </li></ol> 5. Probenvorbereitung für Bild Cytometric Analysis <ol><li> Pipettieren Sie die Target-Probe gründlich und übertragen dann 20 ul Probe in die Zelle Einweg-Zählkammer. </li><li> Lassen Sie die Zellen in der Kammer für 30 Sekunden absetzen. </li><li> Legen Zählkammer in das Bild cytometer. </li></ol> 6. Cellometer Instrument Setup <ol><li> Legen Sie die Fluoreszenzoptik Module: VB-535 bis 402 und VB-660 bis 502 in das System und sicherstellen, dass sie an Ort und Stelle sind gesperrt. <ol><li> VB-535 bis 402 (Anregung bei 475 nm, Emission bei 535 nm) ist für Acridinorange und GFP-Erkennung verwendet. </li><li> VB-660 bis 502 (excitatiauf bei 540 nm wird die Emission bei 660 nm) für Propidiumiodid Detektion verwendet. </li></ol></li><li> Schalten Sie auf das Bild cytometer und öffnen die zugehörige Software. </li></ol> 7. Cellometer Software Setup <ol><li> Wählen Sie die Vorgabe &quot;Assay Type&quot; und &quot;Cell Type&quot; in der Assay Dropdown-Menü. <ol><li> Für Lebensfähigkeit wird der Assay für Acridinorange und Propidiumiodid Erkennung optimiert. </li><li> Für den Nachweis von Candida albicans-Infektion wird der Assay für GFP Erkennung optimiert. </li></ol></li><li> Wählen Sie &quot;Optionen&quot; auf der Oberseite und klicken Sie auf &quot;Take Background Image&quot;, und lassen Sie den Vorgang abgeschlossen ist. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Vorschau Hellfeldbild&quot;. </li></ol> 8. Image Acquisition Vorgehensweise <ol><li> Legen Sie die vorbereiteten Probe Kammer in das Bild cytometer. </li><li> Verwenden Sie den Fokus Knopf und stellen Sie den Fokus. </li><li> Einmal im Fokus, auf &quot;Count&quot; klicken, und lassen Sie die Bildaufnahme Vorgang abgeschlossen ist. </li><li> Remove die Einweg-Zählkammer und entsorgen. </li></ol> 9. Bild Datenanalyse <ol><li> Konzentration und Lebensfähigkeit Messung <ol><li> Sobald die Zählung abgeschlossen ist, werden die Konzentration und die Lebensfähigkeit der Zielzellen in der Ergebnis-Seite angezeigt. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Export&quot;, um die Daten in FCS Express 4 exportieren für Zellpopulation Analyse der GFP in der Candida albicans-Infektion Experiment. </li></ol></li><li> FCS Express Analyse von Candida albicans-infizierten Zellen <ol><li> Importieren Sie die &quot;. NXDAT&quot; Datei in FCS Express 4 und dann das Ergebnis in einem Fluoreszenz-Histogramm. </li><li> Bewerben Zellpopulation Tor zum Histogramm, um die Bevölkerung Prozentsätze der Candida albicans-infizierten Zellen zu bestimmen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Vet.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li>
<li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li>
<li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+yeast%3A+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li>
<li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li>
<li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis%2C+mitochondrial+potential%2C+and+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li>
<li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li>
<li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micro.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1%2C+a+conserved+transcriptional+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li>
<li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li>
</ol>

Die Autoren Leo Li-Ying Chan und Benjamin Paradis sind Mitarbeiter von Nexcelom Bioscience LLC.

Bildzytometrie ermöglicht es dem Benutzer, um qualitativ hochwertige Bilder zu erfassen und mit spezieller Software, führen Sie eine schnelle Quantifizierung von Zellen. Eine mögliche Herausforderung für die Annahme Bildzytometrie im Bereich der mikrobiellen Pathogenese ist, dass die Mikroorganismen zu zählen, die in einer gemischten Population von Zellen, einschließlich Säuger-Wirtszellen sind. Hier zeigen wir, dass Bildzytometrie zur Quantifizierung von lebensfähigen pathogenen Hefen während der in vitro-Makrophag...

Studien von pathogenen Pilzen in Verbindung mit ihren Gastgebern und / oder Wirtszellen erfordern oft Quantifizierung der lebensfähigen Pilzzellen über einen Zeitverlauf oder unter verschiedenen Bedingungen Infektion. Zählung der koloniebildenden Einheiten (CFU) der Standard-Methode, durch die die Zahl der lebensfähigen Pilzzellen gemessen wurde, jedoch hat dieses Verfahren einige Nachteile und Einschränkungen. Erstens sind viele Pilzarten langsam wachsende. Das Wachstum der sichtbaren Kolonien auf festen Medien kann 1-2 Wochen, deutlich verlangsamt das Tempo der Forschung. Zweitens ist Manipulation von Proben während der CFU Beschichtung ein langwieriger Prozess, da mehrere Verdünnungen müssen beschichtet, um eine zählbare Anzahl der Kolonien zu gewährleisten. Drittens, ist die Anzahl der CFU typischerweise geringer als die Zahl von lebensfähigen Organismen, weil die Beschichtung überzogen Wirkungsgrad deutlich unter 100%. Zum Beispiel kann Plattieren Wirkungsgrade für die dimorphic Pilzpathogen Histoplasma capsulatum so hoch wie 90%, aber routinemäßig so niedrig wie30% und sogar noch niedriger (10%) für die entsprechende Pilz dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Plating Effizienz für Candida albicans ist auch Gegenstand Variabilität 3. Schließlich entfallen CFU Analyse für nur leben und sich aktiv teilenden Zellen, die zur Festlegung Wachstum auf festen Medien, wobei in vielen Situationen, wäre es nützlich, um die Anwesenheit und Konzentration von toten und / oder metabolisch inaktiven Zellen zu bestimmen. Zuvor hat durchflusszytometrischen Methoden zur Quantifizierung von mehreren pathogenen Pilzarten wurden 4-6 beschrieben. Doch aufgrund Biosicherheit Containment Probleme bei der Verwendung Sicherheitsstufe 2 (BSL2) oder BSL3-Level Krankheitserreger auf gemeinsamen Durchflusszytometern beteiligt hat Annahme dieser Technik beschränkt. Wie Durchflusszytometrie ist Bildzytometrie eine sensible und schnelle Methode der Zelle Quantifizierung. Allerdings kann Bildzytometrie zu einem Bruchteil der Kosten mit vergleichbaren Ergebnissen 7 durchgeführt werden -11. Hier beschreiben wir Verfahren zur Durchführung Bildzytometrie von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen. Wir demonstrieren unsere Methoden mit zwei menschlichen Pilzpathogene: Histoplasma capsulatum und Candida albicans H.. capsulatum ist ein dimorphic Pilzpathogen, die Erkrankung der Atemwege verursacht, in den Menschen, es wächst wie Bäckerhefe und repliziert in Alveolarmakrophagen Candida albicans ist ein Mensch kommensalen Arten, die gelegentlich verursacht Candidiasis.. Wir zeigen, dass Bildzytometrie schnelle Quantifizierung dieser Hefen ermöglicht, zusammen mit Visualisierungsmöglichkeiten.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI-Lösung</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CSK-0102</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Zählkammer</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Software</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung bildzytometrie zur quantifizierung von pathogenen pilzen in verbindung mit wirtszellen

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Untersuchungen der zellulären Pathogenese pathogener Hefen wie Candida albicans, Histoplasma capsulatum und Cryptococcus neoformans verwenden üblicherweise Infektion von Säugetier-Hosts oder Wirtszellen (zB Makrophagen) durch Hefe Quantifizierung mittels koloniebildende Einheit Analyse oder Durchflusszytometrie gefolgt. Während koloniebildende Einheit Aufzählung ist das am häufigsten verwendete Verfahren auf dem Gebiet hat diese Technik Nachteile und Beschränkungen, einschließlich der langsamen Wachstum einiger Pilzarten auf festen Medien und nieder-und / oder variable Beschichtung Wirkungsgrade, die von besonderer Bedeutung ist bei einem Vergleich Wachstum von Wildtyp-und Mutanten. Durchflusszytometrie können schnelle quantitative Informationen über Hefelebensfähigkeit bieten hat jedoch Verabschiedung durchflusszytometrischen Nachweis für pathogene Hefen für eine Reihe von praktischen Gründen, einschließlich seiner hohen Kosten und die biologische Sicherheit Überlegungen beschränkt. Hier zeigen wir eine bildbasiertecytometric Methodik mit der Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) für die Quantifizierung von lebensfähigen pathogenen Hefen in Co-Kultur mit Makrophagen. Histoplasma capsulatum und Candida albicans H.:. Unsere Studien auf dem Nachweis von zwei menschlichen Pilzpathogene konzentrieren capsulatum kolonisiert Alveolarmakrophagen durch die Replikation innerhalb der Makrophagen phagosome, und hier haben wir quantitativ das Wachstum von H. capsulatum Hefen in RAW 264.7 Makrophagen mit Acridinorange / Propidiumiodidfärbung in Kombination mit Bildzytometrie. Unsere Methode treu rekapituliert Wachstumstrends wie durch traditionelle Kolonie bildende Einheit Aufzählung gemessen, aber mit deutlich erhöhter Empfindlichkeit. Zusätzlich haben wir direkt beurteilen Infektion von lebenden Makrophagen mit einem GFP-exprimierenden Stamm von C. albicans. Unsere Methodik bietet eine schnelle, genaue und kostengünstige Mittel zur Detektion und Quantifizierung von wichtigen menschlichen pilzliche Erreger in Verbindung with Wirtszellen.

Wir nutzten die Cellometer Bild Anblick cytometer um das Wachstum von H. überwachen capsulatum in Makrophagen. RAW 264.7 Zellen wurden mit H. infiziert capsulatum Hefezellen und zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben AO / PI-Färbung von bildbasierten durchflusszytometrische Analyse, unterzogen. Parallel dazu wurden Proben von traditionellen CFU Aufzählung analysiert. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Proben in Wasser inkubiert, um Makrophagen zu lysieren und die freigesetzte Hefezelle...

Hier zeigen wir, wie Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen in der Kultur verwendet werden. Diese Technik kann als Alternative zu CFU Aufzählung verwendet werden.

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, pathogene Hefen in Verbindung mit Wirtszellen zu quantifizieren, ohne koloniebildende Einheiten auszuplatzieren. Zunächst infizieren Sie die Makrophagenzellen mit H-Kapselung oder C albicans-Hefezellen und färben die infizierten Makrophagenzellen mit Aine Orange und Propidiumiodid, um lebensfähige Hefezellen hervorzuheben. Anschließend erfassen Sie mithilfe eines Bildgebungszytometers eine Reihe von Bildern und analysieren Größen- und Formparameter, um die Hefezellen genau zu zählen.Ergebnisse der Bildzytometrie können effektiv zur Quantifizierung pathogener Hefen in Verbindung mit Wirtszellen verwendet werden. Die Idee zu dieser Methode kam mir erstmals während meiner Forschung im Bereich der Pilzpathogenese, bei der ich wiederholt Kolonie-bildende Einheiten ausplattieren und zählen musste, um den pathogenen Pilz Histoplasma capsulatum zu quantifizieren. Der Hauptvorteil der Bildzytometrie gegenüber der Standardmethode der CFU-Zählung liegt in der erhöhten Geschwindigkeit, da zeitaufwändige und arbeitsintensive Schritte wie das Ausplattieren, Inkubieren und Zählen mehrerer serieller Verdünnungen von CFUs entfallen, wenn das W

use-image-cytometry-for-quantification-pathogenic-fungi-association

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine Methode zur Quantifizierung der Phagozytose von FITC-markierten pathogenen Pilzsporen durch menschliche Leukozyten. Phagozytierte Sporen werden durch Gegenfärbung von zelladhärenten Sporen unterschieden, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Analyse.

Quantitative durchflusszytometrische Messung der Pilzsporen-Phagozytose durch humane Phagozyten

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Hier beschreiben wir ein Protokoll Anti - Pilz - Aktivität von primären humanen Immunzellen in Echtzeit zu bewerten unter Verwendung von fluoreszierendem Aspergillus Reportern Konidien in Verbindung mit Live-Zell - Videomikroskopie und Durchflusszytometrie. Erzeugten Daten geben einen Einblick in die Wirts zell- Aspergillus Wechselwirkungen wie fungizide Aktivität, Phagozytose, Zellmigration und Hemmung des Pilzwachstums.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur pulmonalen Pilz Belastung bei Mäusen mit invasiver Aspergillose durch Quantifizierung der Gomoris modifizierten Methanamine Silber Färbung in histologischen Abschnitte bestimmen. Verwendung dieser Methode führte zu vergleichbaren Ergebnissen mit weniger Tiere im Vergleich zu Bewertung der Pilzinfektionen Belastung durch quantitative PCR der Lunge Pilz DNA.

Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen

Wir beschreiben ein Protokoll, das fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet, um mehrere herpesvirale RNAs in lytisch infizierten menschlichen Zellen zu visualisieren, entweder in Suspension oder anhaftend. Dieses Protokoll enthält die Quantifizierung der Fluoreszenz, die ein nukleozytoplasmatisches Verhältnis erzeugt, und kann für die gleichzeitige Visualisierung von Wirts- und viralen Proteinen mit Immunfluoreszenz (IF) erweitert werden.

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Der Zweck dieses Protokolls ist es, Candida albicans Zellform und Lokalisation im Magen-Darm-Trakt des Säugetiers zu visualisieren.

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur quantitativen Messung der Phagozytose der Aspergillus fumigatus conidia durch menschliche primäre Phagozyten mittels Durchflusszytometrie und zur Unterscheidung der Phagozytose der Conidia von der bloßen Adhäsion zu Leukozyten.

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Vitale Fluoreszenzfarbstoffe sind wesentliche Werkzeuge für livezellbildende Analysen in der modernen Pilzzellbiologie. Dieses Papier beschreibt die Anwendung etablierter und weniger bekannter Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfolgung der Plasmamembrandynamik, Endo-/Exozytose und Zellwandmorphogenese in fadenförmigen Pilzen.

Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für die Live-Zell-Bildgebung von filamentösen Pilzen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um das Zusammenspiel zwischen Wirt und Erreger während der Infektion durch Massenspektrometrie-basierte Proteomik zu profilieren. Dieses Protokoll verwendet die etikettenfreie Quantifizierung, um Veränderungen in der Proteinmenge sowohl von Wirten (z. B. Makrophagen) als auch von Erregern (z. B. Cryptococcus neoformans) in einem einzigen Experiment zu messen.

Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

Wir stellen eine Methode vor, die einen generalisierbaren flächenbasierten Bildanalyseansatz verwendet, um Zellzahlen zu identifizieren. Die Analyse verschiedener Zellpopulationen nutzte die signifikanten Zellhöhen- und Strukturunterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines adaptiven Algorithmus.

Area-based Image Analysis Algorithm zur Quantifizierung von Makrophagen-Fibroblasten-Kokulturen

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum Screening mittelgroßer Candida albicans-Mutantenbibliotheken auf Morphogenesephänotypen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt mittels nicht-invasiver konfokaler Mikroskopie.

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt

Lernen Sie die Bildzytometrie zur Quantifizierung pathogener Hefen in Makrophagen kennen. Diese Methode ersetzt zeitaufwändige KBE-Zählungen und beschleunigt die Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen erheblich.

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Weitere Videos entdecken